体外定向诱导人羊膜间充质干细胞向骨、软骨及脂肪细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.022

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (1): 122-127.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.022

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体外定向诱导人羊膜间充质干细胞向骨、软骨及脂肪细胞的分化

李豫皖，朱喜忠，金瑛，王胜民，杨继滨，熊华章，邹刚，刘毅

遵义医学院附属医院骨科，贵州省遵义市 563000

出版日期:2017-01-08 发布日期:2017-03-15
通讯作者: 刘毅，教授，硕士生导师，遵义医学院附属医院骨科，贵州省遵义市 563000
作者简介:李豫皖，男，1991年生，安徽省蚌埠市人，汉族，遵义医学院在读硕士，主要从事干细胞与组织工程，运动医学的研究。
基金资助:
贵州省科学技术基金资助项目(黔科合SY字[2010]3091)

Directional differentiation of human amniotic mesenchymal stem cells into osteoblasts, chondrocytes and lipocytes in vitro

Li Yu-wan, Zhu Xi-zhong, Jin Ying, Wang Sheng-min, Yang Ji-bin, Xiong Hua-zhang, Zou Gang, Liu Yi

Department of Orthopedics, the Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563000, Guizhou Province, China

Online:2017-01-08 Published:2017-03-15
Contact: Liu Yi, Professor, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, the Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
About author:Li Yu-wan, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, the Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
Supported by:
the Science & Technology Program of Guizhou Province, No. SY [2010]3091

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
流式细胞术：是20世纪70年代发展起来的高科学技术，集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状，还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等，可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞，并收集、储存和处理数据，进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞，分选纯度> 95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。

摘要
背景：人羊膜间充质干细胞属于成体干细胞，在体外不同条件下诱导分化为骨、软骨及其他结缔组织，较其他类型间充质干细胞，因其来源广泛，分离无创伤，较低的免疫原性、生长周期短等特点，是组织工程种子细胞的重要来源。
目的：探讨人羊膜间充质干细胞是否具有间充质干细胞特性及诱导成骨、软骨及脂肪细胞诱导分化的能力。
方法：取足月产胎盘羊膜组织，酶消化法分离人羊膜间充质干细胞，取第3代细胞分别加入成骨、成软骨及成脂诱导液的培养基进行诱导。
结果与结论：①茜素红染色显示，成骨诱导后细胞存在多个矿化结节，细胞中碱性磷酸酶活性明显增加；②甲苯胺蓝染色显示，成软骨诱导后细胞基质中分泌大量的糖胺聚糖；③油红O染色显示，成脂诱导后，细胞浆内可见脂滴；④实时荧光PCR结果显示，成骨、成软骨及成脂诱导21 d后，相关基因表达较7 d时明显增高；⑤结果人羊膜间充质干细胞具有向成骨细胞，软骨细胞及脂肪细胞的潜能，可选作为组织工程学的种子细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8116-604X(刘毅)

关键词: 干细胞, 分化, 人羊膜间充质干细胞, 成骨细胞, 成软骨细胞, 成脂细胞, 体外诱导

Abstract:

BACKGROUND: Human amniotic mesenchymal stem cells (hAMSCs) are a kind of adult stem cells that can differentiate into osteocytes, chondrocytes and lipocytes under different conditions in vitro. Compared with other mesenchymal stem cells (MSCs), hAMSCs have many advantages like wide source, noninvasive isolation, low immunogenicity and short growth cycle, making hAMSCs an important source of seed cells in tissue engineering.
OBJECTIVE: To investigate whether hAMSCs have the characteristics of MSCs and the ability of differentiation
into osteoblasts, chondrocytes and lipocytes.
METHODS: Agreed by patients, the amniotic membrane from partus maturus parturients was separated, and hAMSCs were isolated by enzyme digestion. Passage 3 cells were cultured in osteogenic, chondrogenic or adipogenic medium induction.
RESULTS AND CONCLUSION: The alizarin red staining results showed multiple mineralized nodules after osteogenic induction, and the activity of alkaline phosphatase was significantly increased after induction. The toluidine blue staining showed positive results after chondrogenic induction, and a large amount of glycosaminoglycans were secreted from the cell matrix. After adipogenic differentiation, lipid droplets were observed in the cytoplasm of the cells shown by the oil red O staining. Real-time PCR results showed the mRNA expressions of relative genes at day 21 after osteogenic, chondrogenic and adipogenic induction upregulated significantly compared with the results at day 7 (P < 0.05). These experimental results demonstrate that hAMSCs have the basic characteristics of MSCs and possess the potential of differentiation into osteoblasts, chondrocytes and lipocytes, which could be selected as the seed cells for tissue engineering.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Cell Differentiation, Amnion, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

