直接共培养诱导人脐带间充质干细胞向软骨细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.004

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (1): 18-24.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.004

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直接共培养诱导人脐带间充质干细胞向软骨细胞的分化

李兴福¹，段莉²，梁宇杰³，朱伟民²，王大平²

1广州医科大学，广东省广州市 510182
2深圳市组织工程重点实验室，深圳市第二人民医院，广东省深圳市 518035
3北京大学深圳研究生院，广东省深圳市 518035

修回日期:2016-10-17 出版日期:2017-01-08 发布日期:2017-03-15
通讯作者: 王大平，博士，主任医师，教授，博士生导师，深圳市组织工程重点实验室，深圳市第二人民医院，广东省深圳市 518035
作者简介:李兴福，男，1988年生，山东省邹城市人，汉族，广州医科大学在读硕士，医师，主要从事创伤骨科、骨组织工程的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81572198，81260161，81000460)；广东省自然科学基金项目(2015A030313772)；深圳市科技创新委技术攻关项目(JSGG2014051905550503)；深圳市科技创新委国际科技合作项目(GJHZ20130412159306739)；深圳市重点实验室提升项目(CXB201104220049A)；深圳市科技计划基础研究项目(JCYJ20140414470821200，JCYJ20140414170821160)；中国博士后科学基金面上项目(2013 M530385)

Differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into chondrocytes induced by direct co-culture with chondrocytes

Li Xing-fu¹, Duan Li², Liang Yu-jie³, Zhu Wei-min², Wang Da-ping²

1Guangzhou Medical University, Guangzhou 510182, Guangdong Province, China
2Shenzhen Key Laboratory of Tissue Engineering, Shenzhen Second People’s Hospital, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China
3Peking University Shenzhen Graduate School, Shenzhen 518055, Guangdong Province, China

Revised:2016-10-17 Online:2017-01-08 Published:2017-03-15
Contact: Wang Da-ping, M.D., Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Shenzhen Key Laboratory of Tissue Engineering, Shenzhen Second People’s Hospital, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China
About author:Li Xing-fu, Studying for master’s degree, Physician, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510182, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81572198, 81260161, 81000460; the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2015A030313772; the Tackle Key Project of Shenzhen Science and Technology Innovation Commission, No. JSGG2014051905550503; the International Scientific Cooperation Project of Shenzhen Science and Technology Innovation Commission, No. GJHZ20130412159306739; the Promotion Project of Shenzhen Key Laboratories, No. CXB201104220049A; Shenzhen Science and Technology Research Project, No. JCYJ20140414470821200, JCYJ20140414170821160; China Postdoctoral Science Foundation, No. 2013M530385

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
共培养：20世纪80年代后期，为了建立更类似于体内环境的培养体系，尽可能使体外环境与体内环境相吻合，从而使细胞间能相互沟通信息，相互支撑生长增殖，人们在细胞培养技术的基础上发展出了细胞共培养技术。细胞共培养技术是将2种或2种以上的细胞共同培养于同一环境中，由于其具有更好地反映体内环境的优点，所以这种方法被广泛应用于现代细胞研究中。
脐带间充质干细胞：是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞。其在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。有报道从人脐带中分离出间充质干细胞，细胞含量、增殖能力优于骨髓间充质干细胞，免疫原性比骨髓间充质干细胞低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。

