神经干细胞移植脑缺血模型大鼠神经细胞凋亡、分化及神经行为学的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.011

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
神经干细胞：是中枢神经系统中，来源于神经组织或能分化为神经组织，具有自我更新能力和多向分化潜能的一类多能性干细胞，可以定向分化成为成熟的神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。近年来，神经干细胞在中枢神经系统损伤及神经系统退行性疾病中的研究成为了研究热点。
神经干细胞移植：是将神经干细胞移植到患者或者实验动物体内，使神经干细胞向神经系统病变部位趋行、聚集，并存活、增殖、分化为神经元细胞和/或胶质细胞，从而促进宿主缺失功能的部分恢复的一种技术。

摘要
背景：近年来，神经干细胞移植已成为治疗脑缺血等脑损伤性疾病的研究热点，但机制尚未完全阐明。
目的：观察神经干细胞移植治疗脑缺血大鼠对其神经细胞凋亡、分化及神经行为的影响。
方法：90只脑缺血模型造模成功SD大鼠随机分为3组，其中模型组30只、磷酸盐缓冲液组(注射磷酸盐缓冲液)30只、神经干细胞组(移植神经干细胞)30只；假手术组30只仅在麻醉状态下分离暴露血管，不进行阻断血流的操作；对照组30只不进行任何操作。对比各组大鼠在造模后第3，7，14天的神经功能评分、脑梗死体积、神经细胞凋亡数、Brdu/NeuN及Brdu/GFAP的表达差异。
结果与结论：①造模后第7，14天，神经干细胞组大鼠的神经缺损症状评分、脑梗死体积和神经细胞凋亡数均显著低于模型组和磷酸盐缓冲液组(P < 0.05)，模型组和磷酸盐缓冲液组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)；②造模后第3，7，14天，对照组、假手术组的神经缺损症状评分和神经细胞凋亡数均显著低于模型组、磷酸盐缓冲液组和神经干细胞组大鼠(P < 0.05)；③造模后第3天，模型组、磷酸盐缓冲液组和神经干细胞组的Brdu/NeuN阳性细胞计数差异无显著性意义(P > 0.05)；造模后第7，14天，神经干细胞组的Brdu/NeuN阳性细胞计数均显著高于模型组和磷酸盐缓冲液组(P < 0.05)，模型组和磷酸盐缓冲液组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；④造模后第3，7，14天，神经干细胞组的Brdu/GFAP阳性细胞计数均显著低于模型组和磷酸盐缓冲液组(P < 0.05)，模型组和磷酸盐缓冲液组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；⑤结果表明，移植神经干细胞治疗脑缺血大鼠可以促进侧脑室下区的内源性神经干细胞向神经元方向分化，减少神经细胞凋亡，改善缺血对大鼠神经功能的损害作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-6232-0374(刘一民)

关键词: 干细胞, 移植, 神经干细胞, 脑缺血大鼠, 神经细胞凋亡, 神经行为

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, neural stem cell transplantation has become a research hotspot in the treatment of brain injuries, such as cerebral ischemia, but the mechanism has not been fully elucidated.
OBJECTIVE: To study the effect of neural stem cell transplantation on neuronal apoptosis and differentiation and neurobehaviors in cerebral ischemia rats.
METHODS: Ninety Sprague-Dawley rats with cerebral ischemia were randomized into model group, phosphate buffer solution (PBS) group and neural stem cell group (n=30 per group). Another 30 rats were selected as sham operation group with vascular exposure but with no occlusion under anesthesia. Thirty normal 30 rats acted as controls with no treatment. Thereafter, neurological deficit scores, cerebral infarction volume, the number of apoptotic nerve cells, BrdU/NeuN and BrdU/GFAP expression were detected at 3, 7, 14 days after modeling.
RESULTS AND CONCLUSION: On the 7th day and 14th day after modeling, the neurological deficit scores, cerebral infarct volume and the number of apoptotic nerve cells in the neural stem cell group were significantly lower than those in the model group and PBS group (P < 0.05), but there was no statistically significant difference between the model group and PBS group (P > 0.05). On the 3rd day, 7th day and 14th day after modeling, the neurological deficit scores and the number of apoptotic nerve cells in the control group and sham operation group were significantly lower than those in the model group, PBS group and neural stem cell group (P < 0.05). On the 3rd day after modeling, the BrdU/NeuN positive cell count in the model, PBS and neural stem cell groups showed no statistically significant differences (P > 0.05); on the 7th day and 14th day after modeling, the BrdU/NeuN positive cell count in the neural stem cell group was significantly higher than that in the model group and PBS group (P < 0.05), but the difference between the model group and PBS group was not statistically significant (P > 0.05). On the 3rd day, 7th day and 14th day after modeling, BrdU/GFAP positive cell count in the neural stem cell group was significantly lower than that in the model group and PBS group (P < 0.05), and the latter two groups had no statistically significant difference (P > 0.05). In summary, neural stem cell transplantation for cerebral ischemia contributes to the neuronal differentiation of endogenous neural stem cells in the subventricular zone of the lateral ventricles, reduce neuronal apoptosis, and ease ischemic damage to the rat neurological function.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Neural Stem Cells, Brain Ischemia, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 成年雄性SD大鼠200只，随机分为造模组140只、假手术组30只、对照组30只。剔除造模不成功的大鼠50只，将造模成功大鼠90只随机分为3组。最终150只SD大鼠进入结果分析。

