人胎盘胎儿侧间充质干细胞无血清培养上清的抗氧化活性分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.05.020

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (5): 773-779.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.05.020

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

人胎盘胎儿侧间充质干细胞无血清培养上清的抗氧化活性分析

付雪^1，2，张玉洁^1，2，严秀蕊²，马晓娜²，刘晓明²，魏军^1，2

1宁夏医科大学临床医学院，宁夏回族自治区银川市 750003
2宁夏医科大学总医院人类干细胞研究所，宁夏回族自治区银川市 750004

出版日期:2017-02-18 发布日期:2017-03-20
通讯作者: 魏军，硕士，宁夏医科大学临床医学院，宁夏回族自治区银川市 750003；宁夏医科大学总医院人类干细胞研究所，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:付雪，女，1991年生，天津市人，汉族，宁夏医科大学在读硕士。
基金资助:
国家自然科学基金(81460247)

Anti-oxidative activities of supernatants of human fetal placental mesenchymal stem cells cultured in serum-free medium

Fu Xue^{1, 2}, Zhang Yu-jie^{1, 2}, Yan Xiu-rui², Ma Xiao-na², Liu Xiao-ming², Wei Jun^{1, 2}

1Clinical Medicine College, Ningxia Medical University, Yinchuan 750003, Ningxia Hui Autonomous Region, China
2Ningxia Human Stem Cell Institute, Affiliated Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Online:2017-02-18 Published:2017-03-20
Contact: Wei Jun, Master, Clinical Medicine College, Ningxia Medical University, Yinchuan 750003, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Ningxia Human Stem Cell Institute, Affiliated Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Fu Xue, Studying for master’s degree, Clinical Medicine College, Ningxia Medical University, Yinchuan 750003, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Ningxia Human Stem Cell Institute, Affiliated Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81460247

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
人胎盘胎儿侧间充质干细胞无血清培养上清：是从人胎盘胎儿侧组织中提取间充质干细胞，使用无血清培养基进行原代及传代培养，待细胞生长密度达80%时收集的培养基。
氧化应激：而当机体遭受外界刺激时，这种稳态被打破，活性氧的产生大于机体自我清除能力，由此，多余的活性氧就会对机体造成一定的损伤，称其为氧化应激。

摘要
背景：目前关于间充质干细胞的研究大多集中于其免疫调节功能，而关于细胞和培养上清的其抗氧化能力的研究较为少见。
目的：观察人胎盘胎儿侧间充质干细胞在无血清培养条件下，其上清的抗氧化能力。
方法：采用无血清培养基培养胎儿侧胎盘间充质干细胞，分别于48 h收集P2-P6代细胞培养上清。在空白培养基中添加维生素C 100 μmol/L作为阳性对照。检测P2-P6代人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清的总抗氧化能力、清除活性氧自由基的能力和抗氧化酶活性。
结果与结论：①抗氧化能力：各代次人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清具有一定的抗氧化能力，且不同代次间的上清具有一定的差异，其中总抗氧化能力与40-80 μmol/L 的维生素C相当，各代次上清均具有一定的清除二苯基苦基苯肼自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基等自由基清除能力；②抗氧化酶活性分析：各代次间的人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清中均可以检测到一定水平的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性；③结果提示，在无血清条件下培养胎儿侧胎盘间充质干细胞的上清具有一定的抗氧化能力和抗氧化酶的活性。人胎盘胎儿侧间充质干细胞的抗氧化能力与其旁分泌机制有关，但其中的抗氧化成分及分子机制有待进一步的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-2443-026X(魏军)

