热休克蛋白27在正畸牙张力侧牙周组织中的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.08.009

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
热休克蛋白27(HSP-27)：属于低分子量热休克蛋白家族的成员，Hsp27是一个涉及到药物抗性、细胞生长、细胞凋亡、肿瘤的发生和转移等功能的重要蛋白，Hsp27介导的这些功能可能与其对其它蛋白质的影响有关。细胞在没有受到胁迫时，Hsp27表达量比较低而且主要呈大的聚合体，这种聚合体下的Hsp27一般没有活性。当细胞在受到胁迫时，Hsp27表达量会增加而且会被磷酸化，使Hsp27具有活性，执行其一些功能。蛋白质磷酸化是蛋白质的一种主要修饰方式，Hsp27的磷酸化位点有3个：Ser-15、Ser-78、Ser-82，当Hsp27在这3个位点磷酸化后，大的聚合体就会解聚形成小的四聚体。Hsp27磷酸化主要由MAPKAPK2、MAPKAPK4、PKC、PKD以及cGMP依赖的蛋白激酶来催化完成。
正畸：矫正牙齿、解除错牙和畸形的科学就是正畸。正畸主要研究错牙合畸形是什么表现，分哪些类型，这些错牙合都是什么原因导致的，如何确诊，如何更有效地矫治。口腔正畸学的英文名称来源于3个希腊词根的组合，它们的意思分别是“牙齿”“矫正”“学科”，即大家所说的“矫正牙齿”。但随着这门学科的发展，已不仅仅局限于排齐牙齿，还涉及解决颌骨、颅面的不协调，从而达到面部整体的和谐美。

摘要
背景：在正畸牙移动过程中，在力的作用下，牙周膜生成大量细胞因子，参与牙周组织的改建，使牙齿发生移动，牙槽骨重新塑形。热休克蛋白27就是众多参与牙周组织改建的细胞因子之一。
目的：观察正畸牙移动过程大鼠张力侧牙周组织中热休克蛋白27的表达。
方法：采用NiTi拉簧建立大鼠正畸牙移动模型，力值50 g。分别于加力后1，3，5，7，10，14 d取正畸牙周组织，检测热休克蛋白27在张力侧牙周组织中的表达。
结果与结论：免疫荧光染色显示，正畸加力1 d，牙周组织中热休克蛋白70的表达量增强，至加力后3 d时表达量最大，之后逐渐降低，第5天时回落至初始水平。可以认为，在受到正畸力的初始阶段，即可刺激牙周组织中热休克蛋白27的表达，热休克蛋白27可能参与了张力侧牙周组织的改建。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-8580-9946(聂晶)

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 热休克蛋白, 牙周组织, 正畸牙移动, 新疆维吾尔自治区自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: A large number of cytokines produce in the periodontium on the tension side during orthodontic tooth movement, participate in periodontal remodeling, and make the tooth move to its normal position, thus achieving alveolar remodeling. Heat shock protein 27 (HSP27) is reported to be involved in the periodontal remodeling.
OBJECTIVE: To investigate the expression of HSP27 in the rat periodontium on the tension side during the orthodontic tooth movement.
METHODS: The rat models of orthodontic tooth movement were constructed using NiTi coil spring with the force value of 50 g. The periodontal samples were collected at 1, 3, 5, 7, 10 and 14 days after exerting force to detect the expression level of HSP27 in the periodontium on the tension side.
RESULTS AND CONCLUSION: Immunofluorescence staining results revealed that the expression level of HSP27 in the periodontal tissues began to increase at the 1st day after exerting force, reached the highest level at the 3rd day, and then fell to the initial level at the 5th day. To conclude, HSP27 is evoked by orthodontic force early, and it may play a role in periodontal remodeling.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Heat-Shock Proteins, Tooth, Orthodontics, Tissue Engineeirng

