人食管癌间充质干细胞对食管癌EC109细胞增殖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.007

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
细胞周期：是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。间期又分为3期，即DNA合成前期(G₁期)、DNA合成期(S期)与DNA合成后期(G₂期)。在1个细胞周期内，一般分裂间期占细胞周期的90%-95%，分裂期占细胞周期的5%-10%。
细胞增殖：是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老或死亡的细胞。通过细胞分裂，可以将复制的遗传物质，平均地分配到两个子细胞中去。可见，细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。

摘要
背景：研究表明肿瘤细胞释放的生长因子及细胞因子等生物信号可将间充质干细胞迁移至肿瘤组织，进而使间充质干细胞分化形成微环境中的各种基质细胞，参与调节肿瘤细胞的生长。
目的：探讨人食管癌组织间充质干细胞对食管癌EC109细胞增殖和细胞周期的影响。
方法：从食管癌组织中分离和纯化出食管癌间充质干细胞，以不同数量(1×10⁴，2×10⁴，3×10⁴，4×10⁴个)与食管癌EC109细胞系共培养，采用MTT法检测人食管癌组织间充质干细胞对EC109细胞增殖的影响；流式细胞仪检测人食管癌组织间充质干细胞对EC109细胞周期的影响。
结果与结论：①随着人食管癌组织间充质干细胞数量增加和作用时间(24，48，72 h)的延长，人食管癌组织间充质干细胞对食管癌细胞株EC-109有抑制作用，细胞存活率明显下降，差异有显著性意义(P < 0.05)；②随着人食管癌组织间充质干细胞数量的增加，食管癌细胞株EC-109 G₁期细胞比例显著增高，G₂期细胞比例显著降低；③结果表明，人食管癌组织间充质干细胞能抑制EC109细胞的增殖且改变细胞周期的分布，并呈一定的剂量和时间依赖性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0003-2992-0006(钱有辉)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 食管癌, 间充质干细胞, EC109, 细胞增殖, 细胞周期

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that biological signals such as growth factors and cytokines released from tumor cells can make mesenchymal stem cells migrate into tumor tissues, and then these cells differentiate into various stromal cells constituting a microenvironment to participate in the regulation of tumor cells.
OBJECTIVE: To investigate the effects of human esophageal cancer mesenchymal stem cells (hEC-MSCs) on the proliferation and cell cycle of human esophageal carcinoma cell line EC109.
METHODS: After isolation and purification, hEC-MSCs at 1×10⁴, 2×10⁴, 3×10⁴, 4×10⁴ were co-cultured with EC109 cells, respectively. MTT method and flow cytometry were used to measure cell proliferation and cell cycle of EC109 cells, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: With the increased number from 1×104 to 4×104 and increased exposure time from 24 to 72 hours, hEC-MSCs inhibited the proliferation of EC109 cells, and the survival rate of EC109cells was decreased significantly (P < 0.05). Cell cycle analysis revealed a marked increase in the EC-109 G₁ phase and a decrease in the EC-109 G₂ phase in a number-dependent manner. To conclude, hEC-MSCs inhibit the proliferation of EC109 cells and vary the cell cycle in number- and time-dependent manners.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Esophageal Neoplasms, Mesenchymal Stem Cells, Cell Proliferation, Cell Cycle, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 于2014年9月至2015年8月在深圳大学第一附属医院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 新鲜的食管癌组织块 来源于深圳大学第一附属医院就诊的1例食管癌患者。患者及家属签署了知情同意书，研究方案经深圳大学第一附属医院伦理委员会批准。

1.3.2 主要试剂 EC109细胞株(中科院细胞所)；胎牛血清、胰酶、高糖型改良Eagle培养基DMEM、青霉素/链霉素(Gibco公司)；二甲基亚砜、MTT、Ⅳ型胶原酶(Sigma公司)；甲醇、无水乙醇、异丙醇、氯仿、甘油等(国药集团上海化学试剂有银公司)。

1.3.3 主要仪器 净化工作台(中国苏州净化公司)；低温离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；超纯水系统(美国Millipore公司)；普通光学显微镜(日本OLYMPUS公司)；倒置相差显微镜(日本Nikon公司)；高压灭菌蒸锅(SANYO公司)；恒温培养箱(英国RSBioteeh公司)；血球计数板(浙江玉环县求精医用仪器厂)；微量加样器(德国GILSON公司)；冻存管、培养瓶、培养板(美国Corning公司)；电子分析天平(上海良平仪器仪表有限公司)；-20 ℃冰箱、-80 ℃冰箱(SANYO公司)。