关键词: 干细胞, 分化, 胎盘, 胎儿侧, 间充质干细胞, 无血清培养, 培养上清, 抗氧化, 自由基清除, 抗氧化酶, 旁分泌, 无细胞治疗, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Current research on mesenchymal stem cells (MSCs) is mostly focused on its immune
regulatory function, while little is reported on the antioxidant capacity of the cells and culture supernatant.
OBJECTIVE: To investigate the anti-oxidative capacity of the supernatant harvested from human fetal placenta MSCs (fPMSCs) under a condition of serum free culture.
METHODS: fPMSCs were cultured with serum free media, and the supernatants of cells at passages 2-6 were collected at 48 hours after culture. Vitamin C was added into the culture medium, as a positive control, and its concentration was 100 μmol/L. The total antioxidant capacity, scavenging capacity of free radicals and antioxidant enzymatic activities of supernatants were measured.
RESULTS AND CONCLUSION: By comparing anti-oxidative activities of vitamin C and naïve culture medium, supernatants collected from fPMSCs cultures exhibited obvious antioxidant capacities at different extents between passages of cell cultures. The total antioxidant capacity of the culture supernatant was comparable to 40-80 μmol/L vitamin C. In addition, all supernatants derived from cells with different passages displayed capacities to scavenge free radicals, including 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical (DPPH•), hydroxyl radical (•OH), superoxide anion radical (O2-). Even more, activities of antioxidant enzymes, including superoxide dismutase and glutathione peroxidase, were also detected in supernatants collected from different passages of fPMSCs. Under the serum-free condition, the culture supernatants of fPMSCs have antioxidant capacities at certain extent. However, the antioxidant components and underlying mechanisms need to be further studied.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: stem cells, Culture supernatant, Anti-oxidative activities

中图分类号:

R394.2

付雪，张玉洁，严秀蕊，马晓娜，刘晓明，魏军. 人胎盘胎儿侧间充质干细胞无血清培养上清的抗氧化活性分析[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(5): 773-779.

Fu Xue, Zhang Yu-jie, Yan Xiu-rui, Ma Xiao-na, Liu Xiao-ming, Wei Jun. Anti-oxidative activities of supernatants of human fetal placental mesenchymal stem cells cultured in serum-free medium[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(5): 773-779.

图/表（结果） 3

2.1 维生素C的总抗氧化能力的标准曲线 维生素C可参与人体内的多种代谢过程，是维持生命不可缺少的水溶性维生素。维生素C也是一种公认的天然抗氧化剂，在体内可以影响细胞信号转导和调节细胞增殖和凋亡之间的平衡^[9]。因此实验选取维生素C作为实验的阳性对照，在总抗氧化能力的检测中首先检测不同浓度维生素C的总抗氧化能力，为自由基清除实验以及抗氧化酶活性测定实验选取合适的维生素C浓度。而实验结果显示维生素C总抗氧化能力随浓度增高而上升，且趋势呈线性(图1)。

2.2 人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清的总抗氧化能力 上清中的抗氧化物质可以将Fe³⁺还原成Fe²⁺，后者可与菲啉类物质形成稳定的络合物，通过比色法测定出其抗氧化能力的高低。此实验中，各代次上清均具有一定的的总抗氧化能力，且各代次之间的总抗氧化能力存在一定趋势，以P3-P4代总抗氧化能力较高。与空白对照组相比，差异均具有统计学差异(P < 0.01或P < 0.05；图2A)。与维生素C的总抗氧化能力的标准曲线对比可见，人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清的总抗氧化能力相当于40-80 μmol/L维生素C。

为了消除不同时间测定以及不同试剂盒的组间差异，实验将各代次上清总抗氧化能力的绝对值与同组100 μmol/L维生素C进行对比，求出比值(图2B)，而所得结果与使用绝对值的统计结果类似，由此可知实验重复性较好，可信度较高。

2.3 人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清对DPPH自由基清(DPPH•)除能力 DPPH•是一种以氮为中心的自由基，含有一个单电子，在517 nm处有强烈的吸收峰，其乙醇溶液呈深紫色，加入培养上清后，测定清除DPPH•而引起的吸光度的减少可以反映其抗氧化能力的强弱。实验结果显示不同代次的培养上清均具有一定的清除DPPH·的能力，以P3及P6代清除率较高，且各组清除率绝对数值均超过维生素C组。除P2代外，其清除率与空白对照组相比存在显著差异(P < 0.01或 P；图3A)。通过将人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清对DPPH•的清除率对比求出比值后发现结果类似(图3B)。 < 0.05

2.4 人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清抑制O₂^-的活力单位 此实验模拟机体中黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应系统，产生超氧阴离子自由基，加入电子传递物质及gress显色剂，使反应体系呈现紫红色，可用分光光度计测其吸光度。实验的结果显示格代次上清中抑制O₂^-的能力以P2及P5代抑制作用较强，其绝对值与空白对照组相比均存在显著差异(P < 0.01；图4A)，且消除组间差异后，结果类似(图4B)。