李豫皖，朱喜忠，金瑛，王胜民，杨继滨，熊华章，邹刚，刘毅. 体外定向诱导人羊膜间充质干细胞向骨、软骨及脂肪细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(1): 122-127.

Li Yu-wan, Zhu Xi-zhong, Jin Ying, Wang Sheng-min, Yang Ji-bin, Xiong Hua-zhang, Zou Gang, Liu Yi. Directional differentiation of human amniotic mesenchymal stem cells into osteoblasts, chondrocytes and lipocytes in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(1): 122-127.

图/表（结果） 2

2.1 人羊膜间充质干细胞的形态 倒置相差显微镜观察到原代人羊膜间充质干细胞呈椭圆形、多角形或不规则形态，贴壁生长；传代后细胞大多呈长梭形，部分可见漩涡状、鱼群状生长细胞(图1)。

2.2 人羊膜间充质干细胞的鉴定 流式细胞术结果显示，人羊膜间充质干细胞呈CD73、CD90、CD105、CD44阳性，CD34，CD19，CD45，CD11b，HLA-DR阴性(图2)。

2.3 人羊膜间充质干细胞成骨诱导结果 第3代人羊膜间充质干细胞成骨诱导7 d后，细胞逐渐汇合成铺短棒、铺路石状，细胞体积变大，密度增加，逐渐向成骨细胞转化，随诱导时间增加形成多个小圆形致密矿化结节，且逐渐变大，周围细胞密度较其他区域高，培养21 d后形成片状黑褐色骨化物质，透光性差，有黑沙样物质沉积于细胞周围，细胞间可见较多致密椭圆形、圆形团块并逐步增大，轮廓不清，团块中心区逐渐变暗。茜素红染色显示矿化结节较分散，单个结节呈橘红色沉淀(图3)。诱导21 d时细胞中碱性磷酸酶活性明显高于7 d(P < 0.01；图4)。

2.4 人羊膜间充质干细胞成软骨诱导结果 成软骨诱导7 d后，可观察到人羊膜间充质干细胞细胞生长速度减缓，同时细胞形态发生明显改变，由长梭形逐渐变短、消散，核浆比降低，21 d后，软骨细胞状形态趋势更加明显(图5)。甲苯胺蓝染色可见诱导后细胞基质中分泌大量的糖胺聚糖；对照组细胞甲苯胺蓝染色后未见明显改变。

2.5 人羊膜间充质干细胞成脂诱导结果 成脂诱导7 d后，细胞排列状态紊乱，细胞由长梭形变圆并开始出现脂滴样物质，诱导21 d后，细胞浆可见脂滴存在(图6)。

2.6 诱导后相关基因的表达 与7 d相比，诱导21 d时细胞中硬骨素，RUNX-2，碱性磷酸酶，Ⅱ型胶原，过氧化物酶体增生物激活受体，脂蛋白脂酶表达水平较高(P < 0.05；表2)。

参考文献

[1] Fayyad-Kazan M, Fayyad-Kazan H, Lagneaux L, et al. The potential of mesenchymal stromal cells in immunotherapy. Immunotherapy. 2016;8(8):839-842.

[2] Kim SH, Bang SH, Kang SY, et al. Human amniotic membrane-derived stromal cells (hAMSC) interact depending on breast cancer cell type through secreted molecules. Tissue Cell. 2015;47(1):10-16.