2.2 各组大鼠的神经缺损症状评分比较 造模后第3，7，14天，对照组、假手术组大鼠的神经缺损症状评分均显著低于模型组、磷酸盐缓冲液组、神经干细胞组(P < 0.05)，神经干细胞组大鼠的神经缺损症状评分在造模后第7，14天均显著低于模型组和磷酸盐缓冲液组(P < 0.05)，见表1。

2.3 各组大鼠的脑梗死体积、神经细胞凋亡数比较 造模后第3天，模型组、磷酸盐缓冲液组和神经干细胞组大鼠的脑梗死体积和神经细胞凋亡数比较差异均无显著性意义(P > 0.05)；造模后第7，14天，神经干细胞组大鼠的脑梗死体积和神经细胞凋亡数均显著低于模型组和磷酸盐缓冲液组(P < 0.05)；模型组和磷酸盐缓冲液组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。在造模后第3，7，14天，对照组、假手术组的神经细胞凋亡数均显著低于模型组、磷酸盐缓冲液组和神经干细胞组(P < 0.05)，见表2。

2.4 各组大鼠脑缺血后侧脑室下区Brdu/NeuN阳性细胞计数 对照组、假手术组未见Brdu/NeuN阳性细胞表达。造模后第3天，模型组、磷酸盐缓冲液组和神经干细胞组的Brdu/NeuN阳性细胞计数差异无显著性意义(P > 0.05)；造模后第7，14天，神经干细胞组的Brdu/NeuN计数均显著高于模型组和磷酸盐缓冲液组(P < 0.05)，模型组和磷酸盐缓冲液组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。见表3。Brdu阳性免疫荧光双标法着色为红色，NeuN阳性免疫荧光双标法着色为绿色，见图1。

2.5 各组大鼠脑缺血后侧脑室下区Brdu/GFAP阳性细胞计数 对照组、假手术组未见Brdu/GFAP阳性细胞表达。造模后第3，7，14天神经干细胞组的Brdu/GFAP计数均显著低于模型组、磷酸盐缓冲液组(P < 0.05)，模型组、磷酸盐缓冲液组在造模后第3，7，14天的Brdu/GFAP计数差异均无显著性意义(P > 0.05)，见表4。Brdu阳性免疫荧光双标法着色为红色，GFAP阳性免疫荧光双标法着色为绿色，见图2。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2015年5至10月在潍坊医学院动物实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 选取成年雄性SD大鼠200只，平均体质量(258±16.5) g，清洁级，购自潍坊医学院动物实验研究中心，合格证编号：SCXK鲁20140004。喂养于23-25 ℃、湿度50%-60%、光照12 h的环境下，自由进食进水。

按随机数字表法分为造模组140只、假手术组30只、对照组30只，剔除造模不成功的大鼠50只，造模组选取造模成功的90只大鼠随机分为模型组、磷酸盐缓冲液组(注射磷酸盐缓冲液)、神经干细胞组(移植神经干细胞)。模型组、磷酸盐缓冲液组、神经干细胞组再根据造模成功后的时间点随机分为3，7，14 d亚组，每个亚组10只大鼠。

