低氧下血管内皮细胞生长因子转染人骨髓间充质干细胞向血管内皮样细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.008

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
低氧环境下骨髓间充质干细胞的特性：人骨髓间充质干细胞来源于骨髓，骨髓内的氧浓度在3%-7%之间，属于生理性低氧环境，人骨髓间充质干细胞的自我更新及多向分化能力与这种低氧环境密不可分，且有研究认为低氧环境中的人骨髓间充质干细胞有较好的耐受性，相对稳定的低氧浓度能增加人骨髓间充质干细胞的相关因子表达量，更能够促使其向神经元样细胞分化。如何在低氧环境中采用有效手段促使人骨髓间充质干细胞的定向分化，是目前众多学者研究的重点。
血管内皮细胞生长因子促骨髓间充质干细胞内皮化：通过RT-PCR及 Western blotting检测均发现，转染血管内皮细胞生长因子的骨髓间充质干细胞经诱导后，内皮素mRNA及蛋白表达明显升高，前列环素 mRNA和蛋白表达下降，与正常血管内皮细胞分泌此两种因子的情况一致，进一步说明血管内皮细胞生长因子具有促使人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化的能力。

摘要
背景：已有研究发现血管内皮细胞生长因子可诱导骨髓间充质干细胞分化为内皮细胞，但在机体损伤的低氧环境下，血管内皮细胞生长因子基因是否可促进骨髓间充质干细胞定向诱导分化为血管内皮样细胞？
目的：观察低氧环境下，经血管内皮细胞生长因子诱导的人骨髓间充质干细胞是否能够向血管内皮样细胞分化。
方法：在含体积分数5%O2环境中，将第3代人骨髓间充质干细胞分组培养，对照组以常规培养基培养，实验组以含血管内皮细胞生长因子载体的腺病毒诱导液培养。培养2周后，进行形态学观察及表面相关分子检测，ELISA检测细胞培养上清液中血管内皮细胞生长因子及内皮型一氧化氮合成酶因子水平，RT-PCR和Western blotting检测内皮素和前列环素蛋白表达。
结果与结论：①对照组细胞数量较多，呈拥挤状，排列不齐，呈纤维样生长；实验组细胞多呈三角形或多边形，集落状生长，呈铺路石子样；②对照组CD31为阴性表达，CD105为阳性表达且阳性率为99.7%，表明细胞仍呈现骨髓间充质干细胞的表型。实验组CD31表达明显上升，阳性率为30.33%；CD105表达下降，阳性率为58.11%，呈现典型的内皮细胞表型；③与对照组比较，实验组内皮素、血管内皮细胞生长因子及内皮型一氧化氮合成酶表达增高(P < 0.01)，前列环素表达降低(P < 0.01)；④结果表明在低氧环境下，血管内皮细胞生长因子具有促使人骨髓间充质干细胞向血管内皮样细胞分化的能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-0391-963X(胡继宏)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 血管内皮细胞生长因子, 骨髓间充质干细胞, 血管内皮细胞, 内皮型一氧化氮合成酶, 内皮素, 前列环素

Abstract:

BACKGROUND: It has been found that vascular endothelial growth factor can induce the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into endothelial cells, but can the vascular endothelial growth factor gene promote the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into vascular endothelial cells in the damaged organ under the hypoxic environment?
OBJECTIVE: To observe whether human bone marrow mesenchymal stem cells induced by vascular endothelial growth factor could differentiate into vascular endothelial cells under hypoxia.
METHODS: The third passage of human bone marrow mesenchymal stem cells were cultured in vitro. Cells in the control group were cultured with conventional culture medium, while those in experimental group were cultured with adenovirus vector containing vascular endothelial growth factor in 5% O2. After 2 weeks of culture, morphological observation and surface-related molecular detection were performed. The levels of vascular endothelial growth factor and endothelial nitric oxide synthase were detected by ELISA. The expression of endothelin and prostacyclin was detected by RT-PCR and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The number of cells in the control group was more than that in the experimental group. The cells in the control group were crowded and arranged irregularly, showing a fiber-like growth, while those in the experimental group were mostly triangular or polygonal, exhibiting a colony-like growth. (2) CD31 was negative in the control group, while CD105 was positive and the positive rate was 99.7%, indicating that the cells still showed the phenotype of bone marrow mesenchymal stem cells. The positive rate of CD31 was significantly increased to 30.33% in the experimental group and the positive rate of CD105 expression was decreased to 58.11%, indicating a typical phenotype of endothelial cells. (3) Compared with the control group, the expression of endothelin, vascular endothelial growth factor and endothelial nitric oxide synthase increased significantly in the experimental group (P < 0.05), and the expression of prostacyclin decreased significantly (P < 0.05). All these findings indicate that vascular endothelial growth factor can promote the differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into vascular endothelial cells under hypoxia.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells;, Mesenchymal Stem Cells, Vascular Endothelial Growth Factors, Endothelial Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

胡继宏，贾佳，路娟，王秋萍，赵静苗，靳利梅，李金娟. 低氧下血管内皮细胞生长因子转染人骨髓间充质干细胞向血管内皮样细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(9): 1352-1356.