[3] Cortes Y, Ojeda M, Araya D, et al. Isolation and multilineage differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells from abattoir-derived bovine fetuses. BMC Vet Res. 2013;9:133.

[4] Vargas D, Rosales W, Lizcano F. Modifications of Human Subcutaneous ADMSC after PPARγ Activation and Cold Exposition. Stem Cells Int. 2015;2015:196348.

[5] Fu Q, Tang NN, Zhang Q, et al. Preclinical Study of Cell Therapy for Osteonecrosis of the Femoral Head with Allogenic Peripheral Blood-Derived Mesenchymal Stem Cells. Yonsei Med J. 2016;57(4):1006-1015.

[6] 金瑛,李豫皖,张承昊,等.体外诱导人羊膜间充质干细胞向韧带细胞分化的实验研究[J].中国修复重建外科杂志,2016(2):237-244.

[7] ilioli Uranio M, Dell'Aquila ME, Caira M, et al. Characterization and in vitro differentiation potency of early-passage canine amnion- and umbilical cord-derived mesenchymal stem cells as related to gestational age. Mol Reprod Dev. 2014;81(6): 539-551.

[8] Maidhof R, Rafiuddin A, Chowdhury F, et al. Timing of mesenchymal stem cell delivery impacts the fate and therapeutic potential in intervertebral disc repair. J Orthop Res. 2016. in press.

[9] Nogami M, Kimura T, Seki S, et al. A Human Amnion-Derived Extracellular Matrix-Coated Cell-Free Scaffold for Cartilage Repair: In Vitro and In Vivo Studies. Tissue Eng Part A. 2016; 22(7-8):680-688.

[10] 洪佳琼,高雅,宋洁,等.人羊膜间充质干细胞与骨髓间充质干细胞的生物学特性及免疫抑制作用的比较[J].中国实验血液学杂志, 2016,24(3):858-864.

[11] 方宁,张路,宋秀军,等.人羊膜间充质干细胞的分离、培养及鉴定[J].遵义医学院学报,2009,32(3):234-236.

[12] Bilic G, Zeisberger SM, Mallik AS, et al. Comparative characterization of cultured human term amnion epithelial and mesenchymal stromal cells for application in cell therapy. Cell Transplant. 2008;17(8):955-968.

[13] Kim EY, Lee KB, Kim MK. The potential of mesenchymal stem cells derived from amniotic membrane and amniotic fluid for neuronal regenerative therapy. BMB Rep. 2014;47(3): 135-140.

[14] Kadam SS, Sudhakar M, Nair PD, et al. Reversal of experimental diabetes in mice by transplantation of neo-islets generated from human amnion-derived mesenchymal stromal cells using immuno-isolatory macrocapsules. Cytotherapy. 2010;12(8):982-991.

[15] Lee PH, Tu CT, Hsiao CC, et al. Antifibrotic Activity of Human Placental Amnion Membrane-Derived CD34+ Mesenchymal Stem/Progenitor Cell Transplantation in Mice With Thioacetamide-Induced Liver Injury. Stem Cells Transl Med. 2016. in press.

[16] Crane JL, Xian L, Cao X. Role of TGF-β Signaling in Coupling Bone Remodeling. Methods Mol Biol. 2016;1344:287-300.

[17] Song K, Huang M, Shi Q, et al. Cultivation and identification of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Mol Med Rep. 2014;10(2):755-760.

[18] Cui Y, Yao M, Liu Y, et al. Effects of cartilage-derived morphogenetic protein 1 (CDMP1) transgenic mesenchymal stem cell sheets in repairing rabbit cartilage defects. Genet Mol Res. 2016;15(2).

[19] Xi Q, Wang Z, Zaromytidou AI, et al. A poised chromatin platform for TGF-β access to master regulators. Cell. 2011; 147(7):1511-1524.

[20] Mueller MB, Blunk T, Appel B, et al. Insulin is essential for in vitro chondrogenesis of mesenchymal progenitor cells and influences chondrogenesis in a dose-dependent manner. Int Orthop. 2013;37(1):153-158.