摘要
背景：软骨细胞和间充质干细胞都可用于构建组织工程化软骨，但体外培养的软骨细胞容易发生去分化，表型难以维持，以致其临床应用受到限制。
目的：探讨人脐带间充质干细胞与人关节软骨细胞直接共培养对人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化的影响，以及直接共培养的最佳比例。
方法：分离培养人脐带间充质干细胞并通过流式细胞仪鉴定表面标志。实验分为6组：直接共培养组按照人脐带间充质干细胞与人关节软骨细胞比例为 1∶1，3∶1及5∶1(人脐带间充质干细胞∶人关节软骨细胞)进行共培养；阳性对照组用转化生长因子β1细胞因子诱导；人关节软骨细胞空白对照组和人脐带间充质干细胞空白对照组。免疫荧光细胞化学检测Ⅱ型胶原(COL2A1)的表达水平；Western blot检测细胞SOX9Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原蛋白表达水平；实时荧光定量qRT-PCR检测SOX9、Col1a1、Col2a1 mRNA表达。
结果与结论：①成功分离并鉴定人脐带间充质干细胞；②人脐带间充质干细胞与软骨细胞共培养28 d后，共培养组及单独药物诱导的阳性对照组Ⅱ型胶原免疫荧光检测均呈阳性；③阳性对照组的Col2a1 mRNA表达水平高于共培养组，但Ⅱ型胶原蛋白表达总量低于共培养组，1∶1共培养组的Col2a1 mRNA表达水平高于3∶1和5∶1共培养组。阳性对照组和共培养组的Col1a1 mRNA表达水平和Ⅰ型胶原蛋白表达水平均低于人关节软骨细胞空白对照组。④结果说明，人脐带间充质干细胞和人关节软骨细胞直接共培养可明显促进人脐带间充质干细胞向软骨样细胞诱导分化，并有效抑制细胞纤维化，从缩减软骨细胞用量方面看，直接共培养体系的适宜比例为5∶1。采用直接共培养诱导人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的成本较低，是一种较为经济合理的诱导方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-5044-8098(李兴福)

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 共培养, 人脐带间充质干细胞, 人关节软骨细胞, 软骨细胞分化, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Both chondrocytes and mesenchymal stem cells (MSCs) can be used to construct tissue-engineered cartilage. Chondrocytes cultured in vitro however are prone to dedifferentiation and difficult to maintain phenotypes, and accordingly, their clinical application is limited.
OBJECTIVE: To explore the effect of human articular chondrocytes and human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) co-culture in vitro on the chondrogenic differentiation of hUC-MSCs and to optimize the co-culture ratio.
METHODS: The hUC-MSCs surface marker was identified by flow cytometry. Human articular chondrocytes and hUC-MSCs were co-cultured at the ratio of 1:1, 3:1 and 5:1. The hUC-MSCs induced by transforming growth factor-beta 1 were set as a positive control group. Human articular chondrocytes and hUC-MSCs cultured alone were set as two negative control groups. The expression level of type II collagen (COL2) was analyzed by immunofluorescence staining. The protein expression of SRY-box9 (SOX9), type I collagen (COL1) and COL2 were determined by western blot. The mRNA levels of SOX9, Col1a1 and Col2a1 were detected by quantitative real-time PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: The hUC-MSCs were isolated from the human umbilical cord and identified with flow cytometry. After 28 days of culture, both the co-culture group and the positive control group were observed with positive staining under the immunofluorescence microscope. The Col2a1 mRNA expression level of the positive control group was higher than that of the co-culture group, but the total COL2 protein expression was lower. The Col2a1 mRNA expression level of the co-culture group in 1:1 was higher than that of the co-culture group in 3:1 or 5:1. Col1a1 mRNA and COL1 protein expression levels of the positive control group and co-culture group were lower than those of human articular chondrocyte negative control group. To conclude, the co-culture of hUC-MSCs and human articular chondrocytes significantly induces the hUC-MSC differentiation into chondrocytes and effectively restrains cell fibrosis. The optimal cell ratio in the co-culture system is demonstrated to be 5:1 (hUC-MSCs:chondrocytes). Therefore, the direct co-culture can be an economic way for inducing hUC-MSC differentiation into chondrocytes, which provides reliable seeding cells for cartilage tissue engineering.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cells, Chondrocytes, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

李兴福，段莉，梁宇杰，朱伟民，王大平. 直接共培养诱导人脐带间充质干细胞向软骨细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(1): 18-24.

Li Xing-fu, Duan Li, Liang Yu-jie, Zhu Wei-min, Wang Da-ping. Differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into chondrocytes induced by direct co-culture with chondrocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(1): 18-24.

