比较人脐带和胎盘间充质干细胞对小鼠急性移植物抗宿主病的预防作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.05.007

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (5): 693-700.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.05.007

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比较人脐带和胎盘间充质干细胞对小鼠急性移植物抗宿主病的预防作用

李娟娟，王有为，马凤霞，杜文静，宋宝全，王昕，冯影，田健健，韩忠朝

中国医学科学院北京协和医学院血液病医院血液学研究所，实验血液学国家重点实验室，天津市 300020

出版日期:2017-02-18 发布日期:2017-03-20
通讯作者: 韩忠朝，教授，中国医学科学院北京协和医学院血液病医院血液学研究所，实验血液学国家重点实验室，天津市 300020
作者简介:李娟娟，女，1986年生，山东省济宁市人，汉族，北京协和医学院在读博士，主要从事血液病的基础与临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金重点项目(81330015)

Effect of human umbilical cord versus placenta mesenchymal stem cells in prevention of mouse acute graft versus host disease

Li Juan-juan, Wang You-wei, Ma Feng-xia, Du Wen-jing, Song Bao-quan, Wang Xin, Feng Ying, Tian Jian-jian,Han Zhong-chao

State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China

Online:2017-02-18 Published:2017-03-20
Contact: Han Zhong-chao, Professor, State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China
About author:Li Juan-juan, Studying for doctorate, State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81330015

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
移植物抗宿主病：是由于移植后异体供者移植物中的T淋巴细胞，经受者发动的一系列“细胞因子风暴”刺激，显著增强了其对受者抗原的免疫反应，以受者靶细胞为目标发动细胞毒攻击，其中皮肤、肝及肠道是主要的靶目标。急性移植物抗宿主病的发生率为30%-45%，慢性者发生率低于急性。
间充质干细胞移植治疗移植物抗宿主病：间充质干细胞不仅抑制免疫细胞增殖，还可通过调节免疫细胞细胞因子的分泌谱，促使树突状细胞、幼稚或效应T细胞(TH1、TH2)、自然杀伤细胞转化为更加抗炎耐受的表型，减缓异常免疫反应。

摘要
背景：目前脐带、胎盘间充质干细胞在一些急性移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)临床实验及动物模型中展现了良好的预防效果，但两种干细胞哪一个对GVHD的治疗更为有效尚无文献报道。
目的：观察比较人脐带和胎盘间充质干细胞的免疫调节功能，以及对小鼠急性GVHD的预防作用。
方法：①体外实验：取人外周血单个核细胞，分4组培养，单独培养组、植物凝集素组、植物凝集素联合脐带间充质干细胞组、植物凝集素联合胎盘间充质干细胞组。5 d后，检测外周血单个核细胞增殖及培养上清干扰素γ分泌水平；②动物体内实验：取BABL/c(H-2d)小鼠57只，8.5 Gy全身照射后分6组，单纯照射组尾静脉注射生理盐水0.5 mL；同基因脊髓移植组尾静脉注射同种异体骨髓有核细胞悬液0.5 mL；异基因骨髓移植组尾静脉注射异种骨髓有核细胞悬液0.5 mL；急性GVHD组尾静脉注射异种骨髓有核细胞与脾脏单个核细胞混合液0.5 mL；脐带干细胞组尾静脉注射异种骨髓有核细胞、脾脏单个核细胞与人脐带间充质干细胞混合液0.5 mL；胎盘干细胞组尾静脉注射异种骨髓有核细胞、脾脏单个核细胞与人胎盘间充质干细胞混合液0.5 mL。移植后11 d，进行GVHD临床症状评分；移植后3周，进行生存时间分析；移植后2周，进行皮肤、肝脏及小肠病理组织学分析。
结果与结论：①体外实验：与脐带间充质干细胞相比，胎盘间充质干细胞具有更强的抗炎功能；②动物体内实验：脐带干细胞组、胎盘干细胞组GVHD临床症状评分低于急性GVHD组(P < 0.05)，小鼠存活率高于急性GVHD组(P < 0.05)。急性GVHD组、胎盘间充质干细胞组和脐带间充质干细胞组均未发生皮肤组织病变，各组均可见小肠组织黏膜脱落病变，组间差异不明显；急性GVHD组小鼠肝脏组织可见多发性灶性坏死和大量炎症细胞浸润，胎盘干细胞组和脐带干细胞组仅见小的坏死病灶和较少的炎症细胞浸润；③结果表明，脐带和胎盘间充质干细胞均可预防小鼠急性GVHD，两者之间未见明显差异。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-3254-5008(李娟娟)

