子宫内膜基质干细胞的体外分离培养及生物学特性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.05.018

摘要/Abstract

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文题释义：
子宫内膜基质干细胞：定位于子宫肌层与子宫内膜的交界部位，子宫内膜基质干细胞具有多向分化和高增殖的功能，子宫内膜周期性增生和脱落与子宫内膜基质干细胞的发生发展具有密切关联。近年来，子宫内膜基质干细胞的研究主要集中于来源、特性、动物实验、临床研究以及系统修复等方面。
RT-PCR法：是将RNA反转录(RT)和以反转录产物cDNA为模板的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。

摘要
背景：从干细胞角度去认识和研究子宫内膜细胞，能够为临床上解决子宫内膜引发的子宫内膜疾病治疗提供新的治疗方案和研究切入点。
目的：比较不同方法体外分离、培养子宫内膜基质干细胞的生物学特性。
方法：采用3种常用的细胞分离方法(胰蛋白酶法、胶原酶Ⅰ法、胰蛋白酶联合胶原酶Ⅰ法)从切除的子宫中分离培养内膜基质干细胞，通过组织分离培养，对生长5 d的第2代细胞进行锥虫蓝染色，计数活细胞数量。采用间质干细胞标志物CD146联合造血干细胞标志物CD90单克隆抗体，以免疫组化及RT-PCR法对培养获得的子宫内膜基质干细胞进行鉴定；同时取生长对数期细胞进行培养，并绘制细胞生长曲线。
结果与结论：①培养获得的子宫内膜基质干细胞形态呈现梭形，细胞贴壁生长，排列无极性，具有成纤维细胞形态；②子宫内膜基质干细胞标志物CD146和CD90的DNA分别在500 bp和150 bp呈现高表达，而子宫肌层组织对照组不表达；③培养所得干细胞的生长曲线呈现S型，3种方法培养的细胞生长周期差异无显著性意义；相对于胰蛋白酶法和胰蛋白酶联合胶原酶Ⅰ法而言，胶原酶Ⅰ法分离培养所得的子宫内膜基质干细胞数量较多，生长速度较快；④结果表明，从切除的子宫组织中能够成功分离出子宫内膜基质细胞，且胶原酶Ⅰ法是一种较为高效、实用、稳定的体外子宫内膜基质干细胞培养方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2401-8323(毕玉虎)

关键词: 干细胞, 分化, 子宫, 内膜基质, 细胞培养, 细胞分化

Abstract:

BACKGROUND: Understanding and studying endometrial cells from the perspective of stem cells can provide a new therapeutic approach and research entry point for the clinical treatment of endometrial diseases.
OBJECTIVE: To compare the biological features of endometrial stromal stem cells isolated and cultured using different methods.
METHODS: Three commonly used cell separation methods, including trypsin, collagenase I and their combination, were used to isolate and culture endometrial stromal stem cells from the uterus after removal. Afterwards, passage 2 cells cultured for 5 days were subjected to trypan blue staining and living cell counting. Immunohistochemical staining for CD146 and CD90 and RT-PCR were used to identify harvested endometrial stromal stem cells. Logarithmically growing cells were cultured to draw cell growth curves.
RESULTS AND CONCLUSION: Harvested endometrial stromal stem cells presented with spindle, adherent cell growth, nonpolar arrangement, and fibroblast morphology. The DNA of endometrial stem cell marker CD146 and CD90 highly expressed in 500 bp and 150 bp respectively, but did not express in the mesometrium. S-shaped growth curve of cultured cells was found, and there was no difference in the cell cycle of cells cultured using three different methods. Among the three methods, collagenase I method could harvest the highest number of endometrial stromal stem cells that grew fastest. These findings indicate that endometrial stromal stem cells can be successfully isolated from the removed uterine tissues, and collagenase I method is an efficient, practical and stable method for in vitro culture of endometrial stromal stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Uterus, Cell Culture Techniques, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

毕玉虎，滕君儒. 子宫内膜基质干细胞的体外分离培养及生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(5): 760-765.

