PDX-1基因转染人脂肪间充质干细胞向胰岛样细胞分化及移植治疗1型糖尿病

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.016

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (13): 2062-2067.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.016

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PDX-1基因转染人脂肪间充质干细胞向胰岛样细胞分化及移植治疗1型糖尿病

史光军¹，白国立²，谭雪莹¹，朱继军²，许评¹

¹青岛市市立医院肝胆外科，山东省青岛市 266000；²青岛大学医学院，山东省青岛市 266000

修回日期:2016-12-11 出版日期:2017-05-08 发布日期:2017-06-09
通讯作者: 许评，主任医师，教授，博士后导师，青岛市市立医院肝胆外科，山东省青岛市 266000
作者简介:史光军，男，1966年生，山东省潍坊市人，汉族，2005年华中科技大学同济医学院毕业，博士，主任医师，硕士生导师，主要从事肝胆胰脾疾病与干细胞的研究。
基金资助:
山东省医药卫生科技发展计划(2014WS0217)

PDX-1 transfected human adipose-derived mesenchymal stem cells: differentiation into islet-like cells and treatment of type 1 diabetes via cell transplantation

Shi Guang-jun¹, Bai Guo-li², Tan Xue-ying¹, Zhu Ji-jun², Xu Ping¹

¹Department of Hepatobiliary Surgery, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266000, Shandong Province, China; ²Qingdao University Medical College, Qingdao 266000, Shandong Province, China

Revised:2016-12-11 Online:2017-05-08 Published:2017-06-09
Contact: Xu Ping, Chief physician, Professor, Department of Hepatobiliary Surgery, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266000, Shandong Province, China
About author:Shi Guang-jun, M.D., Chief physician, Master’s supervisor, Department of Hepatobiliary Surgery, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266000, Shandong Province, China
Supported by:
the Medicine & Health Development Plan of Shandong Province, No. 2014WS0217

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
胰十二指肠同源盒基因1：为一种在胰腺发育中起重要作用的特异性转录因子，对于胰腺的早期发育及晚期的增生分化均发挥着重要作用，并且对维持胰腺β细胞的功能也有重要作用。
腺病毒(Adenovirus，Ad)：是一种无包膜的线状双链 DNA 病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。腺病毒拥有近 50 个血清型，大多数腺病毒载体都是基于血清型2和血清型5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具，功能强大并易于操作。

摘要
背景：近年研究发现脂肪间充质干细胞不仅具有多向分化潜能，在血糖平衡及激素产生方面也具有重要作用。
目的：观察PDX-1基因转染脂肪间充质干细胞向胰岛样细胞的分化能力及移植后对糖尿病大鼠的治疗效果。
方法：采用腺病毒转染方法将PDX-1基因转入人脂肪间充质干细胞，双硫腙染色鉴定细胞分化情况，ELISA法检测细胞胰岛素分泌水平。从20只雄性SD大鼠中随机取4只作为对照组，注射生理盐水，其余16只按65 mg/kg 的剂量注射链脲霉素建立糖尿病模型，再随机等分为移植组和糖尿病组，移植组大鼠尾静脉注射PDX-1基因转染脂肪间充质干细胞。
结果与结论：①转染后15 d，转染组胰岛素阳性细胞数量、胰岛素分泌量均高于未转染组(P < 0.05)；②移植组大鼠空腹血糖水平显著下降(P < 0.05)，体质量明显增加(P < 0.05)，而糖尿病大鼠空腹血糖维持在较高水平，且体质量显著下降；③结果提示，导入PDX-1基因对人脂肪间充质干细胞分化为胰岛样细胞具有促进作用，PDX-1转染脂肪间充质干细胞移植能有效治疗大鼠糖尿病，但具体机制尚待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-6926-2354(史光军)

关键词: 干细胞, 移植, 脂肪间充质干细胞, 胰十二指肠同源盒基因1, 腺病毒, 基因转染, 胰岛样细胞, 糖尿病, 血糖, 体质量

Abstract:

