人胎盘来源间充质干细胞的生物学性能及体外生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.05.017

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (5): 755-759.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.05.017

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

人胎盘来源间充质干细胞的生物学性能及体外生物相容性

伍佳¹，温永梅¹，吕欣荣¹，牟雁东^1，2

1西南医科大学，四川省泸州市 646000
2四川省人民医院，四川省成都市 610000

出版日期:2017-02-18 发布日期:2017-03-20
通讯作者: 牟雁东，教授，西南医科大学，四川省泸州市 646000 ；四川省人民医院，四川省成都市 610000
作者简介:伍佳，女，1990年生，四川省遂宁市人，汉族，西南医科大学在读硕士，医师，主要从事口腔种植修复研究。
基金资助:
四川省科技厅项目(2016TD0008，2014JY0187)

Biological characterization and in vitro biocompatibility of human placenta derived mesenchymal stem cells

Wu Jia¹, Wen Yong-mei¹, Lv Xin-rong¹, Mu Yan-dong^{1, 2}

1Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
2Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610000, Sichuan Province, China

Online:2017-02-18 Published:2017-03-20
Contact: Mu Yan-dong, Professor, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610000, Sichuan Province, China
About author:Wu Jia, Studying for master’s degree, Physician, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
the Projects of Sichuan Provincial Science and Technology Department, No. 2016TD0008, 2014JY0187

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
细胞连接：在多细胞生物体内，细胞与细胞之间通过细胞膜相互联系，形成一个密切相关，彼此协调一致的统一体，称为细胞连接。对于维持组织的完整性非常重要，有的还具有细胞通讯作用。
细胞黏附：在细胞识别的基础上，同类细胞发生聚集形成细胞团或组织的过程叫细胞黏附。它对于胚胎发育及成体的正常结构和功能都有重要的作用。在发育过程中，由于细胞间细胞黏着的强度不同，决定着细胞在内、中、外三胚层的分布。在器官形成过程中，通过细胞黏着，使具有相同表面特性的细胞聚集在一起形成器官。

摘要
背景：目前作为骨组织工程的种子细胞主要是骨髓间充质干细胞，但其在骨髓中的含量极低，只有0.001%-0.01%，同时分离纯化难度大。
目的：探讨人胎盘来源间充质干细胞的生物学性能及与三维多孔羟基磷灰石陶瓷支架的生物相容性。
方法：人胎盘来源间充质干细胞进行形态学观察和流式细胞仪鉴定；将人胎盘来源间充质干细胞经成骨、成脂、成软骨诱导分化培养3周，进行茜素红S、油红O、甲苯胺蓝染色，鉴定其多向分化潜能。将人胎盘来源间充质干细胞接种于三维多孔羟基磷灰石陶瓷支架，通过DAPI染色、扫描电镜观察人胎盘来源间充质干细胞在支架表面的黏附情况。
结果与结论：①人胎盘来源间充质干细胞呈长梭形，大小均匀一致；②人胎盘来源间充质干细胞高表达CD29，CD90等干细胞表面标志，不表达CD45，CD106等造血细胞表面标志；③诱导培养3周后，茜素红S染色可以看到红色的矿化结节，油红O染色观察到红色的脂滴，甲苯胺蓝染色可以看到软骨细胞染成蓝色；④DAPI染色、扫描电镜均观察到人胎盘来源间充质干细胞在支架表面能很好地黏附，可以作为组织工程良好的种子细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-5024-6557(伍佳)

关键词: 干细胞, 分化, 胎盘间充质干细胞, 流式细胞仪, 多向分化潜能, 羟基磷灰石陶瓷支架, 生物相容性

Abstract:

BACKGROUND: At present bone marrow mesenchymal stem cells act as the main seed cells in bone tissue engineering, but only 0.001%-0.01% cells are in the bone with difficulty in cell separation and purification.
OBJECTIVE: To explore the biological characterization of human placenta derived mesenchymal stem cells and biocompatibility with three-dimensional porous hydroxyapatite ceramic scaffold.
METHODS: Human placenta derived mesenchymal stem cells were morphologically observed and identified using flow cytometry, followed by osteogenic, adipogenic, chondrogenic induction for 3 weeks. Afterwards, the potential of multi-directional differentiation was identified by alizarin red S, oil red O and toluidine blue staining. DAPI staining was used to observe the adhesion of cells on the surface of the hydroxyapatite ceramic scaffold under scanning electron microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: The human placenta derived mesenchymal stem cells showed long spindle shape and uniform size under the microscope; they highly expressed CD29 and D90, but did not express CD45 and CD106. Following induction, mineralized nodules were observed by alizarin red S staining, lipid droplets by oil red O staining and blue-dyed toluidine blue staining. These cells adhered well to the scaffold surface, indicting they are suitable for bone tissue engineering.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Placenta, Mesenchymal Stem Cells, Hydroxyapatites, Cell Adhesion, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

伍佳，温永梅，吕欣荣，牟雁东. 人胎盘来源间充质干细胞的生物学性能及体外生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(5): 755-759.

Wu Jia, Wen Yong-mei, Lv Xin-rong, Mu Yan-dong. Biological characterization and in vitro biocompatibility of human placenta derived mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(5): 755-759.

图/表（结果） 1

2.1 人胎盘来源间充质干细胞的形态 第3代人胎盘来源间充质干细胞复苏培养5 d后，细胞长满培养瓶底部，显微镜下观察细胞呈集簇状生长，螺旋状、漩涡状排列，呈典型的长梭形，类似成纤维细胞样形态，细胞大小均匀一致，生长状况良好(图2)。人胎盘来源间充质干细胞平均3-5 d传代1次。

2.2 流式细胞仪检测人胎盘来源间充质干细胞表面标志 人胎盘来源间充质干细胞高表达CD29，CD90等间充质干细胞特征性表面抗原，低表达造血细胞表面抗原CD45、CD106等^[9-10](图3)，表达量分别为98.14%，99.34%，0.29%，0.43%。

2.3 人胎盘来源间充质干细胞的多向分化潜能鉴定

2.3.1 成骨分化潜能 人胎盘来源间充质干细胞在成骨诱导培养基中培养1周，细胞形态由长梭形变为多边形。培养1-3周，人胎盘来源间充质干细胞形成钙化结节，随着时间的延长，钙化结节增大，并且分布也比较均匀，用茜素红S染色液对细胞进行染色，可以观察到细胞被染成红色的大小不等的钙化结节(图4A)，表明分离得到的人胎盘来源间充质干细胞具有成骨细胞分化能力。

2.3.2 成脂分化潜能 人胎盘来源间充质干细胞在成脂诱导培养基中培养7-10 d，细胞核增大。诱导2到3周，细胞逐渐变圆，胞质内出现脂滴，并且脂滴逐渐增大，数量增多。经成脂诱导培养基培养3周，用油红O对细胞进行染色，可以观察到细胞被分化为大小不一的脂肪滴，脂肪滴被染成红色(图4B)^[11]，呈葡萄串状，表明分离得到的人胎盘来源间充质干细胞具有向脂肪细胞分化的能力。

2.3.3 成软骨分化潜能 人胎盘来源间充质干细胞经成软骨诱导培养基诱导培养3周，出现软骨基质。对细胞进行甲苯胺蓝染色，可以看到软骨被染成蓝色(图4C)，表明分离得到的人胎盘来源间充质干细胞具有向软骨细胞分化的能力。

2.4 人胎盘来源间充质干细胞与支架复合共培养 共培养5 d时，呈梭形的细胞围绕在羟基磷灰石陶瓷支架边缘生长，排列一致，随着时间的递增，细胞数目增多(图5)。

2.5 人胎盘来源间充质干细胞在支架表面的黏附情况 将接种1，4 h后的细胞进行DAPI染色(图6)，人胎盘来源间充质干细胞在羟基磷灰石陶瓷支架表面黏附良好，随着共培养时间的延长，黏附在支架表面的细胞明显增多。

2.6 扫描电镜观察人胎盘来源间充质干细胞在支架表面黏附形态 人胎盘来源间充质干细胞在羟基磷灰石陶瓷支架表面生长良好，保持长梭形的形态特点，部分细胞伸出伪足，有利于细胞更加紧密黏附于支架表面(图7)。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学观察实验。