[21] Zhuang H, Zhang X, Zhu C, et al. Molecular Mechanisms of PPAR-γ Governing MSC Osteogenic and Adipogenic Differentiation. Curr Stem Cell Res Ther. 2016;11(3):255-264.

[22] Contador D, Ezquer F, Espinosa M, et al. Dexamethasone and rosiglitazone are sufficient and necessary for producing functional adipocytes from mesenchymal stem cells. Exp Biol Med (Maywood). 2015;240(9):1235-1246.

[23] Song WW, McLennan SV, Tam C, et al. CCN2 requires TGF-β signalling to regulate CCAAT/enhancer binding proteins and inhibit fat cell differentiation. J Cell Commun Signal. 2015;9(1): 27-36.

引言

材料方法

1.1 设计 细胞体外分离、培养及鉴定。

1.2 时间及地点 实验于2015年11月至2016年5月在遵义医学院附属医院细胞工程实验室完成。

1.3 材料 实验所收集4个胎盘均来自遵义医学院附属医院产科足月产产妇，无其他基础疾病，术前均签署知情同意书，符合遵义医学院附属医院伦理委员会要求。

主要试剂及仪器：L-DMEM/F12培养液购自美国GIBCO公司；胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶购自美国HYCLONE公司；转化生长因子β1、地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、吲哚美辛、转铁蛋白、维生素C、亚硒酸、丙酮酸钠购自中国SOLARBIO公司；油红O、甲苯胺蓝、苏丹红购自中山金桥生物技术公司；RNAiso plus、转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自日本TAKARA公司；FACS Calibur流式细胞仪购自美国BECKMAN公司；超净工作台购自北京冠鹏净化设备公司；冷冻离心机购自德国EPPENDORF公司；倒置相差显微镜购自日本OLYMPUS公司；CO₂恒温箱购自美国THERMOSCIENTIFIC公司。

1.4 方法

1.4.1 细胞分离 在无菌条件下剥离胎盘胎儿面羊膜，4 ℃条件下转至实验室，D-Hanks液反复冲洗2次，用细胞刮刀反复清刮羊膜表面，D-Hanks液冲洗2次，将羊膜剪成大小1 mm×1 mm×1 mm的碎片，加入以羊膜体积2.5倍的0.05%EDTA-胰蛋白酶消化分别消化40 min和30 min，D-Hanks液清洗后，加入与羊膜组织等体积0.75 g/LⅡ型胶原酶，于37 ℃水浴箱中震荡消化1.5-2.0 h，至裸眼观察不到羊膜碎片，300目滤网过滤，收集细胞滤液，以1 500 r/min离心8 min。弃上清，加入含体积分数为10%胎牛血清、青霉素1×10⁵ U/L、链霉素1×10⁵ U/L、1%非必需氨基酸的L-DMEM/F12培养基重悬细胞，以1.5^-²×10⁸ L^-¹浓度接种于75 cm²培养瓶，置于37 ℃、体积分数5%CO₂及饱和湿度培养箱培养。每3 d更换1次培养基，倒置相差显微镜观察细胞形态变化。

1.4.2 细胞传代培养 倒置相差显微镜观察人羊膜间充质干细胞融合率达到80%左右，加入0.125%胰酶置于37 ℃，体积分数5%CO₂孵箱中消化2.5 min，使贴壁细胞脱落、变圆，然后加入等体积含体积分数10%胎牛血清的LG-DMEM/F12培养基终止消化，以1 500 r/min的转速离心6 min，弃上清液，加入1 mL，LG-DMEM/F12培养基吹打重悬细胞。吹打混匀后用移液枪吸取40 μL液体至0.5 mL的EP管内，吸取10 μL于细胞计数板在显微镜下进行细胞计数，细胞数(/mL)=(4个大格的总数/4)×10⁴，最后以1.5×10⁸ L^-¹细胞浓度种于75 cm²培养瓶中，人羊膜间充质干细胞传至第3代细胞种板进行试验。

