亲骨荧光素间接标记软骨内成骨的早期血管新生

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.08.008

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (8): 1192-1196.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.08.008

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亲骨荧光素间接标记软骨内成骨的早期血管新生

吴涛，刘英超，郭志旺，吕军，邢建洲，侯兵

广州医科大学附属武警广东省总队医院，广东省广州市 510507

收稿日期:2017-02-16 出版日期:2017-03-18 发布日期:2017-04-14
通讯作者: 侯兵，硕士，医师，广州医科大学附属武警广东省总队医院，广东省广州市 510507
作者简介:吴涛，男，1979年生，湖南省岳阳市人，汉族，2009年南方医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事骨组织工程方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81303107)；广东省自然科学基金(S2012040006295)；广东省医学科研基金(A2012499；A2014499)

Bone affinity fluorescein indirectly marks early angiogenesis during endochondral ossification

Wu Tao, Liu Ying-chao, Guo Zhi-wang, Lv Jun, Xing Jian-zhou, Hou Bing

Guangdong General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510507, Guangdong Province, China

Received:2017-02-16 Online:2017-03-18 Published:2017-04-14
Contact: Hou Bing, Master, Physician, Guangdong General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510507, Guangdong Province, China
About author:Wu Tao, M.D., Attending physician, Guangdong General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510507, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81303107; the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. S2012040006295; the Medical Science Research Foundation of Guangdong Province, No. A2012499 and A2014499

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
亲骨荧光素：指能够与骨组织中钙离子特异性结合的荧光染料，比较常用的有四环素、茜素络合酮、钙黄绿素等，注入体内后，可以与骨组织尤其是新生的骨组织相结合。经硬组织切片后，由特定波长激发，可在荧光显微镜下将示踪的骨组织呈现出来。
间接标记新生血管：在软骨内成骨过程中，新骨往往优先沉积于血供和氧供丰富的血管周围，利用这一特性，采用亲骨荧光素标记新生骨组织，可达到间接标记新生血管的目的。

摘要
背景：虽然当前有多种方法可以观察和检测软骨内成骨早期血管新生，但是均存在一定的不足。
目的：探讨四环素和茜素络合酮间接标记软骨内成骨过程中新生血管的可能性。
方法：制备新西兰兔双侧桡骨骨缺损模型并植入β-磷酸三钙材料，分别于术后第1天和第15天注射四环素和茜素络合酮，第28天取材。部分标本在墨汁灌注后行硬组织切片荧光/光学显微镜观察，部分标本经脱钙后行免疫组化染色观察，比较软骨内成骨过程中亲骨荧光素标记管腔结构与免疫组化、墨汁灌注标记血管结构的一致性。
结果与结论：①亲骨荧光素标记的管腔结构经免疫组化染色证实为CD34阳性的血管结构；②在荧光显微镜下，亲骨荧光素标记的血管形态与墨汁灌注的血管形态一致；荧光素标记后经墨汁灌注的血管在荧光显微镜下可见荧光管腔中有黑色墨汁走行；③此外，亲骨荧光素标记的管腔结构颜色绚丽、三维结构更加生动，可通过不同颜色的荧光显示不同时期的血管新生和演变过程，具有独特的优势，可用于软骨内成骨早期血管发生的形态学检测。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-4970-8686(侯兵)

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 四环素, 茜素络合酮, 荧光, 软骨内成骨, 血管, 组织切片, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: There are various methods to observe and detect early angiogenesis in the process of entochondrostosis, but each holds certain deficiencies.
OBJECTIVE: To explore the possibility of tetracycline and alizarin complexone as an indirect marker of angiogenesis in the process of entochondrostosis.
METHODS: New Zealand white rabbit models of bilateral radial bone defects were prepared, followed by β-tricalcium phosphate implantation, and then given the injection of tetracycline and alizarin complexone at 1 and 15 days, respectively. Samples were collected at 28 days, some of which were observed using fluorescence/light microscope after ink perfusion and hard tissue slicing, and the others were decalcified and observed using immunohistochemistry. The uniformity between lumen structures labeled with bone affinity fluorescein and vascular structures marked by immunohistochemistry and ink perfusion was compared.
RESULTS AND CONCLUSION: The lumen structure labeled with bone affinity fluorescein was confirmed to be a CD34 positive vascular structure. Under the fluorescence microscope, the bone affinity fluorescein labeled vascular morphology was consistent with ink perfusion-labeled, and black ink lines could be observed in the lumen structures labeled with bone affinity fluorescein after ink perfusion. In addition, the color of the lumen labeled with fluorescein was more gorgeous, three-dimensional structure more vivid, and the vascular evolution process distinguished more easily by different fluorescein colors, exhibiting unique advantages. Therefore, it is available to detect the early angiogenesis in the process of entochondrostosis