Bi Yu-hu, Teng Jun-ru. Endometrial stromal stem cells: in vitro isolation, culture and biological features[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(5): 760-765.

图/表（结果） 2

2.1 子宫内膜基质干细胞生长情况 接种24-48 h后即可看到少量贴壁细胞，细胞形态不均一。培养三至四天细胞逐渐汇合形成大小不一的细胞集落，7 d时细胞集落明显增大，细胞多呈梭形或多角形。细胞呈漩涡状或辐射状生长，10 d左右细胞互相连接，铺满皿底(图1)。传代培养细胞生长方式与原代细胞相似，第2代细胞呈均一的成纤维状，融合后呈典型的极性。3种方法培养比较：胰蛋白酶法消化时间短，活细胞数量较少，贴壁时间较长，杂质多，胶原酶Ⅰ法消化时间长，但活细胞数量较多，贴壁时间较短，杂质少，胰蛋白酶联合胶原酶Ⅰ法介于两者之间。可见胶原酶Ⅰ法分离培养子宫内膜基质干细胞具有一定优势。

2.2 子宫内膜基质干细胞鉴定

2.2.1 流式细胞仪分析 流式细胞仪检测发现子宫内膜基质干细胞阳性表达干细胞表面标志CD44、CD90，不表达造血细胞表面标志CD34、CD45(图2)。

2.2.2 免疫组化分析 显微镜观察结果显示，CD90和CD146抗体主要表现为细胞核染色，部分为胞浆染色。染色阳性结果呈现淡黄色至深棕色，显色强度不明显为阴性(图3)。

2.2.3 RT-PCR分析结果 在紫外线投射仪下观察电泳情况，分别比较目的基因CD90和CD146 mRNA的表达量^[12]，标本选取子宫内膜与子宫肌层交界部位，以相近的子宫肌层组织作为对照，目的基因CD90、CD146在子宫肌层不表达，但是CD90的DNA在150 bp左右、基因CD146的DNA在500 bp左右高表达(图4)。

2.2.4 成骨成脂分化能力 子宫内膜基质干细胞成脂诱导2周进行油红O染色，可见红色脂滴(图5A)；成骨诱导2周进行茜素红染色，可见钙盐被染为红色(图5B)。

2.3 不同分离方法下子宫内膜基质干细胞的生长曲线 3种分离方法所得单细胞悬液经细胞培养后，通过采用细胞计数法对第2代细胞进行计数，所得生长曲线均表现为S型，存在一定的滞留期、对数期和平台期，各组比较差异无显著性意义(图6)。

2.4 不同分离方法获得活细胞数比较 3种方法所获得活细胞数比较差异有显著性意义。胶原酶Ⅰ法所获得的活细胞数显著高于胰蛋白酶法和胰蛋白酶联合胶原酶Ⅰ法(P < 0.05，表1)。

参考文献

[1] 高红艳,陈继明,何援利,等.人子宫内膜基质细胞的分离纯化和体外培养方法研究[J].重庆医学,2014,10(34):4634-4636.

[2] Deane JA, Gualano RC, Gargett CE, et al. Regenerating endometrium from stem/progenitor cells: Is it abnormal in endometriosis, Asherman's syndrome and infertility? Curr Opin Obstet Gynecol. 2013;25(3):193-200.

[3] Ding L,Li X,Sun H, et al.Transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells on collagen scaffolds for the functional regeneration of injured rat uterus.Biomaterials. 2014;35(18):4888-4900.

[4] Indumathi S,Harikrishnan R,Rajkumar JS,et al.Prospective biomarkers of stem cells of human endometrium and fallopian tube compared with bone marrow. Cell Tissue Res. 2013; 352(3):537-549.

[5] Jing Z,Qiong Z,Yonggang W, et al. Rat bone marrow mesenchymal stem cells improve regeneration of thin endometrium in rat. Fertil Steril. 2014;101(2):587-594.