1.3.4 主要试剂配制 ①人食管癌间充质干细胞培养液：高糖DMEM培养基，体积分数为10%胎牛血清，1%双抗溶液；②MTT溶液：称取100 mg MTT粉末，加入20 mL PBS，搅拌溶解，0.22 μm过滤除菌，分装，4 ℃下保存备用；③0.01 mol/L PBS：8.0 g NaCl+0.2 g KCl+1.56 g Na₂HPO₄•12H₂O+0.2 g KH₂PO₄+1 000 mL蒸馏水溶解，调pH值为7.2-7.4，0.22 μm滤膜过滤除菌，4 ℃下保存备用；④0.25 U/μL Ⅳ型胶原酶溶液：称取0.3 mg的Ⅳ型胶原酶溶于200 μL生理盐水中，于振荡器上摇匀至完全溶解，将其分装成每小管50 μL，-20 ℃保存备用；⑤细胞冻存液：9份体积分数为10%胎牛血清的培养液和1份二甲基亚砜混合。

1.4 方法

1.4.1 食管癌组织间充质干细胞的分离纯化 新鲜的食管癌组织块用含双抗的高糖DMEM培养基和含氟康唑的磷酸盐缓冲液各浸泡约15 min，洗涤3次，剥离血管组织，洗净残留血液，将组织块剪碎成2-4 mm的组织小块，加入0.25 U/μL Ⅳ型胶原酶溶液消化30 min，1 000 r/min离心6 min，加入DMEM培养基混悬，小心吹打均匀，转移到含体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，接种于25 cm培养瓶，于37 ℃，体积分数为5% CO₂细胞培养箱中培养，2 d后待细胞接近融合时，0.25%胰酶消化，用移液枪将贴壁细胞吹打混匀，细胞按1︰2比例传代培养，即得到纯化的间充质干细胞。

1.4.2 MTT法检测细胞增殖 收集对数生长期的EC109细胞，制成单细胞悬液，以2×10⁵/孔的细胞密度接种于96孔板，每孔200 μL，培养24 h细胞贴壁，弃去上清。培养板分为5组，每组6个复孔。单纯用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基培养作为对照组，每孔加入1×10⁴，2×10⁴，3×10⁴，4×10⁴人食管癌组织间充质干细胞共培养作为实验组，培养12，24，48 h后，每孔加入MTT溶液20 μL，继续孵育4 h，吸弃上清液，每孔加入二甲基亚砜溶液100 μL，室温振荡10 min，待结晶完全溶解后，用全自动酶标仪读取570 nm吸光度值，按照下列公式计算存活率，重复实验3次。存活率=实验组吸光度值/对照组吸光度值×100%。

1.4.3 流式细胞仪检测细胞周期 收集对数生长期的EC109细胞，制成单细胞悬液，以2×10⁵/孔的细胞密度接种于96孔板，单纯用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基培养作为对照组，每孔加入1×10⁴，2×10⁴，3×10⁴，4×10⁴个人食管癌组织间充质干细胞作为实验组，培养24 h后，PBS洗2次，胰酶消化后离心，用体积分数为75%乙醇制成单细胞悬液，细胞浓度为3×10⁷ L^-¹，混匀，4 ℃冰箱中静置30 min，加核糖核酸酶A至质量浓度为50 mg/L，37 ℃烘箱30 min，加PI至终质量浓度为60 mg/L，冰浴中避光染色30 min，过滤，用流式细胞仪进行细胞周期分析。

1.5 主要观察指标 EC109细胞存活率及细胞周期。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计数资料比较用卡方检验；计量资料用x(_)±s表示，进行两组间独立样本t 检验及配对样本t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

食管癌是一种严重危及人类健康的恶性疾病，是目前医学面临的重大挑战，中国食管癌的发病率不断年轻化，并且死亡率和发病率也在逐年升高^[10]，对于食管癌主要以手术治疗为主，放化疗为辅，手术治疗损伤大、风险高、容易出现并发症，放化疗在杀死肿瘤细胞的同时也严重损害正常细胞，对人体造成巨大伤害。干细胞技术的发展，给目前难以治愈令人困扰的疾病如癌症、糖尿病、心脑血管疾病等带来了新的希望。干细胞根据来源不同分为胚胎干细胞和成体干细胞。在生物体的各种组织中广泛存在着成体干细胞，其主要维持组织、器官功能和结构的稳态^[11]。干细胞可定向分化为神经细胞、心肌细胞、内皮细胞等多种功能细胞，从而替代受损的细胞，并且还能够激活细胞的再生修复能力以促进损伤组织恢复^[11-12]，因此近年来干细胞治疗已经成为各种疾病的研究热点，也给患者带来了一种新的治疗方法。间充质干细胞具有极好的迁移能力和肿瘤趋向性，其表面可表达多种生长因子的受体，在肿瘤生长微环境中，肿瘤细胞及其周围的纤维基质分泌各种细胞因子可促进间充质干细胞向肿瘤部位迁移集聚并增殖分化参与肿瘤微环境中基质的形成，进而影响肿瘤的生长^[13-14]。