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 1

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引言

热休克蛋白(hat sock poteins，HSPs),是在从细菌到哺乳动物中广泛存在一类热应激蛋白质^[1]。当机体暴露于各种应激状态下，组织中就会激发合成此种蛋白，来保护机体自身^[2]。热休克蛋白是生物体在不良环境因素作用下所产生的一组特殊的蛋白质，它能保护机体(或细胞)不受或少受伤害，这一反应过程称为热休克反应(HSR)^[3]。许多热休克蛋白具有分子伴侣活性。按照蛋白的大小，热休克蛋白共分为5类，分别为热休克蛋白110，热休克蛋白90，热休克蛋白70，热休克蛋白60 以及小分子热休克蛋白^[4]。小分子热休克蛋白的相对分子质量一般在30 000左右^[5]，而热休克蛋白27就是在小分子热休克蛋白中研究最为广泛的一种^[6]。有研究表明，作为分子伴侣蛋白和抗氧化剂，热休克蛋白27在调节细胞凋亡与肌动蛋白细胞骨架重构中可能发挥了抑制作用^[7]。同时，在受到外界刺激下，热休克蛋白27对细胞的不同状态，也会起保护作用或者是反保护作用^[8]。但在非刺激状态下，例如个体生长发育或是细胞分化活跃时，热休克蛋白27在较短的时间内，会出现一个过表达状态，表现为产物增加^[9]。进一步的研究发现，热休克蛋白普遍存在于从原核细胞到高等真核细胞的整个生物界。机体受到应激或其他环境胁迫时，细胞内变性蛋白增多，它们与热应激因子(heat shock factor，HSF)竞争结合热休克蛋白，从而释放HSF，使之形成三体并输入核内与热应答元件结合，启动热休克蛋白表达，随着应激消失，细胞内出现大量游离的热休克蛋白，它们与HSF相结合，并使其脱离DNA序列，最终形成没有DNA结合能力的单体^[10-12]。而最近发现编码热应激蛋白的压力诱导的热休克蛋白70i基因的启动子区域是不压缩的。其由在有丝分裂细胞绑定启动子的转录因子HSF诱导^[13]。

而作为应激反应之一，在正畸力的作用下，牙周组织改建致使牙齿发生移动^[14]，大鼠牙周组织中是否会产生热休克蛋白27，相关研究较少。实验利用大鼠正畸牙移动模型，采用免疫荧光技术，检测热休克蛋白27在张力侧牙周组织中的分布变化情况，初步研究热休克蛋白27在牙周组织改建中的作用机制。

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材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年11月至2016年9月在新疆医科大学第一附属医院口腔医学实验室完成。

1.3 材料

实验动物：健康清洁级雄性10周龄SD大鼠35只，体质量(200±20) g，由新疆医科大学动物中心提供。

主要试剂和仪器：兔抗鼠热休克蛋白27单克隆抗体为Santa-Cruz公司产品；FITC标记的山羊抗兔二抗为北京中杉生物工程公司产品；Olympus光学显微镜；NikonE600免疫荧光显微镜为尼康公司生产。

1.4 方法

1.4.1 实验分组 35只大鼠被随机分为2组：空白对照组5只和实验组30只，实验组根据观察时间点又随机分为6个亚组：造模1，3，5，7，10，14 d组，每组大鼠各5只，按组分笼饲养，自由摄取食物，适应性喂养1周后进行实验。

1.4.2 大鼠正畸牙移动模型的建立实验组大鼠以0.020英寸长的结扎丝绕过左侧上颌第1恒磨牙颈部后，于大鼠第1恒磨牙牙冠颈部用0.012英寸NiTi拉簧的一端结扎固定，将拉簧的另一端用结扎丝“8”字结扎于上颌切牙牙冠颈部，以上颌切牙为支抗，使拉簧伸长，拉第1恒磨牙向前。使用正畸用的弹簧测力计控制拉力值在50 g左右。空白对照组大鼠不放置任何加力装置^[15]。

1.4.3 标本取材于造模1，3，5，7，10，14d时间点处死动物，取所有部磨牙上颌骨的标本，以40 g/L多聚甲醛固定24 h后，0.5 mol/L的EDTA中脱钙6周，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，沿上颌骨标本矢状向切片，切片厚度为5 μm，保存备用^[16]。

1.4.4 免疫荧光染色检测大鼠牙周组织热休克蛋白27的表达二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，体积分数3%过氧化氢溶液室温下孵育20 min，以消除内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗，兔血清封闭；加入兔抗鼠热休克蛋白27单克隆抗体(1∶50稀释) 37 ℃孵育2 h；吸去抗体，PBS冲洗；闭光，加入FITC标记的山羊抗兔二抗，40 min；吸去二抗，冲洗；体积分数30%甘油封固；显微镜下观察。阴性对照采用PBS代替一抗，其余步骤同上。

从每只大鼠的牙槽骨切片中选择3张第1恒磨牙牙根以及牙周组织完整的切片，要求牙周组织中细胞形态完整，结构清晰，组织无损坏。采用尼康E600荧光显微镜，置于高倍镜下，选取每张切片在第1恒磨牙远中舌侧根远中张力区的牙周组织中各随机选取2个视野，观察染色情况并使用Pro-Plus Image6.0分析软件测定平均荧光强度，再将每个样本的3张切片的平均荧光强度值(共计12个)取均值作为该样本热休克蛋白27表达强弱的定量指标，并进行图像采集。