[6] Cervelló I, Mas A, Gil-Sanchis C, et al. Somatic stem cells in the human endometrium.Semin Reprod Med. 2013;31(1): 69-76.

[7] Yang XY, Wang W, Li X, et al.In vitro hepatic differentiation of human endometrial stromal stem cells. In Vitro Cell Dev Biol. 2014;50(2):162-170.

[8] 张继雯.人类子宫内膜肿瘤干细胞的研究进展[J].国际妇产科学杂志,2013,40(4):327-330.

[9] Gil-Sanchis C, Cervelló I, Mas A, et al. Leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 5 (Lgr5) as a putative human endometrial stem cell marker. Mol Hum Reprod. 2013;19(7/8):407-414.

[10] Apostolou G, Apostolou N, Biteli M, et al. Utility of Ki-67, p53, Bcl-2, and Cox-2 biomarkers for low-grade endometrial cancer and disordered proliferative/benign hyperplastic endometrium by imprint cytology. Diagn Cytopathol. 2014;42(2):134-142.

[11] Chen YZ,Wang JH, Yan J, et al. Increased expression of the adult stem cell marker Musashi-1 in the ectopic endometrium of adenomyosis does not correlate with serum estradiol and progesterone levels. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2014; 173:88-93.

[12] Bures N, Nelson G, Duan Q, et al. Primary squamous cell carcinoma of the endometrium: Clinicopathologic and molecular characteristics. Int J Gynecol Pathol. 2013;32(6): 566-575.

[13] Mingels MJ, Geels YP, Pijnenborg JM, et al. Histopathologic assessment of the entire endometrium in asymptomatic women. Human Pathol.2013;44(10):2293-2301.

[14] 朱明,肖南,黄宏,等.间充质干细胞治疗皮肤创伤的研究进展[J]. 中国细胞生物学学报, 2015,3(6):911-918.

[15] 郭珊珊,沈志森,陆达锴,等.干细胞向骨骼肌细胞的诱导分化及其在治疗骨骼肌病变中的应用[J].中国细胞生物学学报, 2015, 4(1):124-131.

[16] Ayd?n A, Duruksu G, Erman G, et al. Neurogenic differentiation capacity of subacromial bursal tissue - Derived stem cells. J Orthop Res. 2014;32(1):151-158.

[17] Baulcha JE.干细胞释放的微囊泡有望更安全地治疗大脑放射损伤[J].生物医学工程与临床, 2016,11(3):22-23.

[18] 于文竹.人胚胎干细胞向子宫内膜上皮样细胞诱导分化的相关研究[D].郑州大学, 2014.

[19] Bae D, Moon SH, Park BG, et al. Nanotopographical control for maintaining undifferentiated human embryonic stem cell colonies in feeder free conditions.Biomaterials. 2014;35(3):916-928.

[20] Wu JC, Tzanakakis ES. Deconstructing stem cell population heterogeneity: Single-cell analysis and modeling approaches. Biotechnol Adv. 2013;31(7):1047-1062.

[21] Arefeh G, Hossein H, Abbas P, et al. Galactosylated collagen matrix enhanced in vitro maturation of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells. Biotechnol Lett.2014; 36(5): 1095-1106.

[22] Sanjuan-Pla A, Macaulay IC, Jensen CT, et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy.Nature. 2013;502(7470):232-236.

[23] Kajihara T, Brosens J, Ishihara O, et al.The role of FOXO1 in the decidual transformation of the endometrium and early pregnancy. Med Mol Morphol. 2013;46(2):61-68.

[24] Parra-Herran CE, Yuan L, Nucci MR, et al. Targeted development of specific biomarkers of endometrial stromal cell differentiation using bioinformatics: The IFITM1 model. Mod Pathol. 2014;27(4):569-579.

[25] Li J, Hansen KC, Zhang Y, et al. Rejuvenation of chondrogenic potential in a young stem cell microenvironment. Biomaterials. 2014;35(2):642-653.