Hu Ji-hong, Jia Jia, Lu Juan, Wang Qiu-ping, Zhao Jing-miao, Jin Li-mei, Li Jin-juan. Vascular endothelial growth factor transfection induces human bone marrow mesenchymal stem cells differentiating into endothelial-like cells under hypoxia[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(9): 1352-1356.

图/表（结果） 2

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年12月至2015年12月在甘肃兰州军区总医院干细胞与基因药物重点实验室和甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究重点实验室完成。

1.3 材料 人BMSCs(第1代)购买于ScienCell公司(货号7500)；MSCM培养基、胎牛血清(500 mL，ScienCell公司)；携带VEGF基因的腺病毒载体pAd-VEGF-IRES2-EGFP (293A细胞)由Life Technologies Corporation帮助构建，病毒效价为2×10¹⁰ ifu/mL；TakaRa Prime Script^TM reagent Kit试剂盒(TaKaRa公司)；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(Solarbio公司)；人VEGF ELISA试剂盒(联科生物，批号：218360343)；人eNOS ELISA试剂盒)上海酶联，批号：201604)；CD31 FITC、CD105 APC(BD公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人BMSCs的体外培养^[2-3] 将冻存的人BMSCs从-80 ℃冰箱取出，于37 ℃水浴锅中溶化，同时将新培养瓶放置于超净台中，800 r/min离心3 min，将上清倒掉，加入含体积分数10%胎牛血清的完全培养基1 mL，轻轻吹打混匀细胞，移至新培养瓶中，总液体量为5 mL，放置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱培养，每日观察细胞生长状态，二三天换液1次。待细胞生长融合达80%-90%时，用PBS冲洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶500 µL，并拍打培养瓶一侧，镜下观察细胞脱落情况，若细胞间隙增大，胞质回缩，速加入等量完培，以800 r/min离心3 min，去上清，加入适量完培吹打混匀细胞，按照1∶3比例进行传代。

1.4.2 人BMSCs的体外干预诱导 为在含体积分数5%O₂的三气培养箱中，将第3代人BMSCs分2组培养，对照组为单纯BMSCs进行2周常规培养，期间不传代；实验组加入含VEGF因子的病毒载体诱导液进行诱导分化，24 h后换为普通培养液继续培养，每隔3 d换液，并将换下的上清培养液保存-20 ℃冰箱，用于VEGF及内皮型一氧化氮合成酶因子的检测，培养2周后对分化的细胞进行鉴定。

1.5 主要观察指标

ELISA检测细胞上清培养液中VEGF及内皮型一氧化氮合成酶水平：诱导2周后，根据说明书步骤，先将细胞培养上清液离心去除沉淀，再行标准品与样品的稀释，分别加样于酶标板孔底部，温育后加入洗液进行多次冲洗，后加入酶标试剂、显色液、终止液，最后置于酶标仪下进行检测。

Real-time qPCR检测血管内皮细胞相关因子内皮素及前列环素的表达：诱导2周后，采用总RNA提取法收集细胞，弃去培养基，用PBS冲洗细胞2遍后加入1 mL Trizol，使其覆盖细胞面，置于冰上裂解5 min后，加入相应试剂，最后将提取的RNA根据TakaRa Prime Script^TM reagent Kit试剂盒进行反转录。反转录：将1 μg样品RNA加入4 μL 5×PrimeScript Buffer、1 μL PrimeScript RT Enzyme Mix I、1 μL Oligo dT Primer、1 μL Random 6 mers，补RNase Free dH₂O至20 μL，以37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存10 min进行扩增。将反转录得到的cDNA进行Real-time PCR，并制作熔解曲线。

Western blotting检测诱导细胞中内皮素及前列环素蛋白表达：诱导2周后，收集细胞，加入细胞裂解液后冰上静置10 min，4 ℃ 12 000 r/min 离心30 min后，提取上清液用BCA试剂盒测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转移至PVDF膜上，再分别将β-actin、前列环素、内皮素一抗用TBST稀释(1∶1 000)后加入PVDF膜4 ℃过夜孵育，次日加入相应的二抗，室温孵育后加入发光液，放入凝胶图像分析仪进行曝光。用目的条带的灰度值比内参β-actin灰度值代表蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法 结果采用SPSS 13.0软件进行分析，计量资料服从正态分布用均值±标准差表示，组间比较方差齐，采用成组t 检验；方差不齐，采用t’ 检验。不服从正态分布采用中位数和四分位间距表达，组间比较采用秩和检验。计数资料用率表达，组间比较采用卡方检验，显著性水平α=0.05。