1.4.3 流式细胞术鉴定第3代人羊膜间充质干细胞表面标志物 取融合率达到85%以上第3代人羊膜间充质干细胞，弃去培养液，PBS清洗2次，加入浓度为0.125%胰酶-0.02% EDTA消化液，放入37 ℃孵箱内消化3 min后，加入等体积终止液终止消化，将消化的细胞吹打混匀，以1 500 r/min的转速离心6 min，弃去上清液，PBS吹打重悬细胞，再以1 500 r/min的转速离心6 min，重复2次，调整细胞浓度至2×10⁹ L^-¹，装入流式管中，每管加入100 μL细胞悬液，室温下避光分别加入鼠抗人单克隆抗体CD44-PE，CD90-FITC，CD105-PerCP-Cy，CD73-APC和阴性对照混合液CD34-PE，CD19-PE，CD45-PE，CD11b-PE，HLA-DR，室温避光孵育30 min，每个流式管中均加入2 mLPBS，充分震荡，1 500 r/min离心6 min，弃去上清，加入250 μL PBS重悬细胞后行流式细胞仪鉴定，计算细胞表面抗原阳性率。

1.4.4 定向诱导培养

人羊膜间充质干细胞向成骨细胞诱导：对人羊膜间充质干细胞传代培养至第3代后，待细胞融合率达到70%左右，弃去培养液及未贴壁细胞，D-PBS液清洗细胞3次，用移液枪吸取残余的D-PBS液后，实验组培养液更换为成骨诱导培养基(含体积分数10%胎牛血清，10 μg/L，1×10⁵ U/L青霉素，100 mg/L链霉素，100 mg/L维生素C，10 μg/L 转化生长因子β1，10 μmol/L地塞米松，10 mmol/L β-磷酸甘油酸二钠的LG-DMEM/F12培养基)；对照组用LG-DMEM/ F12培养基培养，每隔两三天换液1次。

人羊膜间充质干细胞向软骨细胞诱导：对人羊膜间充质干细胞传代培养至第3代后，待细胞融合率达到70%左右，弃去培养液及未贴壁细胞，D-PBS液清洗细胞3次，用移液枪吸取残余的D-PBS液后，实验组培养液更换为含体积分数10%胎牛血清，1×10⁵ U/L青霉素，100 mg/L链霉素，100 mg/L维生素C，1 μmol/L地塞米松，6.25 mg/L亚硒酸，6.25 mg/L转铁蛋白，1 mmol/L丙酮酸钠，6.25 mg/L胰岛素的LG-DMEM/F12培养基；对照组用LG-DMEM/F12培养基培养，每隔两三天换液1次。

人羊膜间充质干细胞向脂肪细胞诱导：对人羊膜间充质干细胞传代培养至第3代后，按细胞密度2×10⁴/cm²接种于6孔板中，培养24-48 h后，待细胞融合率达到70%左右，弃去培养液及未贴壁细胞，D-PBS液清洗细胞3次，用移液枪吸取残余的D-PBS液后，实验组培养液更换为成脂肪细胞诱导培养基(含体积分数10%胎牛血清，1×10⁵ U/L青霉素，100 mg/L链霉素，10 mg/L胰岛素，0.1 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，1 μmol/L地塞米松的LG-DMEM-F12)，培养3 d后将诱导培养基更换为维持培养基(含体积分数10%胎牛血清，1×10⁵ U/L青霉素，100 mg/L链霉素，10 mg/L胰岛素的LG-DMEM-F12)，维持培养基培养24 h后再换回诱导培养基，按照此方法反复循环3次；对照组用LG-DMEM/F12培养基培养，每隔两三天换液1次。

1.4.5 定向诱导的鉴定

茜素红染色：取2组细胞7 d和21 d爬片，PBS液浸洗爬片3次，每次3 min，室温下4%多聚甲醛固定15分钟后，PBS液冲洗2次，每次10 min，茜素红染液染色5 min，显微镜下观察钙结节的形成情况。