关键词: 干细胞, 移植, 脐带间充质干细胞, 胎盘间充质干细胞, 急性移植物抗宿主病, 小鼠模型, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Recently, the effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSCs) and placenta-derived mesenchymal stem cells (PDMSCs) on treatment of acute graft versus host disease (aGVHD) have been confirmed in some in vitro studies or animal models. But there are still no reports comparing the therapeutic effects of these two cell types.
OBJECTIVE: To compare the immunosuppressive function of hUCMSCs and PDMSCs in vitro or in a mouse aGVHD model.
METHODS: (1) In vitro experiment. Human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated and divided into four groups: PBMCs cultured alone, PBMCs stimulated with phytohaemagglutinin (PHA), PHA stimulated-PBMCs cocultured with hUCMSCs, PHA stimulated-PBMCs cocultured with PDMSCs. After 5 days, PBMCs proliferation and interferon-γ level in cell supernatant were measured. (2) In vivo experiment. Fifty-seven BABL/C(H-2d) mice exposed to 8.5 Gy irradiation were randomly divided into five groups: only saline injection group, syngeneic bone marrow transplantation group, allogeneic bone marrow transplantation group, aGVHD group, hUCMSCs treatment group, PDMSCs treatment group. The clinical aGVHD score, histopathology of skin, liver, and small intestine, and survival time were analyzed at days 11, 14, 21 after transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In vitro test: compared with the hUCMSCs, PDMSCs had stronger anti-inflammatory function. (2) In vivo test: The clinical scores on acute graft versus host disease were significantly lower in the hUCMSCs and PDMSCs treatment groups than that in the aGVHD group (P < 0.05). The survival rates of mice were significantly increased in the hUCMSCs and PDMSCs treatment groups compared to the aGVHD group (P < 0.05). Evident skin lesions were not found in all groups. Although small intestine mucosal lesions were found in all groups, the damage level seemed similar. Notably, significant difference was found in the liver that multifocal necrosis and a large number of inflammatory cells were seen in the aGVHD group, but less necrosis and inflammatory cells in the hUCMSC and PDMSC treatment groups. In conclusion, hUCMSC and PDMSC are comparably effective in the treatment of aGVHD in mice.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Umbilical Cord, Placenta, Mesenchymal Stem Cells, Graft vs Host Disease, Mice, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

李娟娟，王有为，马凤霞，杜文静，宋宝全，王昕，冯影，田健健，韩忠朝. 比较人脐带和胎盘间充质干细胞对小鼠急性移植物抗宿主病的预防作用[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(5): 693-700.

Li Juan-juan, Wang You-wei, Ma Feng-xia, Du Wen-jing, Song Bao-quan, Wang Xin, Feng Ying, Tian Jian-jian,Han Zhong-chao. Effect of human umbilical cord versus placenta mesenchymal stem cells in prevention of mouse acute graft versus host disease[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(5): 693-700.

图/表（结果） 2

2.1 脐带和胎盘间充质干细胞的提取鉴定 从形态观察脐带和胎盘组织来源间充质干细胞呈细小梭形(图1A)；均表达CD73、CD105、CD90，不表达造血细胞表面分子CD34、CD45、CD11b及CD19，也不表达HLA-DR(图1B)；两者均可向成脂成骨细胞诱导分化(图1 C)，符合间充质干细胞的基本特征。脐带和胎盘间充质干细胞成长较快，初始接种密度低，生长速度稍慢，当细胞达到一定密度时生长速度加快，两者之间未见明显差异(图1D)。

2.2 两种干细胞免疫调节相关基因的表达情况 实时定量PCR结果显示，脐带和胎盘间充质干细胞均表达转化生长因子β、吲哚胺2，3-二氧化酶、环氧酶2、肝细胞生长因子、白细胞介素6基因转录本(图2)。两种干细胞转化生长因子β和白细胞介素6表达水平比较差异无显著性意义(P > 0.05)；脐带间充质干细胞中吲哚胺2，3-二氧化酶、肝细胞生长因子的表达水平高于胎盘间充质干细胞(P < 0.05)，中环氧酶2表达水平低于胎盘间充质干细胞(P < 0.05)。

