RT-PCR联合凝胶电泳成像技术检测体外培养小鼠肺成纤维细胞转化生长因子β1的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.08.021

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
RT-PCR技术：即反转录PCR技术，是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链反应相结合的技术。该技术灵敏度高，用途广泛，常用于检测细胞组织中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。
成纤维细胞：是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。根据不同功能活动状态，可将细胞划分为成纤维细胞和纤维细胞，成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质嗜弱碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化。成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用。

摘要
背景：RT-PCR技术是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链反应相结合的技术。常用于检测细胞组织中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。
目的：运用RT-PCR技术检测Stealth siRNA对转化生长因子β1的抑制作用。
方法：实验分为空白对照组、空转染组、stealth_48组、stealth_166组和stealth_594组。针对BALB/c小鼠转化生长因子β1基因组，选择不同位点设计3套siRNA基因序列，转染体外培养的小鼠肺成纤维细胞，RT-PCR法检测其对转化生长因子β1和下游结缔组织生长因子表达的影响。
结果与结论：①RT-PCR结果显示3种Stealth siRNA对转化生长因子β1表达在不同时间有不同程度的抑制作用，以Stealth_166效果更为明显；抑制效果与转染时间长短相关，48 h后就可检测出明显抑制，72 h达到最高峰，96 h后开始减弱；②结果说明，RT-PCR技术可用于特异性Stealth siRNA抑制转化生长因子β1在小鼠肺成纤维细胞的表达效果的检测。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-8803-8833(余维涛)

关键词: 组织构建, 组织工程, 转化生长因子β1, Stealth siRNA, 肺成纤维细胞, 抑制

Abstract:

BACKGROUND: As a combination of reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR), RT-PCR has been used to detect gene expression levels in cells and tissues, RNA virus contents in cells and specific gene cloned cDNA sequences.
OBJECTIVE: To detect the inhibitory effcet of Stealth siRNAs on the expression of transforming growth factor β1 (TGF-β1).
METHODS: There were blank control, empty vector transfection, stealth_48, stealth_166, and stealth_594 groups. Three stealth siRNAs aimed at different sequences in TGF-β1 mRNA were made, and were then transfected into BALB/c mouse lung fibroblasts in vitro. The expressions of TGF-β1 and connective tissue growth factor were detected by RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: In different time periods, the TGF-β1 expression was differentially depressed by three stealth siRNAs, especially stealth_166. The inhibitory effects varied with time, which could be detective at 48 hours, reached the peak at 72 hours and then began to attenuate at 96 hours. Our findings show that the inhibitory effect of stealth siRNAs on the TGF-β1 expression in mouse lung fibroblasts can be detected by RT-PCR.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: RNA, Small Interfering, Transforming Growth Factor beta1, Fibroblasts, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 3

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引言

有研究证实肺间质纤维化的发生发展与转化生长因子β1的高表达密切相关^[1-2]。常运用针对性小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)，诱导产生特异性内源或外源性靶基因沉默，介导其互补同源mRNA序列特异性降解，从而抑制靶基因的转录后表达来进行基因功能研究。针对转化生长因子β1的mRNA序列，选择3个基因位点设计并合成正义链经化学修饰的siRNA(Stealth siRNA)，通过脂质体转染小鼠肺成纤维细胞(lung fibroblast, LFb)，对转化生长因子β1表达有抑制作用^[3]。研究Stealth siRNA 对转化生长因子β1表达的影响，首先要选择适合的转化生长因子β1检测方法，ELISA法和放射免疫分析常用于血清转化生长因子β1的检测^[4-5]，而对于细胞组织中的转化生长因子β1检测，目前常用的是免疫组织化学法^[6-7]。免疫组织化学法作为定性实验，在临床运用中，特别是在效果评价方面具有一定的缺陷。RT-PCR技术被广泛的运用于miRNA的表达分析^[8-9]，为此，作者将RT-PCR联合凝胶电泳成像技术运用到实验中，用以评价Stealth siRNA对体外培养小鼠肺成纤维细胞转化生长因子β1 mRNA表达的抑制作用。

RT-PCR技术联合凝胶电泳成像技术能直观地显示Stealth siRNA对体外培养小鼠成纤维细胞转化生长因子β1表达的抑制效应，且灵敏度、特异性均高于ELISA法。由于凝胶电泳成像技术配合相应软件可以进行半定量分析，较之只能进行定性实验的免疫组织化学技术更具备优势。作者认为RT-PCR技术联合凝胶电泳成像技术在医疗和科研工作中具有一定的实用性，具有一定的推广价值。当然RT-PCR技术联合凝胶电泳成像技术也有不足之处，操作过程较为繁琐，使用仪器设备较多，同时仅能进行半定量分析，使其在临床上的运用受到了一定的制约。作者考虑设计针对转化生长因子β1 mRNA的特异探针，采用适时荧光定量分析的方法，建立适合于转化生长因子β1mRNA检测的PCR反应体系，以期完善组织及细胞样本中转化生长因子β1 mRNA表达检测的方案。