1.5 主要观察指标 ①正畸牙移动模型大鼠的大体表现；②正畸牙移动模型大鼠牙周组织热休克蛋白27的表达。

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讨论

临床上正畸牙受力移动的生物学原理在于，受力后，力通过牙齿传导至牙周膜等牙周组织，引起牙周膜结构改变。牙周膜一侧受到牵拉，形成张力侧，牙周间隙增宽，成纤维细胞增殖并向成骨细胞分化，引起牙槽骨增生以及新骨形成；而另一侧受到压迫，形成压力侧，牙周膜变窄，同时分化出破骨细胞，造成牙槽骨的吸收^[17]。压力侧与张力侧共同作用并保持稳定，就可以使牙齿移动到正常位置并保持下来，形成牙齿的位移牙周组织就可以在新的位置上通过改建重新恢复正常结构、形态和功能^[18]。在这一系列的复杂的生物学反应过程中，大量的细胞因子在牙周膜上参与其中。目前已被研究证实的相关生物信号分子就有前列腺素(PGs)、白细胞介素(ILs)、骨保护素(OPG)、破骨细胞分化因子(RANKL)等^[19-20]。有研究表明，破骨细胞在受力状态下，并不直接发生生物学反应，而是由成骨细胞表达分泌一系列破骨细胞分化调控蛋白,从而间接参与破骨细胞分化成熟及相关功能调节^[21-23]。因此，在压力侧牙周组织中研究与骨改建因素有关的细胞因子，就尤为重要。

热休克蛋白是生物体内最古老的分子之一，是广泛存在于生物界从原核到真核细胞中的一类具有高度保守性的蛋白质，在受到高温等恶劣环境(如高热、感染、缺血、缺氧及化学物质等)袭击或外界刺激时，就会被大量合成，从而维持细胞正常的生理活动，阻止影响细胞健康的蛋白质相互作用，促进有利于组织结构健康的相互作用^[24-25]。这样，不同蛋白质间就会形成稳定而有效的联系机制，极端条件下可极大地减轻对组织的损害^[26]。因而可以认为应激时热休克蛋白在细胞内的出现标志着细胞自身保护机制的启动。

热休克蛋白27是相对分子质量仅为27 000的小分子量热休克蛋白，作为分子伴侣，其本身不直接发挥生物学效应，而是参与抑制细胞凋亡、细胞发育调控和细胞分化、肌动蛋白细胞骨架重构以及各种生物学信号转导^[27-31]。

从本研究中可以看出，在受到张力刺激的早期，在加载应力的第1天至第3天，张力侧牙周组织中即可持续分化出大量热休克蛋白27，这可能与热休克蛋白27在早期就参与维持肌动蛋白丝的稳定以及调节相关微丝之间的平衡动力活性，继而维护牙周的组织中细胞的完整性有密切的关系^[32-34],而经过磷酸化的热休克蛋白27对成骨细胞的矿化具有明显刺激作用^[35-36]。

有学者研究证实，当大鼠的牙周组织加载机械应力后，张力侧牙周组织即可表达热休克蛋白27^[37]，其作用在于参与了维护组织牙周组织内环境的稳定，这与本研究的结果基本一致。这也表明，热休克蛋白27可以作为成骨细胞的激活和维持稳态的分子伴侣^[38]。随着加力的进行，大鼠张力侧牙周组织中热休克蛋白27的表达量逐渐降低,可能是因为存在某种负反馈机制，当热休克蛋白27表达量增大时，反而抑制热休克蛋白27进一步表达，从而达到稳定并修复张力侧组织中受损的细胞骨架蛋白结构，刺激成骨活动，促进牙槽骨的增生，调节牙周细胞肌丝活动,保护牙周膜生物学活性^[39-42]。而热休克蛋白27在正常和应激状态下均参与维持肌动蛋白丝的稳定性及调节微丝的动力,从而维护了细胞的完整性^[43]。

实验结果表明，热休克蛋白27在正畸牙移动的张力侧牙周组织中，随着加载时间的延长，有着不同程度的表达。提示热休克蛋白27可能参与了牙周膜细胞损伤、细胞修复以及牙周组织改建过程，充分反映出热休克蛋白27在大鼠正畸牙移动的组织改建过程中具有重要的作用。

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