2.3 两种干细胞抑制外周血单个核细胞增殖和干扰素γ分泌的作用

单个核细胞增殖：流式检测CFSE标记外周血单个核细胞增殖情况，见图3A，B。单独培养组、植物凝集素组、植物凝集素联合脐带间充质干细胞组、植物凝集素联合胎盘间充质干细胞组增殖细胞比例分别为(1.000±0.173)% 、(44.770±0.914)%、(28.030±2.451)%、(27.000±1.595)%。与植物凝集素组比较，脐带和胎盘间充质干细胞均明显抑制了植物凝集素刺激的单个核细胞增殖(P < 0.05)，但不能完全抑制单个核细胞的增殖；两干细胞干预组相比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

培养上清干扰素γ分泌水平：采用ELISA检测各组培养上清干扰素γ分泌水平，结果见图3C。

单独培养组、植物凝集素组、植物凝集素联合脐带间充质干细胞组、植物凝集素联合胎盘间充质干细胞组干扰素γ分泌水平分别为(491.0±31.2)，(1 657.0±128.1)，(926.4±36.6)，(770.9±7.5) μg/L。与植物凝集素组比较，两干细胞干预组干扰素γ量均显著减低(P < 0.01)；植物凝集素联合脐带间充质干细胞组干扰素γ量高于植物凝集素联合胎盘间充质干细胞组(P < 0.05)，结果表明，胎盘间充质干细胞可能比脐带间充质干细胞具有更强的抗炎功能。

2.4 两种干细胞对急性GVHD小鼠临床症状及生存时间的影响

临床症状：单纯照射组小鼠从第7天开始出现死亡，到第13天全部死亡，体质量减轻，活动减少，但未出现GVHD症状。同基因及异基因骨髓移植组在21 d的观察期内均未出现GVHD症状。急性GVHD组在移植后第6天开始出现弓背(图4A)、体质量明显减轻(图5A)、活动减少、颤抖、腹泻症状(图4B)，而脐带和胎盘干细胞组也发生了GVHD症状，但症状明显减轻。移植后11 d临床症状评分结果显示(图5B)，急性GVHD组为7.40±0.75(n=5)，脐带和胎盘干细胞组分别为4.43±0.43(n=7)、4.00±0.26(n=6)，脐带和胎盘干细胞组临床症状评分低于急性GVHD组(P < 0.01)。

小鼠生存情况：通过kaplan-meier 的方法绘制生存曲线，Log-rank 分析方法比较各组小鼠生存率之间的差异，结果显示见图5C：单纯照射组小鼠在移植后13 d全部死亡；同基因骨髓移植组、异基因骨髓移植组、脐带干细胞组、胎盘干细胞组小鼠存活率分别为71.43%、62.50%、0、54.55%及60%。与急性GVHD组相比较，脐带和胎盘间充质干细胞均可延长小鼠的生存时间(P < 0.05)，但两干细胞组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.5 皮肤、肝脏、小肠组织的病理变化 移植后2周，取急性GVHD组、脐带干细胞组和胎盘干细胞组发生GVHD症状的小鼠皮肤、肝脏和小肠组织，进行苏木精-伊红染色，观察组织病理变化，结果见图6，各组发病小鼠皮肤组织变薄，均未见明显炎症细胞浸润；肝脏病理切片显示，急性GVHD组小鼠肝脏发生了多发性坏死病灶，大量炎症细胞浸润，而脐带和胎盘干细胞组小鼠肝脏仅有小的坏死病灶，可见少量炎症细胞浸润或在肝汇管区可见炎症因子浸润，较急性GVHD 组明显减少；各组小肠组织均可见小肠黏膜绒毛变性、脱落，隐窝受损，未见明显差异。

参考文献

[1] Baron F,Storb R.Mesenchymal stromal cells: a new tool against graft-versus-host disease? Biol Blood Marrow Transplant. 2012;18(6):822-840.

[2] Dominici M,Le Blanc K,Mueller I,et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy.2006;8:315-317.

[3] Lu LL,Liu YJ,Yang SG, et al.Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica.2006;91:1017-1026.

[4] Yen BL,Huang HI,Chien CC,et al.Isolation of multipotent cells from human term placenta.Stem Cells.2005;23:3-9.

[5] Tondreau T,Lagneaux L,Dejeneffe M,et al.Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential.Cytotherapy.2004;6:372-379.

[6] Le Blanc K,Rasmusson I,Sundberg B,et al.Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells.Lancet.2004; 363: 1439-1441.

[7] Muroi K,Miyamura K,Okada M,et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (JR-031) for steroid-refractory grade III or IV acute graft-versus-host disease: a phase II/III study. Int J Hematol.2016;103:243-250.

[8] Galipeau J.The mesenchymal stromal cells dilemma--does a negative phase III trial of random donor mesenchymal stromal cells in steroid-resistant graft-versus-host disease represent a death knell or a bump in the road? Cytotherapy. 2013;15:2-8.