1.3.2 实验仪器与药品 Neurobasal^®培养基及其配套B27添加剂购自美国Gibco公司，Brdu、碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子均购自Sigma公司，兔抗鼠Brdu及Nestin单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，鼠抗人GFAP单抗和NeuN单抗购自天津赛尔生物技术有限公司，DAB免疫组化试剂盒购自杭州赛澜生物技术有限公司。荧光倒置显微镜和倒置显微镜购自德国徕卡公司，超净工作台购自北京凯耐尔洁净设备有限公司，脑立体定位仪购自上海玉研科学仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 造模方法 参考文献[11]的方法进行造模，取健康成年雄性SD大鼠，10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射进行麻醉，将麻醉后的大鼠固定于手术台上，体积分数75%乙醇消毒后沿颈部正中线纵行剪开皮肤，分离出皮下组织，在左侧颈总动脉近心段和颈外动脉处结扎，在左侧颈总动脉心端挂线，用微动脉夹暂时夹闭劲内动脉，在距离左侧颈总动脉分叉部3 mm处，用显微剪剪开一小口，将前端包裹蜡的鱼线(直径0.25 mm)插入劲内动脉，松开微动脉夹，插入深度从左侧颈总动脉分叉部开始算起18 mm左右。假手术组仅在麻醉状态下分离暴露血管，不进行阻断血流的操作；对照组不进行任何操作。模型组、磷酸盐缓冲液组、神经干细胞组大鼠缺血90 min后，回抽尼龙线10 mm，恢复颈内动脉充盈。SD大鼠麻醉苏醒后出现前行时右侧划圈征和提尾时右前肢屈曲证明造模成功。造模成功后24 h开始给予大鼠Brdu注射，50 mg/(kg•次)，每天3次注射，最后一次注射在处死大鼠前24 h。

1.4.2 神经干细胞的分离、培养 另取新生3 d SD大鼠用于提取神经干细胞。SD大鼠喂养14 d后，10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射进行麻醉，无菌条件下处死后取鼠脑，参考文献[12]的方法进行神经干细胞的分离、培养，剥离脑膜、脑血管后，得到大脑海马组织，置于Hank’s液漂洗剪碎，机械吹打后形成细胞悬液。16 000 r/min离心5 min弃上清液，选取沉淀物继续吹打形成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁹ L^-¹后，将其接种于25 mL无菌培养瓶内。滴入含20 μg/L的表皮生长因子+20 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子+2% B27 DMEM/F12培养基后，置于37 ℃、体积分数5%CO₂下培养，每3 d换液1次，至第10天细胞开始传代。选取传代后细胞接种于已涂5%多聚赖氨酸盖玻片培养板上，待细胞贴壁置于磷酸盐缓冲液洗5 min，ABC法免疫细胞化学法染色测定，将1∶100浓度Nestin测得阳性细胞作为神经干细胞。

1.4.3 神经干细胞移植 神经干细胞组大鼠造模成功后30 min参考文献[13]的方法进行神经干细胞移植，常规麻醉仰卧固定于手术台，选择脑立体定位仪对大鼠左侧纹状体进行定位，坐标零点为Bregma点，AP=0 mm，ML=2.0 mm，DV=4.5 mm。微量注射器0.15 μL/s注入10 μL神经干细胞，细胞浓度为2×10¹⁰ L^-¹，注射结束后留针20 min后拔出，磷酸盐缓冲液组选择相同方法注射。

1.4.4 神经缺损症状评分 对各组大鼠造模后第3，7，14天的神经功能进行评分，采用Chen等^[14]的神经缺损症状评分方法，主要包括运动实验、平衡实验、感觉实验、反射实验，神经缺损症状评分分值0-18分，得分越高表示神经功能损害越严重。

1.4.5 脑梗死体积测定(TTC染色法) 造模后第3，7，14天进行脑梗死体积测定，10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉后迅速断头取脑，将大鼠脑组织腹侧面向上放入预冷的脑槽中，用刀片将嗅球和小脑头尾两端切掉，然后从大脑脚开始将脑组织冠状切片，厚2 min，约6片，然后置于含2%TTC溶液的培养皿中，37 ℃避光孵育30 min，每15 min翻面一次。待正常侧脑组织颜色变红后置于40 g/L多聚甲酸溶液中固定24 h之后进行拍照。使用图像处理软件(Image Tool)分析脑梗死体积百分比。公式如下：脑缺血面积(%)=(10张脑片健侧面积之和-10张脑片患侧未缺血面积)×2 mm/10张脑片健侧面积×2 mm×100%。