BACKGROUND: Recent studies have shown that adipose-derived mesenchymal stem cells (ADMSCs) not
only have multilineage differentiation potential, but also exert an important role in blood sugar balance and hormone production.
OBJECTIVE: To observe the differentiation potential of human ADMSCs (hADMSCs) into functional islet-like cells and the therapeutic effect of hADMSCs transplantation in diabetic rats.
METHODS: PDX-1 gene was transfected into hADMSCs by adenovirus. Cell differentiation and insulin secretion were identified and detected by dithizone staining and ELISA, respectively. Twenty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group (n=4), diabetes group (n=8) and transplantation group (n=8). Rats in the latter two groups were subjected to making diabetic models by 65 mg/kg streptozotocin injection. Afterwards, rats in the transplantation group were given PDX-1 transfected ADMSCs via the tail vein.
RESULTS AND CONCLUSION: At 15 days after transfection, the number of insulin positive cells and insulin secretion were both increased significantly (P < 0.05). Fasting glucose levels in the transplantation group decreased significantly (P < 0.05), while the body weight increased significantly (P < 0.05). In the diabetic group, the fasting glucose level still maintained at a high level, and the body weight of rats was significantly decreased. These results implicated that PDX-1 gene could induce hADMSCs differentiating into functional islet-like cells. PDX-1 transfected ADMSCs transplantation is effective in treating diabetic rats, but the mechanism needs further study.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Genes, Homeobox, Diabetes Mellitus, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

史光军，白国立，谭雪莹，朱继军，许评. PDX-1基因转染人脂肪间充质干细胞向胰岛样细胞分化及移植治疗1型糖尿病[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(13): 2062-2067.

Shi Guang-jun, Bai Guo-li, Tan Xue-ying, Zhu Ji-jun, Xu Ping . PDX-1 transfected human adipose-derived mesenchymal stem cells: differentiation into islet-like cells and treatment of type 1 diabetes via cell transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(13): 2062-2067.

图/表（结果） 2

2.1 脂肪间充质干细胞的培养与鉴定结果 接种24 h之后换液去除非贴壁细胞；两三天可见细胞形态改变，较均一，成纤维细胞样生长，细胞生长有极性，融合后呈螺旋状(图1)。

流式细胞术检测脂肪间充质干细胞高表达分子表型CD29，CD73，CD49d，CD90，低表达分子表型CD14，CD45，CD34，HLA-DR(图2)。脂肪间充质干细胞成脂肪诱导2周后油红O染色阳性，证明其成脂分化能力(图3A)；脂肪间充质干细胞成骨诱导2周后碱性磷酸酶染色呈强阳性反应，证明其成骨分化能力(图3B)。

2.2 转染后细胞PDX-1的表达 脂肪间充质干细胞在感染PDX-1 48 h后Western blot法和免疫荧光法均可检测到PDX-1的表达，对照组无PDX-1的表达，且病毒感染后 15 d，仍能检测到PDX-1的表达(图4，5)。

2.3 双硫腙染色结果 对转染后细胞进行双硫腙染色，对照组未出现胰岛素阳性细胞，实验组出现双硫腙阳性细胞且被染成棕红色(图6)。

2.4 细胞胰岛素分泌水平 转染组和对照组细胞在低糖环境下分泌的胰岛素量差异无显著性意义(P > 0.05)，而在高糖环境下分泌的胰岛素量两组之间差异有显著性意义 (P < 0.05)，对照组细胞在刺激前后分泌的胰岛素量差异无显著性意义(表1)。

2.5 PDX-1转染脂肪间充质干细胞移植对糖尿病大鼠空腹血糖的影响 大鼠注射链脲佐菌素48 h后，与对照组相比，模型组大鼠空腹血糖明显增加(P < 0.05)，且明显高于正常值；给药后2周，大鼠空腹血糖仍维持在较高水平，且高于对照组(P < 0.05)，见表2。糖尿病大鼠细胞移植后空腹血糖逐渐下降，14 d时空腹血糖水平明显低于糖尿病组(P < 0.05)。糖尿病组大鼠空腹血糖维持较高水平，未见明显变化，见表3。

2.6 PDX-1转染脂肪间充质干细胞移植对糖尿病大鼠体质量的影响 细胞移植后，移植组大鼠体质量逐渐增加，14 d时大鼠体质量明显高于糖尿病组(P < 0.05)，而糖尿病组大鼠体质量持续下降，见表4。

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引言

对1型糖尿病患者来说，胰岛移植是目前很好的替代治疗方法之一，胰岛移植具有相对安全、不良反应少等优势^[1]。虽然最近几年，临床胰岛移植研究取得了突破性的进展，但人们在移植部位、能否脱离外源性胰岛素控制和提高移植胰岛细胞的存活率等方面仍然面临着种种问题。近几年来，利用干细胞移植技术来克服胰岛短缺的问题成为人们研究的焦点，将具有某种特定功能的细胞移植到体内相应的受损部位，不仅避免了传统药物治疗引起的毒副作用，而且可以恢复受损器官部分功能^[2]。