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Tetracycline, Fluorescence, Cartilage, Blood Vessels, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

吴涛，刘英超，郭志旺，吕军，邢建洲，侯兵. 亲骨荧光素间接标记软骨内成骨的早期血管新生[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(8): 1192-1196.

Wu Tao, Liu Ying-chao, Guo Zhi-wang, Lv Jun, Xing Jian-zhou, Hou Bing. Bone affinity fluorescein indirectly marks early angiogenesis during endochondral ossification[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(8): 1192-1196.

图/表（结果） 2

2.1 亲骨荧光素标记的管腔结构CD34标记阳性由图1可知，在荧光显微镜下，亲骨荧光素标记的组织呈现出管腔样结构，其中术后第1天四环素标记的组织呈黄色荧光，术后第15天茜素络合酮标记的组织呈现红色荧光，并环绕于黄色荧光周围(图1A，C)。这代表了软骨内成骨期间不同时间段的新骨沉积。免疫组化观察表明，软骨内的管腔结构CD34标记阳性(图1B，D)，二者具有一致性，这说明荧光素标记的钙化组织属于离血管最近的新生骨组织，通过对新骨的示踪可间接标记血管的发生。

2.2 墨汁灌注可在亲骨荧光素标记的管腔结构中显影图2A显示了亲骨荧光素标记的单一血管形态，与墨汁灌注标记的血管形态基本一致(图2B)；经墨汁灌注后的新生血管呈现出网络交织的外观(图2C)，在荧光显微镜下，可见墨汁充盈于黄色荧光标记的管腔结构中央(图2D)，二者具有一致性，这说明在荧光标记的管腔结构中走行的为物理结构的血管组织。图2E是墨汁灌注后软骨内成骨过程中的Masson染色组织切片。图中显示墨汁灌注标记的血管走行于管腔结构的中央，在其周围呈现出环形的红染胶原结构，这代表了最早期的新骨沉积，大量绿色胶原填充于各管腔结构的间隙，代表了后期形成的骨组织及尚未骨化的软骨组织。结合图2A，D，这说明骨组织的沉积是从中央血管周围开始向四周软骨逐渐发生的，标记新生钙化组织能够间接显示软骨内新生的血管结构。

2.3 亲骨荧光素可标记不同阶段的新生血管结构软骨内的血管新生是一个动态的过程，随着时间的推移，血管不断成熟并向深部侵入。伴随着新生血管的侵入，新骨也在其周围沉积。图3A中，术后第15天茜素络合酮标记的红色荧光组织接续术后第1天四环素标记的黄色荧光组织，并形成了新的管腔结构；图3B中，大量黄色荧光沉积于β-磷酸三钙材料外围，这代表了术后第1-14天的血管发生情况。红色荧光环绕在黄色荧光外围，这代表了术后15 d新形成的板层骨，之后红色荧光接续黄色荧光向β-磷酸三钙材料中长入，并单独形成了纤细的管腔样结构，这说明术后第15-28天有新的向材料中侵入的血管生成。这说明在不同时间点采用不同颜色的亲骨荧光素标记新骨可反映不同时间段血管组织的新生。

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引言

材料方法

1.1 设计组织学观察实验。

1.2 时间与地点于2016年6至10月在华南农业大学实验动物中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物动物实验方案经广州医科大学附属武警医院伦理委员会审议通过。雄性新西兰大白兔10只，体质量(2.0±0.2)kg，普通级，购于广东省医学实验动物中心，合格证号：1606031。相对湿度40%-60%，22 ℃恒温室内饲养，饲料喂食，自由饮水。