2.5 人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清抑制羟自由基 (•OH)活力单位 羟自由基是一种氧化能力很强的自由基，其性质很活泼，氧化各种有机物和无机物的速率极快，是造成组织脂质过氧化、核酸断裂、蛋白质和多糖分解的主要因素，与人体衰老、肿瘤、辐射孙损伤和细胞吞噬能力有关。因此，清除羟自由基对抗氧化具有重要意义。实验显示各代次上清对O²^-的均具有抑制作用，与空白对照组相比均差异存在显著性意义(P < 0.01)，但从绝对值上看，各代次间无差异(图5A，B)。

2.6 人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清超氧化物歧化酶活力 超氧化物歧化酶是人体内清除超氧阴离子自由基的酶，在维持机体自由基平衡上有重要作用。实验通过模拟黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测定其吸光度。当被测样本中含超氧化物歧化酶时，则亚硝酸盐减少，比色管吸光度值降低。实验显示，除P3，P4代外各代次上清超氧化物歧化酶活力与空白对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05；图6A)，但消除了组间差异后，P3，P4代上清超氧化物歧化酶活力与空白对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05；图6B)。

2.7 人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清谷胱甘肽过氧化物酶活力 谷胱甘肽过氧化物酶是人体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解的酶，它特异地催化还原型谷胱甘肽对氢过氧化物的还原反应。一般认为它在细胞内能清除有害的过氧化物代谢产物，阻断脂质过氧化链锁反应，从而起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。实验显示除P6代外，各代次上清谷胱甘肽过氧化物酶活力与空白对照组相比存在显著差异(P < 0.01；图7A)，消除了组间差异后结果也类似(图7B)。

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引言

人体在有氧呼吸的过程中会通过线粒体途径产生一系列的活性氧簇，在正常生理状况下，人体活性氧的产生与清除处于一种动态平衡状态，机体内会产生抗氧化酶类物质清除活性氧簇对机体带来的氧化损伤^[1]。而当人体遭受外界刺激时，这种稳态被打破，活性氧的产生大于人体自我清除能力，由此，多余的活性氧就会对机体造成一定的损伤，称其为氧化应激。氧化应激对机体产生负面作用，会介导细胞凋亡以及一系列相关疾病的发生^[2]。故在针对一系列氧化应激所导致的疾病中，清除活性氧自由基、恢复机体稳态成为关键性内容。

间充质干细胞，作为成体干细胞的一种，以及被证实具有多种潜能。而实验所研究的人胎盘胎儿侧间充质干细胞(human fetal placenta mesenchymal stem cells，fPMSCs)，与其他来源的间充质干细胞相比，具有来源易得，取材方便等特征。目前得到较多研究和应用的是其多项分化潜能及免疫调控能力。有研究显示，间充质干细胞的调控功能主要基于其旁分泌作用。将间充质干细胞输注到损伤的动物模型体内，一系列的细胞因子就会释放到外周，并作用于相关的组织或器官中，起到免疫调控及损伤修复的作用^[3-4]。而对于间充质干细胞的应用，除了调控免疫和修复组织之外，也有一些研究发现其在实验动物体内还可以起到一定的抗氧化作用，通过收集检测动物外周血的相关指标，研究者发现间充质干细胞可以降低脂质过氧化物产生、促进抗氧化酶类物质的产生。但体内的内环境比较复杂，无法判定其抗氧化作用是否起到了修复组织的作用，故一些研究者通过体外实验，利用间充质干细胞条件培养基对损伤细胞进行干预^[5-7]，发现其同样起到了减轻氧化应激的作用。通过此类的实验研究，作者推测体外培养的间充质干细胞发挥抗氧化作用主要通过将有效的抗氧化物质分泌到其培养上清中，且在保存得当的情况下，此类活性物质能在体外再次发挥抗氧化作用。而以往的实验大多使用含血清的培养基培养间充质干细胞，而无法区分其抗氧化作用是来源于本身添加的血清还是间充质干细胞分泌的活性物质。

本课题组一直采用无血清培养胎盘胎儿侧间充质干细胞，其细胞形态正常、表型稳定。故实验旨在检测间无血清培养的胎盘胎儿侧间充质干细胞是否其有效的抗氧化成分分泌到其培养上清中，从而证实实验推测，并为后期的实验提供依据。