[9] Wu Y,Wang Z,Cao Y,et al.Cotransplantation of haploidentical hematopoietic and umbilical cord mesenchymal stem cells with a myeloablative regimen for refractory/relapsed hematologic malignancy.Ann Hematol.2013;92:1675-1684.

[10] Jang MJ,Kim HS,Lee HG,et al.Placenta-derived mesenchymal stem cells have an immunomodulatory effect that can control acute graft-versus-host disease in mice.Acta Haematol.2013;129(4):197-206.

[11] Cooke KR,Kobzik L,Martin TR,et al.An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood.1996;88:3230-3239.

[12] Yang ZX,Han ZB,Ji YR,et al.CD106 identifies a subpopulation of mesenchymal stem cells with unique immunomodulatory properties.PloS One.2013;8:e59354.

[13] Manochantr S,U-pratya Y,Kheolamai P,et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton's jelly and umbilical cord.Intern Med J.2013;43(4):430-439.

[14] Ferrara JL,Levine JE,Reddy P,et al.Graft-versus-host disease. Lancet. 2009;373:1550-1561.

[15] Ferrara JL,Reddy P.Pathophysiology of graft-versus-host disease.Semin Hematol.2006;43:3-10.

[16] Teshima T,Ferrara JL.Understanding the alloresponse: New approaches to graft-versus-host disease prevention.Semin Hematol.2002;39(1):15-22.

[17] Murphy WJ,Welniak LA,Taub DD,et al.Differential effects of the absence of interferon-gamma and IL-4 in acute graft-versus-host disease after allogeneic bone marrow transplantation in mice.J Clin Invest.1998;102:1742-1748.

[18] Soleymaninejadian E,Pramanik K,Samadian E.Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells: cytokines and factors.Am J Reprod Immunol.2012;67:1-8.

[19] Yagi H,Soto-Gutierrez A,Parekkadan B,et al.Mesenchymal stem cells: Mechanisms of immunomodulation and homing. Cell Transplant.2010;19:667-679.

[20] Arnberg F,Lundberg J,Olsson A,et al.Intra-arterial Administration of Placenta-Derived Decidual Stromal Cells to the Superior Mesenteric Artery in the Rabbit: Distribution of Cells, Feasibility, and Safety.Cell Transplant.2016;25(2): 401-410.

[21] Kean TJ,Lin P,Caplan AI,et al.MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation.Stem Cells Int.2013;2013:732742.

[22] Aggarwal S,Pittenger MF.Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses.Blood.2005; 105:1815-1822.

[23] Waterman RS,Tomchuck SL,Henkle SL,et al.A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PloS One.2010;5:e10088.

引言

异基因造血干细胞移植是可治愈血液系统肿瘤和造血功能异常性疾病的一种有效治疗措施。急性移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)是其主要的严重并发症，发病率高，致死率高，致残率高，为恶性血液病非复发死亡的重要原因。类固醇激素为治疗急性GVHD的一线治疗药物，但约50%的患者出现激素耐药，GVHD反应无法得到控制。其他针对GVHD反应的二线治疗药物如针对T细胞表面抗原的单抗(CD3、CD25等)、化疗药物(吗替麦考酚酯、他克莫司等)，虽然对GVHD具有可靠的治疗效果，但随之而来的免疫力低下、机会性感染，严重削弱了这些药物的优势，最终并没有延长患者的生存时间^[1]。因此急需寻找一种新的有效控制激素耐药型急性GVHD的治疗措施。

间充质干细胞是一群中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，经体外诱导可向成骨、成脂及成软骨分化^[2]。间充质干细胞广泛存在于骨髓和脂肪、胎盘、脐血等组织中，可在体外迅速大量扩增，便于临床应用^[3-5]。间充质干细胞具有特殊的低免疫原性和免疫调节能力，可用于治疗自身免疫紊乱性疾病，包括系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、GVHD等。目前骨髓间充质干细胞对GVHD的治疗作用已有大量临床及实验室研究。许多临床实验结果显示，供者来源或第三方来源骨髓间充质干细胞对于糖皮质激素耐药的急性GVHD具有安全有效的治疗作用^[6-7]。但osiris公司发起的大规模多中心的随机对照临床三期试验结果显示，间充质干细胞治疗组起始治疗 28 d的总缓解率与对照组相比没有统计学差异，而间充质干细胞治疗组对肠道肝脏急性GVHD反应具有显著治疗效果。分析原因大概有一下几点：间充质干细胞来源不同，制备方法不同，给予剂量不同，注射时间不同，免疫原性不同，冻存处理差异，另外值得注意的一点是受者体内环境的差异也是影响间充质干细胞疗效的重要因素^[8]。与骨髓来源间充质干细胞相比较，脐带、胎盘来源间充质干细胞是从废弃的胎盘与脐带中提取出来的，无伦理学限制，无创伤性，获取便利，数量丰富，因此脐带、胎盘来源间充质干细胞替代骨髓来源间充质干细胞具有良好的应用前景^[3-4]。