1.3.2 主要试剂及仪器四环素、茜素络合酮购于广州速研生物科技有限公司；Φ4 mm×15 mm β-磷酸三钙支架材料购于上海贝奥路生物材料有限公司，批号：20140414；戊巴比妥钠购于上海科丰化学试剂有限公司；抗兔CD34抗体和SABC试剂盒购于武汉博士德公司；中华墨汁购于北京一得阁墨业有限公司；Masson染液购于上海哈灵生物科技有限公司；SP1600硬组织切片机和RM2235石蜡切片机为德国Leica公司产品；4500型倒置相差/荧光显微镜为日本 Nikon公司产品。

1.4 实验方法

1.4.1 动物造模大白兔适应性饲养1周后，耳缘静脉缓慢推注戊巴比妥钠(40 g/kg)持续麻醉，于双侧桡骨中段切开骨膜并截骨，制作长度为1.5 cm的骨缺损模型^[8]，植入 β-磷酸三钙缝合骨膜。

1.4.2 荧光标记早期血管发生术后第1天在动物背部肌肉注射四环素(2.5 mg/kg)，第15天注射茜素络合酮 (2.5 mg/kg)，于术后第28天依据实验要求处死动物并取材。

1.4.3 荧光显微镜和免疫组化观察血管发生按随机数字表法选取5只动物(10例)标本纵向剖开，一半经固定后，进行硬组织切片，荧光显微镜470-490 nm波长观察新生骨内血管发生情况。另一半经固定后脱钙，常规石蜡切片，按SABC试剂盒说明书行免疫组织化学染色检测CD34。苏木精轻度复染，分化，反蓝。用已知各抗原阳性表达的切片做阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

1.4.4 墨汁灌注法观察血管发生参考文献[12]的方法配置墨汁灌注液，并水浴至38 ℃备用。选取5只动物，肝素肌注(1 000 U/kg)后在双前肢游离肱动、静脉并离断。快速向肱动脉远端推注大量肝素生理盐水(25 U/mL)冲洗直至肱静脉流出清亮液体为止，再向肱动脉注入墨汁灌注液至肱静脉流出黑色液体，处死动物，取下骨缺损部位，4 ℃放置过夜，继用体积分数10%的甲醛溶液固定2周。纵向剖开标本，一半经硬组织切片后行荧光显微镜和光学显微镜观察，另一半经脱钙、固定后脱钙，常规石蜡切片，行Masson染色观察，光学显微镜拍照记录。

1.5 主要观察指标于术后28 d，比较同一标本在荧光显微镜下和光镜下免疫组化染色时的血管形态，比较墨汁灌注后的同一标本在荧光显微镜下和光镜下的血管形态，并通过Masson染色判别墨汁灌注后血管周围成熟骨纤维的生长情况。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

软骨内成骨是骨折修复过程中骨痂形成的主要机制^[13-15]。骨折后，两骨折端因出血形成血肿，引起无菌性炎症，并凝成血块、逐渐机化，间充质干细胞大量聚集和增殖。然而由于新生血管长入速度较慢，局部出现血供上的相对不足，间充质细胞向代谢需求量较低的软骨细胞转化，形成纤维软骨，之后软骨细胞出现增殖肥大、变形坏死(凋亡)和钙化基质退变。随着时间的推移，巨噬细胞侵入吞噬，血管延伸进入，大量未分化细胞随毛细血管到达并分化为成骨细胞，在钙化软骨的残基上沉积新骨。随着新骨含量的增加，纤维软骨组织逐渐替代为骨组织，此即软骨内骨化过程^[14-19]。从早期来看，新骨必定是在血供和氧供丰富的条件下，即邻近血管的条件下才能形成。基于这一病理生理学基础，对新生骨组织进行标记将能够间接显示血管的发生。