材料方法

1.1 设计 细胞学实验。

1.2 时间及地点 于2016年4月至9月在宁夏医科大学总医院人类干细胞研究所完成。

1.3 材料 人胎盘取自宁夏医科大学总医院行剖宫产的健康产妇，经医院伦理学委员会批准且获得孕妇及家属知情同意。

1.4 实验方法

1.4.1 人胎盘胎儿侧间充质干细胞的培养及上清收集 复苏P1代人胎盘胎儿侧间充质干细胞至培养皿中，使用无血清培养基培养(美国Stem Cell公司)至80%融合后收集上清，将细胞部分冻存后进行传代。将人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养至P6代，每代次培养时间为48 h，细胞生长密度达80%时收集上清，离心去除杂质及细胞碎片后按需分装后，于-80 ℃冰箱冻存，进行后续检测。

1.4.2 不同浓度维生素C及不同代次上清总抗氧化能力(T-AOC)的检测：使用分析纯维生素C和双蒸水配制维生素C母液，即C母=1 000 μmol/L。再按照表1配制不同浓度的维生素C溶液，溶剂为间充质干细胞完全培养基。然后利用总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒检(南京建成生物工程研究所有限公司)测各浓度维生素C样品以及不同代次上清的总抗氧化能力。实验重复3次。

1.4.3 人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清自由基清除能力的测定 利用抑制与产生超氧阴离子自由基测定试剂盒对不同代次上清清除超氧阴离子自由基(O₂^-)能力进行检测。利用羟自由基测试试剂盒对不同代次上清清除羟自由基(•OH)能力进行检测。对二苯基苦基苯肼自由基(DPPH•)自由基清除率的测定，方法参照文献[8]。实验以间充质干细胞培养基作为空白对照，以100 μmol/L 维生素C作为阳性对照，同时检测3个不同个体的上清样本，且每个个体平行测定3次，即n=9。

1.4.4 人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清抗氧化酶活力的测定 分别利用超氧化物歧化酶(SOD)分型测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒对不同代次上清的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶酶活性进行检测。实验以间充质干细胞培养基作为空白对照，以100 μmol/L维生素C作为阳性对照，同时检测3个不同个体的上清样本，且每个个体平行测定3次，即n=9。

1.5 主要观察指标 ①不同浓度维生素C的总抗氧化能力；②人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清对DPPH，O₂^-，•OH自由基的清除能力；③人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶酶的活性。

1.6 统计学分析 实验数据以x(_)±s表示，采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，组间数据差异的比较采用两样本t 检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

氧化应激近年来的研究认为其是慢性心衰^[10]、阿尔茨海默病^[11]、动脉粥样硬化、糖尿病^[12]、系统性红斑狼疮及癌症等一系列疾病的始动因素^[13]。人体在遭受氧化损伤后，由于氧化应激作用会产生活性氧簇，进而引发上述一系列疾病^[14]。或许可以推测，如果临床上的治疗可以针对于清除多余的氧化自由基，减轻机体的氧化应激损伤，或许可以从源头上根治与其相关的难治性疾病。而近年来，关于间充质干细胞的研究不仅局限于其自身，还在于其强大的旁分泌效应，有研究表明^[15]，间充质干细胞发挥的免疫调节作用主要是由于其分泌细胞因子和生长因子等小分子物质，通过调控免疫信号通路，对周围的损伤组织起到了修复作用^[16-17]。而除了其免疫调控作用之外，一些体内实验还证实，通过尾静脉输注间充质干细胞，可以减轻脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤，降低其氧化应激作用^[18]。也有实验证实了间充质干细胞的培养也对氧化损伤的细胞具有保护作用^[19]。正是由于在临床上氧化应激问题以及相关疾病亟待解决和治疗，且应用间充质干细胞治疗可以在一定程度上减轻这种氧化应激作用，修复受损组织器官，所以本课题组将间充质干细胞的研究重点转化到了关于间充质干细胞的抗氧化功能上。

