1.1 实验设计 前瞻性、单中心、自身对照实验研究。
1.2 实验完成地点 吉林省四平市中心人民医院。
1.3 实验设计执行流程
(1)实验选用SD大鼠130只,随机分为13组,每组10只。每只大鼠随机选一肢后足为手术肢,另一肢为对照肢。对手术肢跟腱进行切断,第1组不予缝合,而第2-13组均用3-0尼龙线按Kessler法吻合;第8-13组于外科吻合后第1天起,每日轻柔的进行术肢跟腱屈伸活动数次,以促进肌腱愈合及减少周围组织粘连。见图1。
(2)首先在外科吻合前应用高频超声仔细观察每只大鼠肌腱影像学特点,以建立正常肌腱的超声影像概念。然后观察第1组肌腱断裂的超声影像特征,并与对照肢超声影像进行对比。于吻合术后3,7,14,21,35,42 d分别对第2及8组、3及9组、4及10组、5及11组、6及12组、7及13组动物进行检查。观察手术肌腱吻合处的超声影像变化。
(3)组织学检查:超声检查结束后,立即将术肢吻合处及远近各1 cm的肌腱组织取出,并取对照肢正常肌腱组织标本,行苏木精-伊红染色,观察肌腱组织学改变的特点。
(4)将实验各组术肢与对照肢肌腱超声影像进行对比观察,并与同期组织切片的病理变化进行对比分析,了解肌腱自然愈合过程中及功能锻炼对肌腱影响的超声影像学表现及与之对应的同期组织学变化。
(5)实验动物在盐酸氯胺酮肌肉注射麻醉下进行手术,旨在尽一切努力,最大限度减轻其痛苦,减少死亡。研究符合1988年国家科委发布实施的《实验动物管理条例》的相关要求。
(6)实验设计执行流程,见图2。
1.4 实验动物 纳入研究的130只SD大鼠130只,体质量250-350 g。
纳入标准:符合如下标准的健康实验动物将被纳入研究:①无传染病;②无营养不良;③体型丰满;④发育正常;⑤被毛浓密、有光泽;⑥眼睛明亮;⑦行动迅速;⑧反应灵敏;⑨食欲良好。
排除标准:符合如下标准的实验动物将被排除研究:①患有疾病;②怀孕。
1.5 样本量 按计量资料每组不少于10只的原则,以及课题组实际经费情况,最终确定实验用SD大鼠数量为130只,每组10只。
1.6 随机分组及盲法 手术开始前,由不参与实验的研究员采用SPSS 18.0软件给每只动物随机分配1个序列号,完成随机分组。行超声和组织学检查者对实验分组盲。
1.7 干预 每只大鼠随机选一肢后足为手术肢,另一肢为对照肢。用10%水合氯醛按3 mL/kg进行腹腔麻醉。常规无菌操作,对全部实验动物手术肢肌腱进行切断。
? (1)第1组不予缝合后足跟腱;
? (2)第2-13组均用3-0尼龙线按Kessler法吻合切断的后足跟腱;
(3)术后第1天起,第8-13组每日轻柔的进行术肢后足跟腱屈伸活动数次,以促进肌腱愈合及减少周围组织粘连。
1.8 高频超声检查 所用的仪器为美国飞利浦XMATRIX iU22型超声诊断仪,L17-5探头。探测时加用水囊衬垫,以使位置浅表的肌腱处于最佳聚焦区。首先在手术前仔细观察每只动物肌腱影像特点以建立正常肌腱的影像概念,并存储、照相。观察第1组肌腱断裂的影像特征,存储、记录,并与对照肢声像进行对比。按分组顺序依次于吻合术后3,7,14,21,35,42 d分别对实验动物进行检查。观察手术肌腱吻合处的超声影像变化,存储并拍摄影像照片。
1.9 组织病理学检查 超声检查结束后,立即将术肢肌腱吻合处及远近各1 cm的肌腱组织取出,并取对照肢正常肌腱组织标本,用体积分数4%甲醛固定,石蜡包埋,纵行切片,苏木精-伊红染色,在光镜下观察各组肌腱组织学表现。
1.9.1 实验中的主要仪器
实验所用主要仪器:
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所用仪器
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仪器型号
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产地
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公司
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石蜡切片机
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RM2235
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德国
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Leica
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电热恒温鼓风干燥箱
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QH01-9030A
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上海
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精宏实验设备
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超纯水系统
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NW10LVF
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香港
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Heal Force
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显微镜
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DP73
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日本
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OLUMPUS
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1.9.2 实验中的主要试剂
实验所用主要试剂:
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试剂名称
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货号
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生产公司
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产地
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二甲苯
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X112051
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国药
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中国
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无水乙醇
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10009218
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国药
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中国
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苏木精
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H8070
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Solarbio
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中国
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曙红Y,醇溶
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S23025101
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国药