[26] Emmert MY, Wolint P, Wickboldt N, et al. Human stem cell-based three-dimensional microtissues for advanced cardiac cell therapies.Biomaterials. 2013;34(27):6339-6354.

[27] Samborski A, Graf A, Krebs S, et al.Transcriptome changes in the porcine endometrium during the preattachment phase. Biol Reprod. 2013;89(6):134-134.

[28] Parra-Herran CE, Monte NM, Mutter GL. Endometrial intraepithelial neoplasia with secretory differentiation: Diagnostic features and underlying mechanisms. Mod Pathol. 2013;26(6):868-873.

[29] Thiruchelvam U, Dransfield I, Saunders PT, et al. The importance of the macrophage within the human endometrium. J Leukoc Biol. 2013;93(2):217-225.

[30] 周华,宋丽娜,张敏.人子宫内膜干细胞体外分离、培养及鉴定[J]. 中华中医药学刊, 2014,17(8):1907-1908.

[31] Sakr S, Naqvi H, Komm B, et al. Endometriosis impairs bone marrow-derived stem cell recruitment to the uterus whereas bazedoxifene treatment leads to endometriosis regression and improved uterine stem cell engraftment. Endocrinology. 2014;155(4):1489-1497.

[32] 陈岩,李栋,张哲,等. 人脐带间充质干细胞对大鼠子宫内膜异位症病灶神经纤维的影响[J].山东大学学报(医学版),2013,51(3): 48-51.

[33] Osuga Y, Koga K, Tsutsumi O, et al. Stem cell factor (SCF) concentrations in peritoneal fluid of women with or without endometriosis. Am J Reprod Immunol. 2000;44(4):231-235.

[34] León M, Vaccaro H, Alcázar JL, et al. Extended transvaginal sonography in deep infiltrating endometriosis: Use of bowel preparation and an acoustic window with intravaginal gel: Preliminary results. J Ultrasound Med. 2014;33(2):315-321.

[35] 蒋智.人子宫内膜干细胞通过旁分泌作用保护心肌并促进心肌再生改善大鼠心梗后心功能[D].浙江大学, 2013.

[36] Jeschke U, Hutter S, Heublein S, et al. Expression and function of galectins in the endometrium and at the human feto-maternal interface. Placenta. 2013;34(10):863-872.

[37] 严琰,东健沣,桑运霞,等.经血源子宫内膜干细胞培养、鉴定及体外分化潜能的研究[J].中国细胞生物学学报, 2014,22(7):892- 899.

[38] 张倩媚,马颖.子宫内膜干细胞体外诱导及定性分化的研究[J]. 山西医药杂志, 2013, 42(7):770-771.

[39] Adammek M, Greve B, Kässens N, et al. MicroRNA miR-145 inhibits proliferation, invasiveness, and stem cell phenotype of an in vitro endometriosis model by targeting multiple cytoskeletal elements and pluripotency factors. Fertil Steril. 2013;99(5):1346-1355.

引言

材料方法

1.1 设计 细胞学观察实验。

1.2 时间及地点 于2013年10月至2015年10月在齐鲁医院实验室完成实验。

1.3 材料 子宫内膜组织来源于齐鲁医院妇科在2013年10月至2015年10月期间接收的行子宫切除术的患者，患者年龄29-47岁，一般情况良好，无阴道炎等妇科炎症，无传染病及内外科疾病，近3个月内未服用任何激素药物，患者及其家属均对本研究知情同意。本次研究相关方案均提交本院医学伦理部门审核，并经批准，符合相关伦理学要求。