实验结果显示，胎盘胎儿侧间充质干细胞的无血清培养上清存在一定的抗氧化能力，且可以检测到一定抗氧化酶类物质的活性。而本研究采用无血清培养基培养胎盘胎儿侧间充质干细胞，在其培养过程中保证了间充质干细胞质量，同时排除了血清本身具有抗氧化能力的干扰，由此收集上清所测得各指标均能真实反映其分泌的抗氧化物质的活性。实验选取阳性对照(100 μmol/L 维生素C)在总抗氧化能力上率高于培养上清的总抗氧化能力，而在自由基清除实验和抗氧化酶类物质活性检测实验中，实验发现某些代次上清的清除能力以及抗氧化酶活性高于100 μmol/L 维生素C，如DPPH自由基清除实验以及谷胱甘肽过氧化物酶活力的检测。其原因可能是由于维生素C抗氧化作用原理与间充质干细胞培养上清之间存在差异，而本研究只限于探究其是否存在抗氧化能力，而具体的抗氧化成分及作用机制还无从得知。除此之外，从具体数值上看，不同代次间也存在一定差异：各代次抗氧化能力P3-P4代较优于其他代次，其原因可能与体外培养时间充质干细胞的细胞状态有关。而且随着细胞传代次数增多和培养时间的延长，间充质干细胞分化开始出现分化现象，增殖速度减慢，旁分泌作用减弱，故后期代次的间充质干细胞培养上清抗氧化能力开始出现衰减。但在清除羟自由基和超氧化物歧化酶酶活性两个指标上，不同代次培养上清间未见明显差别，这提示我们在后期的实验中，如果早期代次的间充质干细胞以及其培养上清在数量上不能满足临床应用的需求，后期的细胞也可以作为替代品。

而关于间充质干细胞的临床应用，虽然取得了重大进步，但是也存在一定的问题。其中一点就是关于干细胞体内应用的成瘤性，有研究表明间充质干细胞可以通过抑制免疫细胞的抗肿瘤免疫应答来促进肿瘤细胞的生长^[20-22]。由于人体的内环境较体外培养相比较为复杂，将间充质干细胞输注人体后，其分化方向以及其他调控作用难以控制，故一些研究者^[23-25]根据对间充质干细胞培养上清进行研究后，发现其旁分泌作用存在潜在价值，或许是干细胞发挥组织修复等作用的关键，因此提出了关于“无细胞治疗”的概念。采用无细胞技术，不仅避免了间充质干细胞与人体免疫系统发生直接接触，避免了一系列的免疫应答的产生，只是将干细胞的有效成分直接注入人体，一定程度上提高了治疗效率。Ahmadi等^[26]将间充质干细胞以及其培养上清分别作用于慢性气道炎症的大鼠模型，发现与阴性对照组相比，接受间充质干细胞及其培养上清治疗的大鼠的炎症均得到了缓解，炎性因子表达下调，且两组间并无显著性差异。而也有研究发现，间充质干细胞发挥抗氧化和抗炎作用主要是通过其分泌一种膜泡样物质-外泌体，其不仅可以起到免疫调节，还能在一定程度上减轻各种炎症作用^[27-28]。而更加深入的研究表示，外泌体表面表达的microRNAs则是发挥功能的关键性物质^[29-40]，可以起到调节靶基因的表达等作用。由此不难推断，“无细胞治疗”治疗思想虽然只是一种推测和假设，并未应用于临床，但却存在巨大的应用前景，值得研究人员进一步深入探讨。

实验虽然证实了胎盘胎儿侧间充质干细胞的培养上清具有一定的抗氧化能力，且与实验前的推测基本相符，在一定程度上为“无细胞治疗”的设想提供一定依据，但也存在一定的缺陷：①实验只是在体外检测其清除自由基能力以及抗氧化酶活性，但具体的作用成分与分子机制还有待进一步探究；②实验未进行功能性验证，不能明确其中的抗氧化活性物质作用于细胞模型或者实验动物模型中是否能发挥抗氧化损伤的作用等。③由于技术条件的限制，无法将间充质干细胞培养上清中的有效成分，例如外泌体和酶类物质提取出来进行验证，以明确其作用机制。此类实验中存在的问题课题组将在后续的实验中进行进一步研究和探讨。

人胎盘胎儿侧间充质干细胞无血清培养上清的抗氧化活性分析

Anti-oxidative activities of supernatants of human fetal placental mesenchymal stem cells cultured in serum-free medium

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