1.2 时间及地点 于2015年3至12月在四川大学生物治疗国家重点实验室完成。

1.3 材料 人胎盘来源间充质干细胞由四川大学生物治疗国家重点实验室提供。胎牛血清、DMEM培养基、0.25%胰酶(Gibco)；抗CD29、CD90、CD45、CD106流式抗体(美国BD公司)；茜素红S(Sigma)；油红O、甲苯胺蓝(上海生工生物工程有限公司)；细胞培养瓶、细胞培养板(BD Falcon)；倒置相差显微镜(OLYMPUS)；流式细胞仪(美国BD公司)；DAPI染色液(碧云天)；JSM-7500F扫描电镜(日本日立公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养及传代 人胎盘来源间充质干细胞生长于含体积分数为10%胎牛血清及1%青、链霉素的DMEM培养基中，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂的恒温培养箱中培养。每天在倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况，每三四天更换1次培养基，待细胞生长至80%-90%融合时，弃原培养基，PBS洗涤3次，加入3 mL 0.25%胰酶-0.03%EDTA室温消化3 min，显微镜下观察细胞回缩呈圆形，细胞间隙增大，加入等体积的含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按1︰3的比例接种传代。

1.4.2 流式细胞仪检测人胎盘来源间充质干细胞的表面标志 取第5代对数生长期的人胎盘来源间充质干细胞，用0.25%胰酶消化成单细胞悬液，1 200 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗涤，去除残留培养基。取5×10⁵个细胞加入流式管中，100 μL PBS重悬，分别加入CD29，CD90，CD45，CD106抗体(1 μL)，充分混匀，4℃避光孵育30 min，2 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗涤细胞1次，300 μL PBS重悬，流式细胞仪检测人胎盘来源间充质干细胞表面抗原的表达。

1.4.3 人胎盘来源间充质干细胞多向分化潜能的鉴定

人胎盘来源间充质干细胞诱导成骨实验：取第3代人胎盘来源间充质干细胞接种于6孔板，待细胞密度达到90%左右时，加入成骨细胞诱导培养基(高糖DMEM培养基，体积分数为10%胎牛血清，20 mmol/L β-甘油磷酸钠，50 mg/L维生素C，10 μmol/L地塞米松)，37 ℃，体积分数为5%CO₂恒温培养箱培养，每三四天更换1次培养基，培养3周后进行茜素红S染色检测钙盐沉积，具体方法：1×PBS漂洗细胞1次，40 g/L多聚甲醛固定细胞10 min，蒸馏水漂洗3次，10 g/L茜素红S染色5 min，弃去染料，蒸馏水冲洗5次，晾干后倒置显微镜下观察并拍照。

人胎盘来源间充质干细胞诱导成脂实验：取第3代人胎盘来源间充质干细胞接种于6孔板，待细胞密度达到90%左右时，加入成脂诱导培养基(高糖DMEM培养基，体积分数为10%胎牛血清，0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，10 mg/L胰岛素，1 mg/L地塞米松，0.2 mmol/L吲哚美辛)，37 ℃，体积分数为5%CO₂恒温培养箱培养，每三四天更换1次培养基，培养3周后进行油红O染色检测成脂分化能力，具体方法：弃去培养基，40 g/L多聚甲醛固定细胞1 h，60%异丙醇媒染，0.5%油红O染色30 min，蒸馏水冲洗5次，倒置显微镜下观察并拍照。

人胎盘来源间充质干细胞诱导成软骨实验：取第3代人胎盘来源间充质干细胞接种于6孔板，待细胞密度达到90%左右时，将低糖DMEM培养基更换为成软骨诱导培养基(StemX Vivo，CCM005，CCM006)，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂恒温培养箱培养，每三四天更换1次培养基。培养21 d后进行甲苯胺蓝染色检测成软骨形成能力，倒置相差显微镜下观察拍照。

1.4.4 生物陶瓷支架的制备 由西南交通大学材料科学与工程学院采用具有自主知识产权的甲壳素高分子溶胶-凝胶体系以及W/O乳化法制备出三维多孔羟基磷灰石陶瓷支架^[8]。扫描电镜观察支架的表面微观形貌见图1，支架材料规格：直径6 mm，高3 mm；孔隙率80%，孔径750-900 μm。