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中国
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其他试剂为国产分析纯。
1.9.3 主要配制试剂及其配制方法
主要配制试剂及其配制方法:
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试剂名称
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生产公司
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伊红染液
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伊红(醇溶性)3.5 g溶于1 000 mL 体积分数为95%乙醇,加几滴冰醋酸至半透明状。
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1%盐酸乙醇
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体积分数为70%乙醇99 mL与1 mL浓盐酸混合。
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苏木精
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0.4 g苏木精溶于50 mL无水乙醇,2 g硫酸铝溶于150 mL蒸馏水,二者混匀,加热至沸腾,加入0.1 g碘酸钠和0.2 g柠檬酸,冷却至室温。
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1.9.4 实验步骤
1.9.5 实验中包埋切片技术与方法
(1)脱水:将固定后的组织修好块后自来水流水冲洗 4 h。然后从低浓度乙醇逐渐递升到高浓度乙醇,即由70%(2 h)、80%(过夜)、90%(2 h)、100% I (1 h)、100%Ⅱ(1 h),因体积分数100%乙醇有脆化组织作用,故放置时间不宜太长,放1 h即可。
(2)将组织块放入二甲苯中,直至标本透明为止,时间30 min。
(3)透蜡:将组织块移置二甲苯+石蜡内,放入60 ℃温箱内,时间2 h,使石蜡完全透入组织。
(4)包埋:将溶解的石蜡倒入金属框内,然后将浸蜡组织埋于金属框中央,待冷却后即成坚硬的蜡块。
(5)将标本蜡块装在切片机上,切成5 μm的薄片,然后把切片放在温水皿中展开。
(6)将展开的组织切片移到载玻片上,放在60 ℃温箱中2 h,烘干。
(7)切片脱蜡至水:①将烘烤后的切片取出,放入二甲苯Ⅰ中,15 min;②取出切片架,甩净残液,放入二甲苯Ⅱ中,浸泡15 min;③取出切片架,甩净残液,放入无水乙醇Ⅰ中,浸泡5 min;④取出切片架,甩净残液,放入无水乙醇Ⅱ中,浸泡5 min;⑤取出切片架,甩净残液,依次放入体积分数95%、85%、75%乙醇中,各浓度乙醇中均停留2 min;⑥取出切片架,甩净残液,放入蒸馏水中,浸泡2 min。
1.9.6 实验中的染色方法 ①取出切片架,甩净残液,放入苏木素中,浸泡5 min;②取出切片架,甩净残液,放入蒸馏水中,浸泡5 min;③取出切片架,甩净残液,放入1%盐酸乙醇中,停留3 s;④取出切片架,甩净残液,自来水流水冲20 min;⑤取出切片架,甩净残液,放入蒸馏水中,浸泡2 min;⑥取出切片架,甩净残液,放入伊红染液中,浸泡 3 min。
1.9.7 实验中的脱水、透明、封固方法 ①伊红染后的切片依次浸入体积分数75%、85%、95%的乙醇中,每级停留2 min;②沥干残液,浸入无水乙醇Ⅰ中,浸泡5 min;③沥干残液,浸入无水乙醇Ⅱ中,浸泡5 min;④沥干残液,浸入二甲苯Ⅰ中,浸泡10 min;⑤沥干残液,浸入二甲苯Ⅱ中,浸泡10 min;⑥依次取出切片,擦干周围液体,滴加半滴中性树胶,盖上盖玻片,室温晾干。
1.10 观察指标
1.10.1 主要观察指标 高频超声观察的损伤肌腱修复、愈合情况。
1.10.2 次要观察指标 苏木精-伊红染色检测的损伤肌腱组织病理学表现。
实验主要和次要指标观察时序见表1。
1.11 实验的质量控制 实验旨在以较为经济的人力、物力和时间,最大限度获得丰富而翔实的资料;以科学、规范的数据收集和处理方法,得出准确而可靠的实验结果。实验设计时严格遵从4个基本原则:对照原则、随机化原则、重复原则、均衡性原则。
为保证动物实验的顺利进行和实验结果的可靠性。要
表1 实验主要和次要观察指标
Table 1 Primary and secondary outcome measures
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指数
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术前
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术后
3 d
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术后
7 d
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术后
14 d
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术后
21 d
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术后
35 d
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术后
42 d
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主要观察指标
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高频超声
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X
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X
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X
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X
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X
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X
|
X
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次要观察指标
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苏木精-伊红染色
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X
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X
|
X
|
X
|
X
|
X
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求实验操作人员和实验设施环境条件保障人员相互配合、规范操作、科学管理,尽量避免人为因素造成的误差,确保实验结果的真实、可靠。在进行实验前,按照国家《实验动物管理条例》、《实验动物质量管理办法》、《实验动物许可证管理办法》等相关法规对实验动物从业人员进行要求,搞好岗前培训,以保证实验质量。
1.12 数据管理 动物实验过程中获取的原始资料或各种数据的应用Excel2007进行记录,该记录须遵循清晰、准确、规范的原则。待实验全部结束后,由专人负责检查数据是否完整性和准确性,剔除不完整和不符合要求的数据,并对数据库进行锁定。所有实验数据及研究资料均由中国四平市中心人民医院保存。
1.13 数据传播 实验数据最终将整理成文,发表于同行评议的科学杂志中,出版数据将公开发布于http://www.figshare.com。
1.14 统计学分析 连续正态分布的分类变量以百分率表示。数据的统计学处理应用SPSS 18.0软件完成。组间高频超声观察到肌腱完全愈合/无粘连的动物数量比较采用卡方检验。以P < 0.05为差异有显著性学意义。
中国组织工程研究杂志出版内容重点:组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程