讨论

人BMSCs来源于骨髓，骨髓内的氧浓度在3%-7%之间，属于生理性低氧环境，人BMSCs的自我更新及多向分化能力与这种低氧环境密不可分，且有研究认为低氧环境中的人BMSCs有较好的耐受性^[4]，相对稳定的低氧浓度能增加人BMSCs的相关因子表达量^[5]，更能够促使其向神经元样细胞分化^[6]。如何在低氧环境中采用有效手段促使人BMSCs的定向分化，是目前众多学者研究的重点。

实验中利用VEGF对人BMSCs诱导培养2周后，形态学观察发现实验组细胞形态似铺路石子样，呈典型的血管内皮细胞形态。结合流式细胞仪鉴定内皮细胞表型分子，发现对照组CD105高表达，CD31阴性表达，呈现BMSCs特性；实验组呈现内皮细胞表型特点(CD31阳性表达，CD105表达下降)，说明VEGF转染人BMSCs具有向内皮细胞分化的倾向。这与VEGF诱导鼠BMSCs和兔BMSCs向内皮细胞分化的结果一致^[7-8]。CD31是内皮细胞的特异性表面标志^[9]，也有研究发现将BMSCs与VEGF共培养同样可促进BMSCs向内皮细胞分化。

分化后的细胞是否具有血管内皮细胞的功能，还需要相应的功能学指标检测观察，但目前尚未发现相关报道。为此，研究采用ELISA法检测具有特异性较高的VEGF及内皮型一氧化氮合成酶，同时采用RT-PCR和Western blotting检测血管内皮细胞相关因子内皮素及前列环素的表达情况加以验证。结果显示相较于对照组，实验组的VEGF及内皮型一氧化氮合成酶表达均明显上调，说明VEGF诱导的人BMSCs在分化过程中已有血管内皮细胞因子的表达。VEGF是目前已知最强的促血管生成因子，能特异性促内皮细胞迁移、增殖及形成管腔样结构，对维持血管内皮细胞正常结构和生理功能有重要作用^[10-12]。内皮型一氧化氮合成酶主要存在于血管内皮细胞中，具由维持血管壁构型，参与调节血管功能，已有研究发现^[13]，内皮型一氧化氮合成酶表达载体转染后的BMSCs，能够表达血管内皮细胞相关分子如CD31及VEGF等。实验中VEGF与内皮型一氧化氮合成酶的结果表明，VEGF转染后的人BMSCs已向血管内皮细胞分化。

血管内皮能产生多种血管活性介质，这些血管活性物质根据功能可分为内皮源性收缩因子和内皮源性舒张因子。内皮源性收缩因子主要有内皮素、血栓素等^[14]，而内皮源性舒张因子有前列环素等^[15]。内皮素在体内的主要来源是血管内皮细胞，具有收缩血管的作用^[16-18]。前列环素亦是主要由血管内皮细胞生成，有强烈的舒张血管，抗血栓及抑制血小板聚集等作用^[19]。在实验中，通过RT-PCR及 Western blotting的检测均发现，对照组及实验组的内皮素及前列环素呈现不同程度的表达，实验组内皮素mRNA及蛋白上调程度较对照组明显升高，而前列环素 mRNA和蛋白表达较对照组下降。在正常情况下，只有血管内皮细胞分泌的内皮素增多和前列环素减少^[20]，才能维持内环境的平衡状态且发挥一定作用，共同促进内皮细胞的正常生长^[21]，如内皮素/前列环素比例的失调，将对内皮细胞产生负性作用。因而实验中内皮素升高与前列环素降低的结果与正常血管内皮细胞分泌此两种因子的情况一致，进一步说明VEGF具有促使人BMSCs向血管内皮细胞分化的能力。

在众多VEGF促使骨髓间充干细胞向血管内皮细胞分化的实验中，并未出现阳性对照组^[22]，即无经典诱导剂能够明确其他实验手段在促使BMSCs向血管内皮细胞分化的过程中作用的成功，因而目前的研究结果只能与单纯培养的细胞进行比较，同时结合血管内皮细胞分泌的特异性因子的表达相结合，来说明该干预手段是否有作用。

临床上对于组织损伤的治疗手段多为治标不治本，大多数学者认为理想的治疗模式为再生医学，其中干细胞的血管化对于治疗心脑血管疾病具有重要意义，尤其在如何增加新生血管数量及血管生成速度上还需要进一步的研究证实。