目前脐带、胎盘间充质干细胞在一些急性GVHD临床实验及动物模型展现了良好的预防治疗效果^[9-10]。脐带和胎盘间充质干细胞哪一个对GVHD的治疗更为有效，尚无文献报道。因此在实验中，通过构建小鼠急性GVHD模型，观察比较脐带和胎盘间充质干细胞对小鼠GVHD的预防作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞水平比较和小鼠移植实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年11月在天津血液病研究所完成。

1.3 材料

胎盘：胎盘标本由天津市中心妇产医院提供，均为正常足月妊娠产妇行剖宫产取出(产妇因盆腔狭窄行剖宫产)。取标本前征得产妇及其家属同意并签署知情同意书，在严格无菌条件下采集胎盘组织。

实验动物：6-8周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠(H-2b)和雌性BALB/c小鼠(H-2d)，体质量16-21 g，购于中国医学科学院血液病研究所。所有实验小鼠均饲养于SPF级别隔离笼中，饲料及垫料均经灭菌处理，小鼠购买后，饲养1周后进行实验。所有动物实验均按照动物伦理委员要求操作。

主要试剂：流式抗体PE-CD73FITC-CD90PE- CD105PE-CD19、FITC-CD45PE-CD11bFITC-HLA-DR (BD Biosciences公司)；Ficoll 淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限公司)；CellTrace^TM CSFE(Invitrogen公司)；油红O、茜素红(sigma公司)；ABI PRISM 7900、PowerUp^TM SYBR^® Green Master Mix(Applied Biosystems)；TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(Transgene)；人IFN-γELisa试剂盒(欣博盛)。

1.4 实验方法

1.4.1 脐带和胎盘间充质干细胞的分离培养 在无菌条件下，将脐带华通胶组织和胎盘组织分别经PBS冲洗后，剪成小块，加入0.1%胶原酶Ｉ消化30 min，离心洗涤后再加入0.125%胰酶消化30 min，200目筛网过滤后，离心沉淀消化液，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/DF12培养基, 37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度培养箱内培养培养，每3 d换液1次，细胞长至80%融合时，用0.125%胰酶消化，按1∶3的比例传代培养。

1.4.2 脐带和胎盘间充质干细胞的表型鉴定 脐带和胎盘间充质干细胞培养至第3代，胰酶消化离心制备单细胞悬液，分别加入以下抗体：PE-CD73、FITC-CD90、PE-CD105、PE-CD19、 FITC-CD45、PE-CD11b、FITC-HLA-DR，4 ℃孵育30 min，离心后取细胞沉淀，加入300 μL PBS，在BD CantoII流式细胞仪检测表面分子的表达情况，Flowjo 软件分析结果。

1.4.3 绘制细胞生长曲线 将脐带胎盘间充质干细胞以2.5×10⁴接种于6孔板内，每天取3孔计数，绘制细胞生长曲线。

1.4.4 诱导脐带和胎盘间充质干细胞向成脂成骨细胞分化 将培养至第3代脐带和胎盘间充质干细胞接种至6孔板内，分别加入成脂、成骨诱导培养基，每3 d换液1次，诱导分化21 d，油红O染色观察成脂情况，茜素红染色观察成骨情况。成脂诱导培养基组分：IMDM培养基、体积分数10%FBS、100 U青霉素/链霉素、1 mmol/L丙酮酸、2 mmol/L左旋谷氨酰胺、1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX、0.5 mmol/L消炎痛和10 μmol/L胰岛素；成骨诱导培养基组分：IMDM培养基、体积分数10%FBS、100 U青霉素/链霉素、1 mmol/L丙酮酸钠、2 mmol/L左旋谷氨酰胺、0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油和50 mg/L抗坏血酸磷酸盐。