主要试剂与仪器：PBS(上海万疆生物技术有限公司)，Ⅰ型胶原酶(上海研晶生物科技有限公司)，DMEM-F12培养液(上海飞轩生物科技有限公司)，胎牛血清(湖南威恒生物技术有限公司)，青霉素(北京达科为生物技术有限公司)，链霉素(上海鑫乐生物科技有限公司)，锥虫蓝(北京赛百盛生物技术有限公司)，0.25%胰蛋白酶(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，SABC免疫组化染色试剂盒(南京斯拜科生化实业有限公司)，浓缩型DAB试剂盒(北京海之润生物技术有限公司)，PCR试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)，RT试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)，封固中性树胶(武汉艾美捷科技有限公司)，电泳仪(上海高创化学科技有限公司)，倒置显微镜(北京碧橙蓝生物科技有限责任公司)，CO₂培养箱(北京百普赛斯生物科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 标本处理 子宫全切术后，无菌操作下取子宫内膜组织，放入无菌的青、链霉素溶液中，2 h内送入实验室。用无Ca²⁺Mg²⁺的PBS冲洗，转入无菌培养皿中，用眼科剪剪至1 mm³大小^[5]。

1.4.2 子宫内膜基质干细胞的分离培养 采用胰蛋白酶法、胶原酶Ⅰ法及胰蛋白酶联合胶原酶Ⅰ法进行细胞分离。①胰蛋白酶法：将新鲜剪碎的子宫内膜组织放置于0.25%的胰蛋白酶中，于37 ℃培养箱中振荡消化30 min后，收集消化液于离心管中，加入含有体积分数10%胎牛血清的完全培养基于离心管中终止消化，以1 000 r/min离心10 min后，弃去上清液，加入新鲜配制的完全培养基吹打均匀后，接种于25 cm²培养瓶中，于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱内培养，每3 d换液1次，直至细胞长至80%融合时进行传代^[6]；②胶原酶Ⅰ法：将新鲜剪碎的子宫内膜组织放置于2倍体积的胶原酶Ⅰ中，37 ℃培养箱中振荡消化60 min，收集消化液于离心管中，加入含有体积分数10%胎牛血清的完全培养基于离心管中终止消化，以1 000 r/min离心10 min，弃去上清液，加入新鲜配制的完全培养基吹打均匀后，接种于25 cm²培养瓶中，于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱内培养，每3 d换液1次，直至细胞长至80%融合时进行传代^[7-8]；③胰蛋白酶联合胶原酶Ⅰ法：将新鲜剪碎的子宫内膜组织加入0.25%的胶原酶Ⅰ(组织与胶原酶体积比例为1∶5)，于37 ℃培养箱中振荡消化30 min，然后加入0.25%的胰蛋白酶，混合均匀后继续消化30 min，收集消化液于离心管中，加入含有体积分数10%胎牛血清的完全培养基于离心管中终止消化，以1 000 r/min离心10 min，弃去上清液，加入新鲜配制的完全培养基吹打均匀后，接种于25 cm²培养瓶中，于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱内培养，每3 d换液1次，直至细胞长至80%融合时进行传代^[9-10]。于超净台内弃去培养瓶内旧的培养基，再用PBS洗1遍后，加入2.5 g/L胰酶和0.02%的EDTA混合液1 mL，轻轻晃动使消化液铺满培养瓶底，同时在倒置相差显微镜下观察，当细胞大部分变圆时，弃去消化液，在培养瓶中加入完全培养基终止消化，然后将细胞从培养瓶底吹打下来，以1∶2传代。

1.4.3 细胞形态观察 采用倒置相差显微镜观察细胞的生长情况，包括生长状态、细胞数量及细胞贴壁情况等。

1.4.4 锥虫蓝染色计数 收集第2代细胞悬液，加入100 μL锥虫蓝染色液，轻轻混匀，染色3 min。吸取少量经过染色的细胞，用血细胞计数板计数，每个细胞样品至少计数500个细胞，数出蓝色细胞和细胞总数。细胞存活率=(细胞总数-蓝色细胞数)/细胞总数×100%。

1.4.5 细胞生长曲线绘制 将处于生长对数期的第2代细胞，按照每孔1.5×10⁷个细胞接种于24孔板中，于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱内培养，每日计数3孔，取平均数，连续计数7 d，以时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞生长曲线^[11]。