脂肪间充质干细胞与骨髓间充质干细胞拥有相类似的细胞表型，均为CD73⁺、CD90⁺、CD105⁺、CD45^-、CD34^-^[3]。脂肪间充质干细胞具有多向分化潜能，在特定的诱导培养条件下可向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞及神经细胞等组织细胞定向分化，甚至可将其定向诱导为心肌细胞、角膜细胞等^[4-5]，而且脂肪组织来源丰富，可反复取材，较少涉及医学伦理学问题^[6]。

PDX-1即胰十二指肠同源盒基因1(pancreatic and duodenal homeobox factor-1, PDX-1)，作为一种在胰腺发育中起重要作用的特异性转录因子，对于胰腺的早期发育及晚期的增生分化均发挥着重要作用，并且对维持胰腺β细胞的功能也有着重要作用。PDX-1能调节与胰岛β细胞功能相关的基因表达，将PDX-1基因转染某些非胰岛β细胞(如骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、肝细胞)后，这些细胞均可以产生胰岛素^[7-8]。通过转染PDX-1基因促进人脂肪间充质干细胞转化的研究尚未有报道。干细胞对降低血糖、改善临床症状及并发症已取得较好的疗效。目前，医学界对脂肪间充质干细胞应用于糖尿病治疗工作尚处于探索阶段，有不少问题尚需进一步解决。实验观察PDX-1基因转染人脂肪间充质干细胞向胰岛样细胞的分化能力及移植治疗糖尿病的效果。

材料方法

1.1 设计 细胞-基因学体外实验及随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2015年1至12月在青岛市市立医院卫生部细胞移植实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 动物 清洁级雄性SD大鼠20只，4周龄，体质量为160-180 g，购自青岛市即墨动物中心。将动物置于18-25 ℃、12-12 h昼夜循环光照条件下喂养，自由摄食与饮水，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学委员会制订的标准。

1.3.2 脂肪组织 脂肪来源于青岛市市立医院肝胆外科35-50岁胆石症(无其他合并疾病)肥胖女性择期开腹手术患者，患者及家属均知情同意，研究通过院内伦理委员会批准。

1.3.3 主要试剂和仪器 Ⅰ型胶原酶、双硫腙、链脲佐菌素(美国Sigma公司)；DMEM/F12、DMEM-低糖和DMEM-高糖培养液(美国HyClone公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；40 g/L多聚甲醛、Triton X-100、胰蛋白酶抑制剂(北京Solarbio公司)；胰蛋白酶、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(江苏碧云天生物科技研究所)；人胰岛素ELISA检测试剂盒(武汉博士德生物公司)；兔抗人CD29，CD73，CD49d，CD90，CD14，CD45，CD34，HLA-DR，PDX-1抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)；倒置相差显微镜(日本Nikon公司)；流式细胞仪(美国BectonDickinson公司)；荧光显微镜及彩色照相系统(上海豫光仪器有限公司)；酶标仪(美国Thermo公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 脂肪间充质干细胞的培养 实验用脂肪取自肝胆外科手术患者，无菌条件获得腹部脂肪组织，在含双抗的1×PBS中浸泡5 min并清洗5次，然后用无菌眼科剪剔除筋膜及小血管，剪碎至糊状，移入50 mL离心管内，加入2倍于脂肪组织体积的0.15%Ⅰ型胶原酶，37 ℃水浴振荡消化45 min，待管内液体消化至均匀乳白色液体时，1 500 r/min离心10 min，去除上层未消化的脂肪组织，加入等体积DMEM/F12培养液(含体积分数为10%胎牛血清)终止消化并混匀，无菌200目细胞筛网过滤，滤液在室温条件下再次离心(1 500 r/min 10 min)，弃去上层杂质，底层沉淀用DMEM/F12培养液(含体积分数为10%胎牛血清)重悬后，接种于25 cm²细胞培养瓶，放入细胞培养箱(37 ℃，体积分数为15%CO₂)中培养。待24-36 h后，在倒置显微镜下观察细胞生长情况，细胞生长达到80%-90%融合时，用胰蛋白酶消化法按1︰2比例进行细胞传代。细胞传代过程中，倒置显微镜下观察细胞生长情况并记录。

1.4.2 脂肪间充质干细胞的鉴定 使用CD29，CD73，CD49d，CD90为脂肪干细胞的阳性指标，CD14，CD45，CD34，HLA-DR为阴性指标单抗标记脂肪间充质干细胞，流式细胞仪检测其纯度。脂肪间充质干细胞成脂肪诱导2周后对其进行油红O染色，成骨诱导2周后对其进行碱性磷酸酶染色。