碱性磷酸酶定量检测成骨率：分别取7 d和21 d的成骨诱导组细胞培养液，使用碱性磷酸酶定量检测试剂盒并于405 nm处检测吸光度值。

甲苯胺蓝染色：取2组细胞7 d和21 d爬片，PBS液浸洗爬片3次，每次3 min，4%多聚甲醛固定30 min，1%甲苯胺蓝染料染色20 min后，用无水乙醇漂洗1次，室温下干燥，镜下观察。

油红O染色：取2组细胞不同时间段细胞爬片，PBS液浸洗爬片3次，每次3 min，40 g/L多聚甲醛固定30 min，油红O染色5 min后，镜下观察细胞脂肪滴的形成情况。

1.4.6 实时荧光定量PCR检测诱导后人羊膜间充质干细胞相关基因表达 提取各组7，21 d的细胞，PBS洗3遍，使用RNAiso plus试剂提取诱导后人羊膜间充质干细胞的总RNA，反转录获得cDNA，进行RT-PCR反应，反转录反应液内容、反应条件以及qRT-PCR反应条件见表1。按照引物序列及PCR试剂盒说明书完成 PCR 反应体系；GAPDH作为内参，通过2^-^??Ct法，对各组基因表达量进行统计。引物在NCBI基因数据库中比对无误，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.5 主要观察指标 人羊膜间充质干细胞向成骨、软骨及脂肪细胞分化的效果。

1.6 统计学分析 采用SPSS 14.0统计软件对数据进行分析。数据以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

既往研究显示，人羊膜间充质干细胞其增殖能力较骨髓间充质干细胞更好^[11]，人羊膜间充质干细胞不仅表达成体干细胞特性且具有低免疫原性并向多系分化的潜能^[12]。实验结果显示高表达CD44，CD90，CD105，CD73，不表达CD34，CD19，CD45，CD11b及HLA-DR，说明人羊膜间充质干细胞具有间充质干细胞的表型特征。

在以往的研究中，间充质干细胞已有多种不同诱导方法及方式向神经样细胞、胰岛样细胞、肝脏细胞等分化^[13-15]，但很少报道人羊膜间充质干细胞向成骨、成软骨及脂肪细胞分化。在培养液中添加转化生长因子β1，维生素C，β磷酸甘油酸二钠和地塞米松，其中β磷酸甘油酸二钠可向成骨诱导细胞中提供所需钙离子及磷离子，从而加速成骨细胞形成钙盐沉淀。转化生长因子β1是一种具有多种功能的生长性多肽分子，不仅可以调节细胞的增殖分化，凋亡而且可以增加细胞外基质生成。Crane等^[16]发现经活化后的转化生长因子β1可通过Smad信号通路刺激并动员间充质干细胞向成骨细胞分化。在本实验诱导体系中加入转化生长因子β1、抗坏血酸、地塞米松和β磷酸甘油酸二钠对人羊膜间充质干细胞进行诱导分化，结果显示人羊膜间充质干细胞诱导后表达碱性磷酸酶随时间延长而增加且有骨钙盐产生，说明人羊膜间充质干细胞具有向成骨细胞分化能力。

目前人羊膜间充质干细胞向软骨细胞分化的机制尚不清楚，以往的研究提示间充质干细胞向软骨诱导分化可能包括细胞分化因子、白细胞介素2、白细胞介素12、基质金属蛋白酶2等一系列炎症信号转导通路及相关理化因素参与，如转化生长因子β1、碱性成纤维生长因子，胰岛素样生长因子^[17]，另外，Cui等^[18]发现软骨衍生形态发生蛋白1可促进软骨缺损家兔模型中Ⅱ型胶原蛋白及糖胺聚糖的生成。在体外诱导人羊膜间充质干细胞需要一定的条件才可能向软骨细胞分化，在培养体系中加入亚硒酸、维生素C、转铁蛋白、地塞米松、丙酮酸钠及胰岛素对人羊膜间充质干细胞诱导，实验结果显示诱导后的人羊膜间充质干细胞能够合成软骨细胞特异的II型胶原蛋白，并可以分泌糖胺聚糖，提示人羊膜间充质干细胞在适宜的诱导环境下可向软骨细胞分化，这点为人羊膜间充质干细胞作为软骨组织工程的种子细胞提供了一定的实验基础。转化生长因子β1对于诱导软骨分化是相对重要的诱导因子，Xi等^[19]发现转化生长因子β1通过激活Smads蛋白信号转导通路后，增加Ⅱ型胶原表达和生成，诱导效用与转化生长因子β1剂量在一定范围内存在正相关性。胰岛素对体外细胞的生长、增殖活动重要，Mueller等^[20]发现胰岛素在间充质干细胞体外诱导分化为软骨样细胞时存在剂量依从关系，胰岛素不仅可以促进Ⅱ型胶原和蛋白多糖分泌且可抑制细胞外焦磷酸钙结晶的形成，因此成软骨诱导过程中加入胰岛素必不可少。维生素C和亚硒酸可以清除细胞内外的氧自由基，延缓细胞衰老及退变，防止细胞氧化损伤，可用于较长时间的诱导观察。