1.4.6 神经细胞凋亡检测 造模后第3，7，14天进行神经细胞凋亡检测。TUNEL染色法测定神经细胞凋亡，取脑组织冰冻切片滴加体积分数3%H₂O₂室温处理10 min，蒸馏水洗2 min×3次, 加0.1 mL/L TBS，1∶200新鲜稀释的蛋白酶 37 ℃消化10 min，加标记液20 μL/片，37 ℃标记2 h，0.1 mol/L TBS洗2 min×3次，加封闭液 50 μL/片，室温30 min，用封闭液1∶100稀释生物素化抗地高辛抗体50 μL/片加至标本片上面，37 ℃反应 30 min，0.1 mol/L TBS洗2 min×3次，取SABC液加至切片，37 ℃反应30 min，0.1 mol/L TBS洗5 min×4次，DAB显色，水洗，苏木精轻度复染，0.1 mol/L TBS洗，蒸馏水洗，脱水，透明，封固，显微镜观察，细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞。

1.4.7 免疫荧光双标(Brdu/NeuN，Brdu/GFAP)及细胞计数方法 造模后第3，7，14天进行检测。磷酸盐缓冲液冲洗脑组织冰冻切片5 min×3次，0.1%Triton-X-100冲洗5 min×3次，0.1%Triton-X-100-5%山羊血清封闭1 h，NeuN/GFAP一抗4 ℃过夜，磷酸盐缓冲液冲洗切片5 min×5次，二抗 37 ℃ 2 h。磷酸盐缓冲液冲洗切片5 min×5次，4% PFA固定10 min，2 mol/L HCl 37 ℃孵育30 min，4%PFA固定10 min，0.1%Triton-X-100-5%山羊血清封闭1 h，Brdu一抗4 ℃过夜，磷酸盐缓冲液冲洗切片5 min×5次，二抗37 ℃2 h，磷酸盐缓冲液冲洗切片5 min×5次，封固4 ℃保存，共聚焦显微镜下进行观察，拍照。

采用计算机图像分析软件计数脑缺血后不同时间段缺血侧侧脑室下区Brdu/NeuN及Brdu/GFAP阳性细胞，计算双标记阳性细胞占Brdu细胞的百分比。神经凋亡细胞计数在400倍显微镜下，选取5个不重叠的视野，进行凋亡阳性细胞计数(TUNEL着色为细胞核中出现棕黄色颗粒)，求取平均值。

1.5 主要观察指标 各组大鼠在不同时间点的神经功能评分、脑梗死体积、神经细胞凋亡数、Brdu/NeuN及Brdu/GFAP的表达差异。

1.6 统计学分析 数据分析及统计在专业软件SAS 9.0软件包中处理，计量指标采用x(_)±s表示，多组间比较采用单因素分析，组间两两比较采用SNK-q 检验。P < 0.05表示2组指标差异有显著性意义。

讨论

脑血管疾病是指各种原因导致的脑血管病变而引起的脑部疾病，其中最常见的为缺血性脑血管疾病，约占脑血管病的70%以上^[15-18]。脑缺血是人类致死、致残的主要疾病，流行病学研究显示，国内每年有超过150万的急性脑卒中患者死亡^[19]。脑缺血易造成患者中枢神经系统大量神经细胞的缺失和神经网络受损，导致患者神经功能发生障碍。目前临床上对脑缺血的治疗以溶栓治疗为主，但是组织型纤溶酶原激活剂在溶解血凝块的同时却增加了脑出血的风险^[20]，并且溶栓治疗受到3 h溶栓治疗窗的严格限制，适应范围较窄。对于大多数脑缺血患者而言，最主要的问题是发生神经元的死亡，目前的治疗手段均无法从根本上解决患者脑缺血部位神经元大量丢失的问题，因此，药物治疗效果往往不佳，预后较差^[21]。