亲骨荧光素是指能够与骨组织中钙离子特异性结合的荧光染料，比较常用的有四环素、茜素络合酮、钙黄绿素等^[20-22]，注入体内后，可以与骨组织尤其是新生的骨组织相结合^[23-24]。硬组织切片后，经特定波长激发，可在荧光显微镜下将示踪的骨组织以不同的颜色呈现出来，其中四环素标记的骨组织呈黄色，茜素络合酮呈红色、钙黄绿素呈绿色。其亲骨原理主要与荧光素的分子结构有关^[25]。以四环素为例，与骨结合时，其多环结构的一侧垂直接近羟基磷灰石表面，每个四环素分子的C₁₀-酚羟基，C₁₂-烯醇羟基以及C₂-酰胺基上的3个氧原子与1分子羟基磷灰石中的Ca²⁺络合，形成3个配位键，从而确保了四环素和骨组织之间强大的吸附力^[26]。这一特性使得采用亲骨荧光素标记软骨内成骨过程中新生血管周围的骨组织成为了可能。

Masson染色是脱钙骨组织切片常用的染色方法，但是骨胶原对其染色反应并不均一，成熟骨组织中的胶原着鲜红色，而幼稚骨组织中的胶原着绿色。原因主要与成熟骨组织中老化胶原的交联程度增加和排列更为致密有关^[27]，这使得新旧骨基质被水溶性的苯胺蓝和丽春红分别染色^[28]。Masson染色的这一特点可以用来评价骨质的成熟程度，特别是在骨缺损的修复过程中，可以作为评价骨痂成熟程度的指标，即红色着染的比例越多，骨痂越成熟^[28-32]。从本研究来看，图2E中墨汁灌注标记的血管走行于管腔结构的中央，在其周围呈现出环形的红染矿化结构，这说明，骨组织的沉积是从中央血管周围开始向四周软骨逐渐发生的。因此对血管周围的最早出现的骨组织进行标记就能够反映血管的发生。结合本研究的其他结果，亲骨荧光素标记的条带状管腔结构在免疫组化染色证实为CD34阳性的血管结构(图1)；在荧光显微镜下，四环素和茜素络合酮标记的血管形态与墨汁灌注的血管形态一致(图2A、B)；荧光素标记后经墨汁灌注的血管在荧光显微镜下可见荧光管腔中有黑色墨汁走行(图2C、D)，这些都说明，虽然属于间接示踪，但是亲骨荧光素标记的管腔结构为新生的血管结构。

血管新生是一个动态演变的过程，在骨折愈合的不同阶段，单位组织内的血管密度和血管长度都是不同的。采用常规组织学切片和染色、免疫组化检测、硬组织切片中的墨汁灌注、血管铸形方法往往只能显示某时间点血管已经存在的情况，不能动态显示血管的生长过程。本研究在不同时间点使用颜色不同的亲骨荧光素，通过其与不同时间段的钙化组织结合，可在同一张切片中通过不同的荧光颜色区分出不同阶段新生的血管。这就使原本静态的血管形态，呈现出被荧光记录的动态改变。

普通组织学切片的厚度为5-10 μm，以确保组织能够在平面上得以良好染色和观察。硬组织切片的厚度为100-150 μm，磨片后的厚度约50 μm，较普通组织学切片更厚、更加立体。理论上讲厚度越大的组织包含的信息量更大。虽然厚切片在普通光学显微镜下会丢失更好的观察效果，但是在荧光显微镜下，荧光素标记的管腔结构分辨率好、外观细腻，并可显示出良好的三维立体结构和管腔全貌，这是其相比传统的“平面化”组织学切片的优势。

在其他研究中，亲骨荧光素主要被用来标记新生的骨组织，使用剂量为25 mg/kg，本实验中的药物剂量为 2.5 mg/kg，仅为其1/10。一方面是因为软骨内新生血管旁的钙化组织量极少，对荧光素的需求量少；另一方面在于肌注亲骨荧光素不易被完全吸收，肌肉组织中长期残留的荧光素会形成一个体内的荧光素污染源，导致新生管腔周围组织被反复标记，在荧光显微镜下切片中的各种荧光乱作一团，新生管腔与旧管腔难以区分，实验结果混乱不堪。

综上所述，采用亲骨荧光素标记的软骨内新生血管结构与经典的免疫组化、墨汁灌注方法具有一致性；在荧光显微镜下，其颜色更绚丽、管腔结构更生动，并能够通过不同颜色的荧光区分不同时期的血管新生和演变过程。虽然为间接标记方法，但是该方法具有独特的优势，可用于软骨内成骨早期血管发生的形态学检测。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Bone affinity fluorescein indirectly marks early angiogenesis during endochondral ossification

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