1.4.3 携带PDX-1基因的腺病毒制备 携带PDX-1基因的腺病毒由山东维真生物科技有限公司暨美国ViGene Biosciences公司中国办事处合成：pdx-1基因由NM 00029基因序列克隆至pAD-Amp载体，腺病毒对其包装，载体C端带有His，Flag标签。研究选用的腺病毒载体为人类血清5型腺病毒。

1.4.4 重组腺病毒对脂肪间充质干细胞的转染 将状态良好的第3代脂肪间充质干细胞接种到6孔板，保证第2天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%-70%之间。感染前，吸去细胞原有培养基，加入完全培养基，将病毒液按MOI=50加入细胞中，轻轻混匀后放入培养箱，培养4 h后吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液，继续37 ℃培养48 h，收获感染后细胞通过Western blot和免疫荧光法来检测转染PDX-1基因的表达。

1.4.5 Western blot检测转染细胞PDX-1的表达 留取转染组、未转染组贴壁生长的细胞应用PBS冲洗2次，将细胞移至EP管中，1 500 r/min离心5 min，弃上清液，加入蛋白裂解液裂解细胞，取50 μL 蛋白液与10 μL 5×上样缓冲液混合，100 ℃变性10 min(以上每步均在冰袋上操作)。提取蛋白样品，8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，兔抗人单克隆抗体作为一抗(1︰800)孵育4 ℃过夜，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG作为二抗(1︰1 000)孵育2 h，化学曝光显影，β-actin做内参，测定转染后PDX-1的表达。

1.4.6 免疫荧光染色方法检测转染细胞PDX-1的表达 首先用40 g/L多聚甲醛室温固定细胞20 min，然后用1%TritonX-100穿透细胞45 min，再用5%BSA封闭40 min；滴加兔抗人的PDX-1单克隆抗体(1︰400)，4 ℃过夜；滴加FITC标记荧光抗体(山羊抗兔，1︰200)，避光室温孵育1.5 h；每步操作前均用1×PBS冲洗3遍，10 min/次。将细胞置于荧光显微镜下，相应荧光激发，观察细胞染色情况并记录。

1.4.7 双硫腙(DTZ)染色 将转染诱导后15 d的细胞用D-Hank’s缓冲液冲洗2遍，加入1 mL D-Hank’s缓冲液及 10 μL双硫腙贮存液，37 ℃孵育30 min，于倒置显微镜下观察细胞着色情况并记录。

1.4.8 ELISA法检测细胞胰岛素分泌水平 细胞转染诱导结束后15 d，用1×PBS缓慢冲洗2遍，先用浓度5.5 mmol/L低糖DMEM培养基，37 ℃温箱孵育1 h，吸出培养液备用；1×PBS缓慢冲洗2次，再加入浓度 25.0 mmol/L高糖DMEM培养基，37 ℃温箱孵育1 h，吸出培养液备用。取细胞培养液，用ELISA法测定培养液中的胰岛素含量。

1.4.9 实验动物分组 20只SD大鼠中取4只作为对照组，其余16只建立糖尿病模型。造模成功后，大鼠随机等分为移植组和糖尿病组，移植组大鼠移植脂肪间充质干细胞。

1.4.10 糖尿病大鼠模型的建立 大鼠禁食24 h，一次性腹腔注射溶于枸橼酸缓冲液(pH 4.0)的链脲佐菌素(65 mg/kg)，48 h后测量随机血糖，血糖浓度超过16.8 mmol/L时为糖尿病模型制备成功。

1.4.11 脂肪间充质干细胞移植 移植组大鼠造模成功后立即通过尾静脉注入1 mL转染诱导后脂肪间充质干细胞(细胞浓度为1.5×10⁹ L^-¹)，移植后定时测量大鼠空腹血糖及体质量。

1.5 主要观察指标 ①脂肪间充质干细胞的培养与鉴定结果；②Western blot和荧光显微镜观察转染后细胞PDX-1基因表达；③双硫腙染色结果；④ELISA法检测细胞胰岛素分泌水平；⑤移植后大鼠血糖及体质量的变化。

1.6 统计学分析 实验数据使用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，数据以x(_)±s表示，两组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

1型糖尿病主要是由于胰岛β细胞被破坏导致胰岛素绝对缺乏引起^[9-10]。研究表明，1型糖尿病发病机制为自身体内的CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞共同参与自身抗原耐受破坏，引起选择性胰岛细胞破坏和功能衰竭，最终导致胰岛素分泌不足，引起糖尿病症状。胰岛素治疗已成为治疗当前1型糖尿病的主要方式，虽然它能稳定患者的血糖状态改善生活质量，但并不能延缓糖尿病并发症的发生。所以，1型糖尿病的细胞替代治疗方法越来越受到重视。