1.4.5 人胎盘来源间充质干细胞与三维多孔羟基磷灰石陶瓷支架复合共培养 制备好的支架材料经高压蒸汽消毒灭菌处理，加入24孔板，添加适量DMEM培养基，过夜平衡支架pH值，去除培养基，自然风干。将人胎盘来源间充质干细胞悬液(细胞浓度为2×10⁸ L^-¹)接种至经过预处理的支架表面。每天在倒置相差显微镜下观察支架周围细胞的生长情况，每3 d换1次培养液。

1.4.6 倒置荧光显微镜观察人胎盘来源间充质干细胞在支架表面的黏附情况 取100 μL人胎盘来源间充质干细胞接种于支架表面，于孵箱孵育60 min后，PBS洗涤3次，每次5 min，40 g/L多聚甲醛固定细胞1 h，PBS洗涤3次，每次5 min，加入适量DAPI避光孵育10 min，PBS洗涤3次，每次5 min，留少量液体于倒置荧光显微镜下观察拍照。

1.4.7 扫描电镜观察人胎盘来源间充质干细胞在支架表面的黏附形态 人胎盘来源间充质干细胞接种于支架表面共培养2 d后，取出支架/细胞复合物，PBS轻轻清洗3次，2.5%戊二醛4 ℃固定过夜，体积分数为30%，50%，75%，85%，95%，100%梯度乙醇脱水，各15 min。临界点干燥，喷金，扫描电镜观察人胎盘来源间充质干细胞在支架表面的形态。

1.5 主要观察指标 ①人胎盘来源间充质干细胞的形态；②人胎盘来源间充质干细胞表面抗原的表达及多向分化潜能的鉴定；③人胎盘来源间充质干细胞在支架表面的黏附情况。

讨论

目前骨组织工程中研究较多的是骨髓间充质干细胞，但是骨髓中间充质干细胞的含量极低，只有0.001%- 0.01%。胎盘来源间充质干细胞来源广泛、取材方便、符合伦理原则，并且能够充分保持干细胞的多能性，具有与骨髓间充质干细胞相似的生物学特性，近年来引起了学者的广泛关注，被认为是成体干细胞的理想来源^[12]。实验发现体外培养的胎盘来源间充质干细胞与骨髓间充质干细胞形态一致，呈典型的长梭形，排列均匀一致，类似于成纤维细胞样形态。流式细胞仪鉴定第5代胎盘来源间充质干细胞阳性表达CD29、CD90等干细胞表面标志，阴性表达CD45、CD106等造血细胞系表面标志^[13]。体外培养的胎盘来源间充质干细胞经成骨、成脂、成软骨诱导培养可以分化为成骨细胞、脂肪细胞以及成软骨细胞，具有干细胞多向分化潜能，进一步证实了体外培养的胎盘来源间充质干细胞的多能性，与骨髓间充质干细胞一样，可以用于组织工程骨的构建^[14]。

骨组织工程的核心是构建种子细胞-生物支架复合体的三维立体结构。羟基磷灰石是一种具有与天然骨相似生物学特性的材料，是骨组织中主要的无机成分，同时研究表明羟基磷灰石具有良好的生物相容性以及骨传导性，已广泛用于作为骨替代物^[15-16]。实验使用的多孔羟基磷灰石陶瓷支架，可以供特定的细胞或者生长因子定植，为细胞的黏附、增殖提供三维空间结构，以自然的方式启动骨组织的再生^[17-18]。

实验初步探讨了胎盘来源间充质干细胞与三维多孔羟基磷灰石陶瓷支架的体外生物相容性，通过DAPI染色以及扫描电镜观察胎盘来源间充质干细胞在三维多孔羟基磷灰石陶瓷支架表面的黏附情况及细胞形态，结果发现胎盘来源间充质干细胞在支架材料表面能够很好地黏附，同时细胞能够保持长梭形的形态，其中部分细胞伸出伪足，使其能够更好地黏附于支架表面。体外培养的胎盘来源间充质干细胞，可以作为组织工程良好的种子细胞。

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