1.4.6 细胞鉴定

流式细胞仪检测：选取第2代生长状态良好的子宫内膜基质干细胞，经胰蛋白酶消化，离心后，PBS重悬制成1×10⁹ L^-¹的细胞悬液，加入含有特定FITC，APC，PE标记的抗体避光孵育15 min，加入PBS混匀，离心，弃上清，PBS重悬，流式细胞仪检测。

免疫细胞化学SP法检测：选取第2代生长状态良好的子宫内膜基质干细胞，经胰蛋白酶消化，离心后，以1×10⁹ L^-¹的细胞浓度接种于载玻片上，待细胞爬满载玻片后，40 g/L多聚甲醛固定20 min，体积分数为3%过氧化氢处理10 min，正常血清封闭10 min，加入CD90，CD146一抗孵育2 h，PBS清洗后加入二抗孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固，显微镜下观察。以PBS代替一抗作阴性对照。

RT-PCR电泳：选取第2代生长状态良好的子宫内膜基质干细胞，经胰蛋白酶消化，离心后，PBS重悬制成1×10⁹ L^-¹的细胞悬液，采用Trizol法提取细胞总RNA，反转录得到cDNA，进行PCR反应。扩增条件：90 ℃下预变性2 min，1个循环；90 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s。70 ℃延伸2 min，30个循环，70 ℃总延伸6 min。取5 μL扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳，电压10 V/cm。经EB染色处理后，采用紫外线投射仪观察电泳情况，并应用图像分析仪检测CD90和CD146 mRNA的表达量。

成骨诱导分化：取第2代生长状态良好的子宫内膜基质干细胞，以2×10⁴/cm²的浓度接种于培养板中，置于37 ℃，含体积分数为5% CO₂的孵箱内培养，观察细胞达80%汇合时更换成骨诱导分化培养基，每隔3 d换液1次，诱导2周后进行茜素红染色。

成脂诱导分化：取第2代生长状态良好的子宫内膜基质干细胞，以2×10⁴/cm²的浓度接种于培养板中，置于37 ℃，含体积分数为5%CO₂的孵箱内培养，观察细胞达80%汇合时更换成脂诱导分化培养基，每3 d换液1次，诱导2周后进行茜素红染色。

1.5 主要观察指标 采用流式细胞仪、免疫细胞化学SP法以及RT-PCR电泳分别检测子宫内膜基质干细胞的培养生长状况；以电泳联合图像分析仪检测CD90和CD146 mRNA的表达量。

1.6 统计学分析 对实验过程中获得的数据进行收集，使用的统计学软件为SPSS公司的SPSS 18.0，组间比较予以单因素方差分析，检测P < 0.05则表示差异有显著性意义。

讨论

人子宫内膜来源于胚胎发育过程中的中胚层组织黏膜层，包括基底层、海绵层和致密层3层组织^[13-14]。而干细胞作为20世纪生物医学的重要研究成果，能够广泛应用于临床医学进行受损细胞及神经系统的修复研究。干细胞具有多向分化能力以及自我更新能力，属于一种可以无限增殖的未分化细胞，其生长、更新、发展贯穿整个生命过程。临床研究结果表明，干细胞能够定向分化为皮肤^[15]、骨骼^[16]、血液及大脑等组织^[17-18]，保持着高度增殖的特性。干细胞在机体细胞增殖、分化、凋亡进程中起着十分重要的平衡作用。另外，干细胞又可以分为成体干细胞^[19]、胚胎干细胞^[20]、生殖干细胞^[21]、脐血干细胞等类型^[22]。由于子宫内膜基质干细胞取材较为方便，不受法律及道德伦理问题的限制，使其在临床研究及实验探索中具有广泛的应用前景。近年来，子宫内膜基质干细胞的研究主要集中于来源^[23]、特性^[24]、动物实验^[25]、临床研究以及系统修复等方面^[26-27]。