1.4.5 实时定量PCR检测 检测转化生长因子β、环氧酶2、白细胞介素6、肝细胞生长因子、吲哚胺2，3-二氧化酶基因mRNA的表达水平。Trizol 提取第3代脐带和胎盘间充质干细胞的mRNA，利用全式金的TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix将mRNA反转成为cDNA，通过 PowerUp^TM SYBR^® Green Master Mix检测试剂盒在ABI PRISM 7900 PCR检测仪上检测RNA的相对表达水平。通过2^-^??Ct方法对目的基因进行相对定量PCR每个标本重复3次，GAPDH作为内参。

??Ct=实验组(CT_目的基因-CT_GAPDH)-对照组(CT_目的基因-CT_GAPDH)。

1.4.6 体外实验

间充质干细胞与外周血单个核细胞共培养：采用Ficoll 人外周血淋巴细胞分离液提取人外周血单个核细胞(健康供者自愿捐献)，预先标记CellTrace^TM CFSE，加入10 μg/L白细胞介素2，分4组培养：单独培养组、植物凝集素组、植物凝集素联合脐带间充质干细胞组、植物凝集素联合胎盘间充质干细胞组，加入的植物凝集素质量浓度为2.5 mg/L。培养5 d，流式检测外周血单个核细胞的增殖情况，结果以% divided(发生过增殖的细胞数目除以增殖刺激前的细胞总数)表示。

Elisa 试剂盒检测培养上清人干扰素γ：收集各组培养上清，利用人干扰素γELISA检测试剂盒检测干扰素γ的分泌量。具体步骤如下：将各组标本稀释后，取100 μL加入已铺被干扰素γ抗体的96孔板中，37 ℃孵育90 min，洗涤后加入100 μL稀释后的浓缩生物素化抗体，孵育60 min后洗涤，然后加入稀释后的酶结合物孵育30 min，洗涤后加入100 μL显色底物，孵育15 min后，加入100 μL显色终止液，3 min内用酶标仪测定450 nm波长处的A值。

1.4.7 动物体内实验 所有动物实验均按照动物伦理委员要求操作。

移植前处理及实验分组：移植前1周喂食BALB/c小鼠含有200 mg/L庆大霉素的无菌酸化水，移植前24 h内给予小鼠8.5 Gy全身照射(铯源)。以C57BL/6小鼠作为骨髓移植供鼠，BABL/c作为受体鼠，进行异基因骨髓移植，或同时经尾静脉输入C57BL/6小鼠脾脏单个核细胞建造小鼠急性GVHD模型。

骨髓细胞的制备：断颈处死供鼠，体积分数75%乙醇浸泡5 min，在超净台内无菌条件下取出小鼠两股骨和胫骨，置于含体积分数2%胎牛血清的RPMI1640培养基中。用RPMI1640培养基冲洗骨髓腔，取出骨髓细胞，无菌洗液管吹打成骨髓悬液，200目滤网过滤制后，1 500 r/min离心10 min，收集细胞沉淀，加入生理盐水重悬。另外取少量细胞悬液，红细胞裂解液去除红细胞后，计数有核细胞的量。并调整骨髓悬液有核细胞浓度为5×10¹⁰ L^-¹。

脾脏单个核细胞的制备：无菌剪剪开脾脏包膜，置于并200目滤网上，浸泡在含体积分数2%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，用无菌注射器柄端轻轻碾磨脾脏，用培养基冲洗滤网数次，收集过滤后的脾脏细胞悬液，1 500 r/min离心10 min，收集脾脏细胞沉淀。PBS重悬后吹打成单细胞悬液，轻轻置于小鼠脾脏淋巴细胞分离液上层，1 800 r/min离心20 min，收集白膜层细胞，PBS洗涤2次，细胞计数后，调整细胞密度为5×10¹⁰ L^-¹，置于4 ℃冰箱待用。

脐带和胎盘间充质干细胞悬液的制备：同一供者来源的胎盘和脐带间充质干细胞在培养至3-6代时用于实验。将正在培养的胎盘、脐带间充质干细胞用0.125%胰酶消化，离心洗涤后，用生理盐水调整细胞浓度为5×10⁹ L^-¹。

尾静脉输注细胞悬液：根据实验分组将以上细胞悬液混合经尾静脉缓缓输入小鼠体内(输注过快小鼠会发生肺栓塞而死亡)，每只小鼠输注0.5 mL(生理盐水补足)。

小鼠GVHD症状评分：移植后每天观察小鼠的一般情况，包括体质量、皮毛、姿势、活动度、腹泻及精神状态，判断小鼠有无发生急性GVHD。根据Cooke等^[11]的临床GVHD症状评分标准，在移植后11 d，对各组小鼠的临床GVHD症状进行评分。