将体外扩增好的间充质干细胞移植入体内，可发挥促损伤修复和组织再生的功能，其可能的原因在于^[15-16]：①间充质干细胞在损伤微环境下，可定向分化为特定类型的功能细胞，直接修复损伤组织；②间充质干细胞可移至损伤部位，通过分泌细胞因子和生长因子，改善损伤组织的微环境，促进宿主细胞组织中残存的细胞存活及增殖。基于以上原因，间充质干细胞的生物特性均与组织微环境有密不可分的关系。实验结果显示随着人食管癌组织间充质干细胞数量增加和作用时间(24，48，72 h)的延长，人食管癌组织间充质干细胞对食管癌细胞株EC109有抑制作用，细胞存活率明显下降，证明干细胞对食管癌细胞具有抑制生长的效果。

目前关于间充质干细胞对肿瘤细胞生长和增殖等生物学行为的影响已初有成效。肿瘤组织代谢旺盛，细胞生长迅速，与正常组织受损时的微环境有很多相似之处^[17]，大量实验均已证实间充质干细胞具有靶向迁移到肿瘤组织的特性^[18-19]。间充质干细胞通过再循环途径到达肿瘤部位后，混合于肿瘤支持细胞中，从而参与构成肿瘤的微环境^[20]。国内外实验研究发现乳腺癌细胞系可诱导微环境中的间充质干细胞过表达，进而增加乳腺癌细胞的转移、迁移和侵袭能力^[21]。还有实验研究表发现间充质干细胞进入肿瘤组织后可分化为肌纤维母细胞，促进肿瘤细胞的进一步生长与转移等^[22-24]。研究表明，间充质干细胞在肿瘤细胞作用下可分化成血管内皮细胞，对肿瘤血管生成有一定的促进作用，进而导致肿瘤组织的再生长与转移等^[25-27]。对间充质干细胞进行修饰进行肿瘤基因治疗的方式主要是携带自杀基因、凋亡基因、抗血管发生基因、免疫刺激基因或者溶瘤病毒载体，体内外实验证实了这种方法能够有效治疗肿瘤。目前主要是通过病毒载体将需携带的基因转染进间充质干细胞^[28-29]。体内体外实验证明，携带IFN-γ等基因的间充质干细胞能显著抑制肿瘤细胞的生长，并能抑制肿瘤细胞的转移^[30]。间充质干细胞本身也具有抑制肿瘤的作用，对肺癌GLC-82细胞系和A549细胞系的转移有显著抑制作用^[31-33]。

干细胞与肿瘤的关系也存在争议，有不少研究认为间充质干细胞在体内可对免疫淋巴细胞产生抑制作用，从而促进肿瘤细胞的生长^[34-36]。由于人食管的开放性，导致食管癌等肿瘤组织很容易受到细菌、真菌等微生物感染，所以在人食管癌间充质样干细胞分离、培养操作过程中要特别注意灭菌，防止真菌等污染。从食管癌组织中分离和纯化出食管癌间充质干细胞，以不同数量(1×10⁴，2×10⁴，3×10⁴，4×10⁴个)与食管癌EC109细胞系共培养，采用MTT法检测人食管癌组织间充质干细胞对EC109细胞增殖的影响，流式细胞仪方法检测人食管癌组织间充质干细胞对EC109细胞周期的影响。结果发现，随着人食管癌组织间充质干细胞数量增加和作用时间的延长，人食管癌组织间充质干细胞对食管癌细胞株EC-109有抑制作用，细胞存活率明显下降，可显著抑制肿瘤细胞的增殖；流式细胞仪结果表明，随着人食管癌组织间充质干细胞数量的增加，G₁期细胞的比例显著增高，G₂期细胞的比例显著降低，表明人食管癌组织间充质干细胞能抑制EC109细胞的增殖且改变细胞周期的分布，使更多的细胞进入增殖停顿期，降低其分裂的数量，并呈一定的时间依赖性。