国外相关研究结果显示，通过观察研究干细胞体外培养的特性，发现人子宫内膜中存在成体干细胞^[28-29]。有学者研究发现，CD146内膜基质细胞存在较高的克隆能力，可应用于子宫内膜基质干细胞分离的标记^[30]。Sakr等^[31]学者进一步研究发现，上皮细胞在分泌期的集落形成能力较内膜间质细胞强，说明子宫内膜基质及上皮细胞具有子宫内膜基质干细胞的特性。因此，从干细胞角度去认识和研究子宫内膜细胞，能够为临床上解决子宫内膜引发的子宫内膜疾病治疗提供新的治疗方案和研究切入点。

实验中采用胰蛋白酶法、胶原酶Ⅰ法以及胰蛋白酶法联合胶原酶Ⅰ法进行子宫内膜组织的消化，标本的选取将同一组织分为3等份，消化后的细胞经培养所得的细胞形态基本一致，均呈现成纤维细胞形态，表现为梭形，且生长周期比较差异无显著性意义(P > 0.05)。本研究中通过对培养获得的细胞数量、细胞贴壁时间等进行比较，发现不同的细胞消化方法在所获得活细胞数量方面存在一定差异。单从消化时间上来看，胰蛋白酶对干细胞组织消化所需时间较其他2种消化方法短，临床研究表明，消化处理时间过长将对干细胞产生影响^[32]，因此采用胰蛋白酶消化所得的细胞数量较少，且细胞的生长状态较差。

国内外研究证实，子宫上皮细胞生长、分化过程需要基质细胞的参与^[33-34]。本实验中采用的胰蛋白酶联合胶原酶Ⅰ法就是在利用子宫内膜上皮细胞和基质细胞的协同作用，从而模拟更加真实的机体内环境，促进细胞快速生长。但是联合法的操作过程较为复杂，且细胞贴壁时间较长，细胞数量损失较多。胶原酶主要适用于水解结缔组织中的胶原蛋白成分，由于胶原酶对上皮细胞的消化作用较弱，而对细胞间质具有较强的消化作用，因此，常将胶原酶应用于上皮组织、纤维性组织及癌组织的分离，将胶原酶Ⅰ消化的子宫内膜基质干细胞所得细胞数量较多，细胞生长状态良好，得到的细胞极易成活，细胞贴壁牢固，纯度较高^[35]。

世界卫生组织调查数据显示，发展中国家不孕症发生率高达30%，国内不孕症患者占6%-15%，且近年来具有逐渐升高的趋势^[36]。国内多项临床研究显示，反复的人工流产容易导致女性患者出现宫腔粘连，进而导致不孕^[37-38]。宫腔粘连的临床治疗与粘连类型以及子宫内膜受损程度具有密切关联，子宫内膜基质干细胞应用于不孕症的替代治疗是一种广泛认可的治疗新策略。Adammek等^[39]学者采用流式细胞仪在成人子宫内膜组织中首次发现血源性干细胞，而血源性细胞调节紊乱也可能是导致不孕的重要原因之一。子宫内膜异位也是子宫内膜病变中的一种，其病因及发病机制尚未明确定论，但是传统的临床治疗效果并不理想，子宫内膜基质干细胞研究为子宫内膜异位的临床治疗提供了新的治疗思路。虽然关于子宫内膜的实验研究很多，但是由于尚未发现子宫内膜基质干细胞的特定表面标志物，细胞培养的鉴定问题仍然是当今子宫内膜研究的一大难点，实验中采用造血干细胞的标志物CD90和间质干细胞标志物CD146的高度表达，并在细胞核和胞浆中检测到了两种标志物的阳性表达，CD90和CD146的DNA在子宫肌层组织中不表达，但是分别在150 bP和500 bp左右呈现高表达，这也再次证实了子宫内膜基质干细胞具有干细胞的特性。

综上所述，由于子宫内膜基质干细胞属于成体干细胞，具有良好的组织相容性，能够通过局部种植、介入等途径用于治疗子宫内膜相关疾病，为子宫内膜病变引发的子宫内膜疾病及不孕症提供了新的治疗方法。