小鼠生存时间分析：收集移植后3周各组小鼠的生存数据，通过kaplan-meier 的方法绘制生存曲线，Log-rank分析方法比较各组小鼠生存率之间的差异。

组织病理检查：移植后2周，每组取3只发生GVHD的小鼠，取背部皮肤组织、肝脏、小肠组织，40 g/L多聚甲醛固定，石蜡固定包埋切片，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察各组织病理变化。

1.5 主要观察指标 人脐带和胎盘间充质干细胞的免疫调节功能，以及对小鼠急性GVHD的预防作用。

1.6 统计学分析 实验数据以均数±标准差的形式表示，由第一作者采用Student’s T检验比较2个独立实验组的差异，P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

在实验中，主要观察比较了同一供者来源人脐带和胎盘间充质干细胞对小鼠急性GVHD的预防潜能。首先，通过形态观察、免疫表型分析及诱导成脂成骨细胞分化，鉴定了所提取的脐带和胎盘间充质干细胞均符合间充质干细胞的定义标准^[2]。其次，通过体外共培养实验证明了脐带和胎盘间充质干细胞均具有抑制外周血单个核细胞增殖的作用，两者之间未有明显差异。最后，在小鼠急性GVHD模型中验证了人脐带和胎盘来源间充质干细胞均具有预防小鼠GVHD的潜能，胎盘干细胞组小鼠生存率高于脐带干细胞组，但两组间无统计学差异。以上实验结果为临床选择脐带或胎盘间充质干细胞治疗急性GVHD提供有力的动物实验依据。

脐带和胎盘间充质干细胞均表达免疫调节因子，而且两者均可抑制有丝分裂素的外周血单个核细胞增殖及干扰素γ的分泌，未发现两者免疫调节功能有明显差别。间充质干细胞是一群异质性的多功能干细胞，有些供者来源的胎盘间充质干细胞高表达CD106阳性细胞群(68%)，表现出更强的免疫抑制功能^[12]。而此次提取的胎盘间充质干细胞中CD106阳性细胞比例小于30%，可能是实验中提取的同一供者来源脐带和胎盘间充质干细胞在免疫调节功能方面没有明显差异原因。有研究报道，在体外混合淋巴细胞共培养实验中，胎盘间充质干细胞比脐带间充质干细胞免疫抑制功能稍强，但差异无统计学意义^[13]。总之，本实验结果和已报道的实验结果基本一致，在体外脐带和胎盘间充质干细胞均可抑制外周血单个核细胞的增殖。

GVHD的发生包括3个过程：①预处理方案(放射、化疗)损伤组织器官，胃肠道黏膜屏障破坏，肠道外微生物产物(细菌脂多糖等)进入血液循环刺激组织细胞(巨噬细胞)产生大量炎症因子(肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β等)，形成“炎症因子风暴”，提高宿主HLA抗原的表达；②供者T细胞识别宿主APC提呈的宿主异基因抗原，被异常激活扩增，尤其是Th1细胞亚群的扩增，分泌大量炎症因子干扰素γ；③细胞毒T细胞和激活的单核巨噬细胞分泌大量炎症因子，诱导宿主细胞凋亡；同时CD8 细胞毒T细胞可直接溶解靶细胞^[14-15]。小肠、皮肤、肝脏、肺脏是异基因T细胞攻击的主要靶器官^[16]。干扰素γ因子主要由Th1细胞产生，对GVHD的发生发展具有双向作用。输注干扰素γ基因敲除小鼠脾脏T细胞，GVHD发病率显著增高；而输注白细胞介素4基因敲除小鼠脾脏T细胞，GVHD发病率减低^[17]。间充质干细胞具有免疫调节和组织修复功能，可从多个环节控制GVHD的发生发展。间充质干细胞主要通过细胞间相接触和分泌免疫调节因子发挥免疫调节活性，后者是间充质干细胞抗GVHD的主要作用机制^[18-19]。动物实验发现间充质干细胞经静脉输入后，大部分储留在肺部很少达到GVHD的靶器官^[20]，也验证了间充质干细胞主要通过分泌免疫活性因子(转化生长因子β、前列腺素E2、肝细胞生长因子)等发挥作用的理论。同时改进间充质干细胞的输注方法，增加间充质干细胞向靶器官的归巢的数量，有利于提高间充质干细胞的治疗效果^[21]。间充质干细胞不仅抑制免疫细胞增殖，还可通过调节免疫细胞细胞因子的分泌谱，促使树突状细胞、幼稚或效应T细胞(TH1、TH2)、自然杀伤细胞转化为更加抗炎耐受的表型，减缓异常免疫反应^[22]。外界环境也可改造间充质向促炎及抗炎方向转化，影响间充质干细胞生物学活性及治疗效果^[23]。免疫细胞分泌的炎症因子(干扰素γ、白细胞介素1β等)可影响间充质干细胞的免疫调节功能，经干扰素γ预处理的间充质干细胞，可明显提高急性GVHD小鼠生存时间。同时间充质干细胞的组织修复作用可减轻内皮细胞的损伤，从源头抑制GVHD。