脂肪细胞尤其是脂肪组织在骨质疏松发病及其治疗中发挥的作用被人们关注的越来越多。激素在间充质干细胞向脂肪细胞分化过程中主要以胰岛素样生长因子Ⅰ受体的磷酸酪氨酸激酶途径的信号通路进行^[21-22]。Song等^[23]的研究显示，类固醇激素受体结合后激活增强结合蛋白CCAAT，与过氧化物酶体增生物激活受体特异性连接启动子与反式作用因子共同激活过氧化物酶体增生物激活受体的表达，从而诱导间充质干细胞向脂肪细胞分化。3-异丁基-1-甲基黄嘌呤是环核苷酸磷酸二酯酶蛋白抑制剂，通过抑制cAMP水解酶进而提高细胞胞内cAMP的水平。cAMP通过激活反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)来调控CCAAT的表达，从而促进脂肪细胞增生。同时在此过程中，胰岛素能促进人羊膜间充质干细胞细胞增殖并合成脂肪酸及糖原。故与7 d相比，诱导21 d时细胞中过氧化物酶体增生物激活受体和脂蛋白脂酶基因表达水平显著升高。

作者证明了足月产妇分娩后的人羊膜间充质细胞具有向成骨、成软骨细胞和成脂细胞分化的能力，在构建骨及软骨组织工程学的种子细胞选择方面奠定实验基础，人羊膜间充质干细胞在未来具有临床应用前景的组织工程种子细胞，但是实验存在的不足之处为诱导剂的具体作用机制目前尚未解决，因此，仍需要下一步的深入研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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[1]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[2]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[3]	惠小珊, 白京, 周思远, 王阶, 张金生, 何庆勇, 孟培培. 中医药调控干细胞诱导分化的理论机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1125-1129.
[4]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[5]	范一鸣, 刘方煜, 张洪宇, 李帅, 王岩松. 脊髓损伤后室管膜区内源性神经干细胞反应的系列问题[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1137-1142.
[6]	田川, 朱向情, 杨再玲, 鄢东海, 李晔, 王严影, 杨育坤, 何洁, 吕冠柯, 蔡学敏, 舒丽萍, 何志旭, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞调控猕猴卵巢的衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 985-991.
[7]	胡伟, 谢兴奇, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体改善脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 992-998.
[8]	高俞锦, 彭双麟, 马治超, 陆诗, 曹花月, 王浪, 肖金刚. 糖尿病骨质疏松症模型小鼠脂肪干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 999-1004.
[9]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[10]	周颖, 张幻, 廖松, 胡凡琦, 易静, 刘玉斌, 靳继德. 去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1012-1019.
[11]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[12]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[13]	刘峰, 彭宇环, 罗良平, 吴本清. 植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1032-1037.
[14]	闻丹丹, 李强, 沈才齐, 纪哲, 金培生. 外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1038-1044.
[15]	朱兵兵, 邓江华, 陈晶晶, 慕晓玲. 白细胞介素8受体可提高脐带间充质干细胞迁移和向损伤内皮的黏附[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1045-1050.