脂肪间充质干细胞因含量丰富，易于分离，而受到广泛关注^[11]。近年研究发现脂肪间充质干细胞不仅具有多向分化潜能，在血糖平衡及激素产生方面也具有重要作用^[12]，在治疗糖尿病方面的研究也越来越多。有报道显示脂肪间充质干细胞与骨髓间充质干细胞相比能更好的被诱导为胰岛样细胞^[13]，是胰岛素分泌细胞来源的理想选择。实验选择Ⅰ型胶原酶消化法，成功从脂肪中获取高纯度的脂肪间充质干细胞。PDX-1基因是胰腺发育和胰腺前体细胞分化为β细胞的主要调控因子，胚胎发育早期，PDX-1在内分泌细胞和外分泌细胞中均有表达，其能诱导内胚层向胰腺定向发育和成熟，活化后可促进β细胞中重要基因的表达以及维持β细胞的正常功能，随着胰腺的发育，PDX-1最终仅限于在β细胞内表达^[14-16]。干细胞分化为胰岛素细胞的原理是启动干细胞PDX-1基因的表达^[17]，从而表达更多胰岛细胞特异性基因，使干细胞功能和形态发生改变^[18]。已有研究显示，小鼠脂肪干细胞过表达PDX-1，能够诱导其表达出胰腺特定转录因子Ngn3、Nkx2-2、insulin 1^[19-21]。

重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具，首先，它能够感染包括分裂、非分裂细胞和干细胞在内的多种细胞；第二，病毒滴度高；第三，高滴度的病毒可获得高感染率和高表达量；第四，病毒进入细胞后，病毒基因组不整合到细胞染色体上。由于腺病毒的独特特征而倍受研究者喜爱。在实验操作过程中，也需要更多的预防措施，以保证腺病毒的安全性和转染效率。研究采用最广泛的复制缺陷型的人类血清5型腺病毒。用携带PDX-1基因的腺病毒感染脂肪间充质干细胞48 h后，通过Western blot和免疫荧光法证实腺病毒对脂肪间充质干细胞具有很高的感染能力。胰岛细胞中含有丰富的锌离子，而双硫腙是一种锌鏊合剂，所以是鉴定胰岛细胞的特异性染色方法。转染后15 d细胞在倒置显微镜下可见胰岛样细胞团，用双硫腙染色呈棕红色。ELISA法结果提示转染PDX-1后脂肪间充质干细胞分化为胰岛素阳性细胞的比例明显增高，提示PDX-1能显著促进脂肪间充质干细胞体外分化为胰岛样细胞，与Grapin-Botton等^[22]和Feber 等^[23-25]分别利用PDX-1基因诱导肝细胞、小肠上皮细胞及脂肪间充质干细胞分化为胰岛样细胞的结果相似。

有研究显示，给予糖尿病患者移植干细胞可有效改善糖尿病末期患者肾脏功能，提高患者存活率^[26-27]。大鼠注射链脲霉素48 h后与对照组相比，模型组大鼠空腹血糖明显增加，故大鼠造模成功，移植组大鼠给予PDX-1转染脂肪间充质干细胞，大鼠空腹血糖逐渐下降，2周时空腹血糖水平仍明显低于糖尿病组。而糖尿病组大鼠空腹血糖维持较高水平，无明显变化。移植PDX-1转染脂肪间充质干细胞的大鼠体质量逐渐增加，2周时大鼠体质量明显高于糖尿病组，而糖尿病组大鼠体质量持续下降。实验结果提示PDX-1转染脂肪间充质干细胞移植可以有效降低糖尿病大鼠血糖，这对人类应用脂肪间充质干细胞治疗糖尿病而言具有重要借鉴意义。但是腺病毒携带PDX-1转染脂肪间充质干细胞在大鼠体内定位情况、对大鼠的毒副作用以及治疗糖尿病的分子机制尚需进一步实验证实。

综上所述，人类脂肪组织来源的间充质干细胞容易获得，通过腺病毒携带PDX-1基因转染人脂肪间充质干细胞的方式，能够诱导其向胰岛样细胞方向分化，用脂肪干细胞衍生来源的胰岛素细胞进行细胞替代疗法，在未来1型糖尿病治疗方面具有广阔的研究前景和应用价值。

PDX-1基因转染人脂肪间充质干细胞向胰岛样细胞分化及移植治疗1型糖尿病

PDX-1 transfected human adipose-derived mesenchymal stem cells: differentiation into islet-like cells and treatment of type 1 diabetes via cell transplantation

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