由于脑血管疾病无法治愈后可能使患者致残，给家庭和社会带来严重的负担，因此，如何更好地改善患者受损的各种神经元功能是一个全球性的治疗难题。1992年Reynolds等^[22]在小鼠脑组织中分离出多向分化潜能，并且不断增殖的细胞球，从此打破了以往中枢神经系统不存在神经干细胞的理论。近年来，越来越多的文献报道了神经干细胞移植用于脑缺血性损伤的治疗^[23-27]。神经干细胞是一类能够自我更新、自我增殖和多向分化的细胞，可被定向诱导分化为成熟的脑细胞，神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞^[28-31]。神经干细胞主要通过以下两种方式来维持细胞数量：①通过对称分裂方式产生2个子代干细胞；②通过不对称分裂方式产生1个干细胞和1个分化的细胞，分化的细胞可进一步分化为成熟的神经细胞^[32]。神经干细胞除具有自我更新和多向分化的潜能外，还具有以下几个方面的特征：①对损伤部位具有反应能力：通过产生新生的神经细胞而修复受损神经组织；②具有迁移作用和良好的组织相容性：当神经发生损伤后，神经干细胞从脑室向神经损伤区域方向迁移，达到神经修复的目的，此外，外源性神经干细胞也具有迁移的作用；③具有较低的免疫原性：由于属于未分化的细胞，不会表达抗原，因而免疫原性低，移植后较少引起排斥反应，有利于神经干细胞存活。神经干细胞作为移植细胞还具有许多治疗优点，如可以建立不同的干细胞株系、不会受到血脑屏障的限制而远距离迁移和扩散、不干扰正常的脑功能等^[33]。

目前，国内外学者已经将神经干细胞移植用于脑缺血、脑出血、中枢神经系统肿瘤等的治疗，动物实验研究也已广泛开展。有学者就神经干细胞移植治疗大鼠局灶性脑缺血损伤进行了研究，结果发现神经干细胞可以在局灶性脑缺血大鼠脑室内和梗死中心均可长期存活，并能够广泛迁移，大鼠的运动行为学评分有明显提高。在本项研究中，发现神经干细胞组大鼠的神经缺损症状评分和神经细胞凋亡数在造模后第7，14天均显著的低于模型组和磷酸盐缓冲液组，表明神经干细胞移植治疗脑缺血大鼠能够促进大鼠神经功能的恢复。与其他文献报道的结果一致^[23-31]。并且本研究结果还进一步显示，神经干细胞组大鼠的脑梗死体积和神经细胞凋亡数量在第7，14天均显著的低于模型组和磷酸盐缓冲液组，进一步证实了神经干细胞移植对脑缺血大鼠的神经保护作用。Brdu是胸腺嘧啶脱氧核苷类似物，可标记细胞核，在细胞S期标记细胞NDA的合成，Brdu阳性细胞即为具有增殖活力的细胞^[34]。NeuN是神经元细胞的标记蛋白，能够标记神经元细胞，GRAP是胶质细胞增殖活化的标志物^[35]，本研究中发现各组脑缺血大鼠于造模后第7天，Brdu/NeuN阳性和Brdu/GFAP阳性细胞数目达到高峰，说明脑缺血激活了神经干细胞的增殖，逐渐向神经元和神经胶质细胞方向分化。并且在造模后第7，14天，神经干细胞组的Brdu/NeuN阳性细胞计数显著高于模型组和磷酸盐缓冲液组，造模后第3，7，14天神经干细胞组的Brdu/GFAP阳性细胞计数显著低于模型组和磷酸盐缓冲液组，提示神经干细胞移植可以促进神经干细胞想神经元细胞方向分化。神经干细胞移植对脑缺血大鼠的神经保护作用的具体机制目前尚未完全明确，目前研究认为其可能的机制存在以下几个方面：①移植的神经干细胞在脑缺血损伤处分化成为神经元细胞，代替了因损伤而损失的部分神经元细胞^[36]；②神经干细胞的移植可以激活和加强周围神经细胞的自我修复功能从而促进神经功能的自我修复；③神经干细胞移植能够抑制神经细胞的凋亡，改善脑缺血损伤的的神经功能缺失^[37-39]；④神经干细胞移植能够诱导脑缺血处血管的新生，重建缺血区血流和血脑屏障^[40-49]；⑤神经干细胞移植能够产生许多神经营养因子，有利于缺血区神经功能的恢复。

综上所述，作者认为脑缺血大鼠移植神经干细胞后，其行为学得到了明显改善，并且减少了缺血区域的梗死面积和凋亡细胞的数目，抑制了神经元的进一步变性以及胶质细胞的增生，从而改善缺血对大鼠神经功能的损害作用。