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材料方法

1.1 设计细胞学实验观察。

1.2 时间及地点实验于2006年1月至10月在解放军第三军医大学第三附属医院中心实验室完成。

1.3 材料

实验动物：清洁级新生BALB/c小鼠，雌雄不限，由解放军第三军医大学第三附属医院中心实验室提供。

主要仪器和试剂：PCR扩增仪(英国Hybaid公司)，可见光/紫外凝胶扫描分析系统(美国UVP公司)；DMEM细胞培养基/液、胎牛血清购自Gibco公司，Lipofectamine™ 2000购自Invitrogen公司，胰蛋白酶、DMSO购自Amresco公司，波形蛋白抗体、转化生长因子β1免疫组织化学试剂盒购自武汉博士德公司，RNA提取试剂盒购自上海生物工程有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 设计与制备特异性Stealth siRNA 在GENBANK网站查得BALB/c小鼠转化生长因子β1的mRNA序列；应用Invitrogen公司网站的在线设计软件BLOCK-iT™ RNAi Designer，选择stealth_48、stealth_166、stealth_594等3个位点，分别靶向设计得到3套Stealth siRNA序列，交由invitrogen公司合成Stealth siRNAs。选择基因位点遵循以下原则：①避开5'和3'端的非编码区；②选择G/C比在35%-55%之间的序列；③使用BLAST排除和其他编码序列/EST同源序列。

1.4.2 细胞培养及鉴定取出清洁级新生BALB/c小鼠的肺组织，剪成0.5-1.0 mm³的小组织块，按组织块法进行细胞原代培养肺成纤维细胞，并纯化、传代^[10]。对纯化后的细胞，锥虫蓝染色计数活细胞率，苏木精-伊红染色观察细胞形态学特征，波形蛋白免疫组织化学检测以鉴定肺成纤维细胞。冻存第4代细胞用于实验。

1.4.3 基因转染将培养好的第4代肺成纤维细胞消化收集，重悬于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液中并计数，按每孔0.4 mL(2×10⁵/孔)分至24孔板继续培养24 h至细胞汇合度达90%左右。分为空白对照组、空转染组、stealth_48组、stealth_166组和stealth_594组(4孔/组)。①Stealth siRNA稀释液配制：用3 mL不含血清的Opti-MEM^®I培养液分别稀释3种Stealth siRNA各20 nmol至20 mol/L，轻轻混匀；②Lipofectamine™ 2000稀释：用5 mL不含血清的Opti-MEM®I培养液与0.1 mL Lipofectamine™ 2000轻轻混匀，室温孵育5 min；③复合物形成：将稀释后的Stealth siRNA和Lipofectamine™2000在30 min内等量 (50 μL∶50 μL)混合，室温孵育20 min；④培养：按100 μL/ 孔将复合物直接加入培养板中，轻轻混匀后转入37 ℃、体积分数5%的CO₂培养箱内培养。

1.4.4 检测指标分别消化收集24，48，72，96 h的铺板细胞，提取细胞总RNA，反转录和PCR扩增；收集最终产物进行凝胶电泳和成像。用凝胶成像仪图像分析软件进行图像分析，半定量分析每种检测基因(转化生长因子β1和结缔组织生长因子)与内参照(β-actin)的A值之比(目的条带A值/内参条带A值)。

1.5 主要观察指标 ①小鼠肺成纤维细胞的鉴定；②小鼠肺成纤维细胞转化生长因子β1表达。

1.6 统计学分析应用SPSS 18.0软件对A 值之比进行方差齐性检验后，再进行单因素方差检验。

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讨论

转化生长因子β1是由淋巴细胞和单核细胞产生的一类具有多种生物活性的同源二聚体多肽分子，相对分子质量约25×10³，每条多肽链含110-140个氨基酸残基；是多功能细胞因子超家族成员之一，能刺激或抑制多种细胞的增殖，其中提高细胞外基质是其最主要的功能，亦是基底膜增厚、细胞外基质聚积和多种组织器官纤维化的关键因子^[11-12]。转化生长因子β1在肺纤维化过程中主要作用于胶原的转录和翻译过程，诱导前胶原mRNA的产生，促进胶原蛋白的形成和沉淀，因而在促进肺纤维化中起着重要作用^[13-20]，抑制转化生长因子β1有助于延缓肺纤维化的进程，但常规药物如干扰素、苏拉明等对其抑制效率不高，且安全性及给药途径等还有待于临床验证^[21]。长21-23核苷酸的siRNA能避免非特异性抑制基因表达，诱发特异性RNAi现象为了提供抑制转化生长因子β1表达^[22-23]，从而缓解肺纤维化进程的可能性^[24-33]。因而作者针对小鼠的转化生长因子β1基因靶序列选择了3个位点分别设计了3种Stealth siRNA，并对其中的正义链进行了化学修饰，从而使其：①只允许反义片段导入靶细胞/组织，因而消除了正义链的RNA干扰作用，这也大大降低了非特异性基因抑制的可能性；②结构较以往的siRNA具有更好的稳定性，不易被降解，可保持活性达48 h以上。用于检验其对转化生长因子β1表达的抑制作用。

常规的ELISA法适用于血清样本的检测，用于组织或者细胞检测时，操作复杂，繁琐，可操作性差^[34]；免疫组织化学法仅能进行定性检测。作者采用RT-PCR技术联合凝胶电泳成像技术以检测转染3种Stealth siRNA对小鼠成纤维细胞转化生长因子β1表达的影响。通过实验得出3种Stealth siRNA对小鼠肺成纤维细胞中转化生长因子β1的表达均有不同程度的抑制作用，其中Stealth_166的抑制相对更为明显，但3组转染组间比较并无统计学差异；在不同的时段，抑制效应也不尽相同，转染24 h后并不能检测到表达减低，48 h后各转染组小鼠肺成纤维细胞中转化生长因子β1的表达出现不同程度的减低，72 h后表达减低最为明显，但转染96 h后则抑制效应开始减弱；同时，下游因子结缔组织生长因子的表达也呈相关性变化。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程