目前已有大量实验室和临床数据证明，骨髓来源间充质干细胞可促进造血干细胞植入，可预防治疗GVHD的发生发展。然而由于骨髓来源间充质干细胞会随着年龄的增加而逐渐减少，细胞难于大量扩增及采集具有创伤性，极大限制了其临床应用。相比骨髓间充质干细胞，脐带和胎盘间充质干细胞具有更强的增殖能力和免疫调节能力，而且取材方便无创伤，无伦理学问题，作为新的治疗细胞来源受到越来越多的关注^[13]。已有研究报道，人脐带间充质干细胞与造血干细胞共移植可促进造血干细胞植入，减少严重GVHD的发生^[9]。人胎盘间充质干细胞对GVHD的抑制作用已在小鼠GVHD模型得到了验证^[10]。在此次实验中，构建了C57BL/6→BABL/C 急性GVHD模型，比较了脐带和胎盘间充质干细胞对小鼠GVHD的预防效果。两种细胞均可延长GVHD小鼠的存活时间，移植后21 d的存活率分别为54.45%和60%，而急性GVHD组小鼠全部死亡。与Jang等^[10]构建的模型小鼠相比较，本实验所构建的(C57BL/6→BABL/C)移植小鼠发生GVHD时间更早，而且疾病进展更加迅速。产生这种差异的原因可能与向宿主BABL/C小鼠输注了更多的骨髓细胞有关：Jang等^[10]输注了5×10⁶的骨髓有核细胞，而此次实验输注了1×10⁷的骨髓有核细胞。

异常激活的T淋巴细胞及促炎因子干扰素γ的表达增加介导了(C57BL/6→BABL/C)移植小鼠 GVHD的发生。急性GVHD组小鼠肝脏组织发生多灶性坏死和大量炎症细胞浸润，而脐带和胎盘干细胞组小鼠肝脏组织病情明显减轻，炎症细胞浸润少。由此推测脐带和胎盘间充质干细胞可能通过抑制T细胞大量扩增，减少炎症因子的分泌，减轻靶器官的损伤。

虽然在小鼠模型中验证了脐带和胎盘间充质干细胞对预防GVHD发生具有相似的效果，但两种细胞是否对人GVHD具有同样的治疗效果，尚需要开展相关临床试验进行观察比较。

比较人脐带和胎盘间充质干细胞对小鼠急性移植物抗宿主病的预防作用

Effect of human umbilical cord versus placenta mesenchymal stem cells in prevention of mouse acute graft versus host disease

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[1]	项鑫健, 柳芳, 吴亮亮, 贾大平, 陶越, 赵政男, 赵宇. 高剂量维生素C促进大鼠自体脂肪移植成活[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1242-1246.
[2]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[3]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[4]	惠小珊, 白京, 周思远, 王阶, 张金生, 何庆勇, 孟培培. 中医药调控干细胞诱导分化的理论机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1125-1129.
[5]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[6]	范一鸣, 刘方煜, 张洪宇, 李帅, 王岩松. 脊髓损伤后室管膜区内源性神经干细胞反应的系列问题[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1137-1142.
[7]	轩娟娟, 白鸿太, 张继翔, 王耀权, 陈国勇, 魏思东. 调节性T细胞亚群在肝移植中的作用及临床应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1143-1148.
[8]	田川, 朱向情, 杨再玲, 鄢东海, 李晔, 王严影, 杨育坤, 何洁, 吕冠柯, 蔡学敏, 舒丽萍, 何志旭, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞调控猕猴卵巢的衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 985-991.
[9]	胡伟, 谢兴奇, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体改善脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 992-998.
[10]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[11]	周颖, 张幻, 廖松, 胡凡琦, 易静, 刘玉斌, 靳继德. 去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1012-1019.
[12]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[13]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[14]	刘峰, 彭宇环, 罗良平, 吴本清. 植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1032-1037.
[15]	闻丹丹, 李强, 沈才齐, 纪哲, 金培生. 外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1038-1044.