图/表（结果） 2

2.1 人脐带间充质干细胞表面抗原标志物检测结果 流式细胞仪检测细胞表面抗原的结果显示，人脐带间充质干细胞高表达CD105和CD73，低表达CD34和CD45(图1)，符合间充质干细胞的免疫学特性。

2.2 Ⅱ型胶原的定性检测结果 人脐带间充质干细胞空白对照组免疫荧光染色呈阴性，而人关节软骨细胞空白对照组、阳性对照组和共培养组的细胞染色均呈阳性，胞质及细胞外基质均呈现红色荧光(图2)，共培养组的荧光信号最强，且组内无明显差异。

2.3 实时定量PCR检测SOX9、Col1a1和Col2a1 mRNA表达 共培养组的SOX9 mRNA表达量均高于阳性对照组(P < 0.05)，3∶1共培养组相对表达量最高(P < 0.05)。另外，空白对照组的SOX9 mRNA表达量均低于阳性对照组(P < 0.05)，人脐带间充质干细胞空白对照组的表达量最低(P < 0.05)(图3A)。

1∶1和5∶1共培养组的Col1a1 mRNA表达量与阳性对照组相比无明显差异(P > 0.05)，但3∶1共培养组的Col1a1 mRNA表达量比阳性对照组高(P < 0.05)，人脐带间充质干细胞空白对照组的Col1a1 mRNA表达量最低(P < 0.05)，人关节软骨细胞空白对照组的Col1a1 mRNA表达量最高(P < 0.05)(图3B)。

与空白对照组相比，共培养组和阳性对照组的Col2a1 mRNA表达量较高(P < 0.05)，其中阳性对照组表达最高，人脐带间充质干细胞空白对照组表达量最低(P < 0.05)。共培养组中人脐带间充质干细胞比例增加，Col2a1 mRNA表达量降低(P < 0.05)(图3C)。

2.4 Western-blot检测SOX9、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原蛋白表达 共培养组SOX9 蛋白表达量高于阳性对照组，且组内无明显差异。人关节软骨细胞空白对照组SOX9 蛋白表达量最高，而人脐带间充质干细胞空白对照组SOX9 蛋白表达量最低(图4)。

共培养组Ⅰ型胶原蛋白表达量略高于阳性对照组，且组内无明显差异。阳性对照组和人脐带间充质干细胞空白对照组无明显Ⅰ型胶原蛋白表达，而人关节软骨细胞空白对照组Ⅰ型胶原蛋白表达量最高。与空白对照组和阳性对照组相比，共培养组Ⅱ型胶原蛋白表达量较高，且组内无明显差异。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学实验观察。

1.2 时间及地点 实验于2015年5至9月在深圳市第二人民医院中心实验室完成。

1.3 材料 Ⅱ型胶原蛋白酶、胰蛋白酶、地塞米松，胰岛素样生长因子1、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂(ITS)、维生素C (Sigma-Aldrich公司)，MesenGro培养液(StemRD公司)、DMEM/F12培养基(美国Hyclone公司)，转化生长因子β1(PeproTech公司)，人脐带间充质干细胞流式检测抗体购置于Bioscience公司，胎牛血清及胰蛋白酶(美国Gibco公司)，Trizol(美国Invitrogen公司)，反转录试剂盒、 RT-PCR试剂盒(日本Takara公司)，实时荧光定量上游引物(上海生工)。其余生化试剂无特别说明均购自美国Sigma公司。

1.4 实验方法

1.4.1 人脐带间充质干细胞的提取、培养及鉴定 实验用新生儿脐带(n=7)，取自深圳市第二人民医院妇产科，产妇体健，足月剖宫产，产妇及其家属均签署知情同意书，实验方案经医院医学伦理会批准。

无菌条件下，取脐带5-8 cm，剔除血管和外膜后，余下的胶冻状组织，即沃顿胶(Wharton，sjelly，WJ)剪碎至1.0-2.0 mm³大小，按一定比例均匀放置于含MesenGro培养液的培养皿中，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱内培养。待细胞游出后，用胰蛋白酶消化离心，置于T25培养瓶进行传代培养，待细胞长至80%-90%融合时，消化离心后加入新培养基置37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱培养并观察细胞生长情况。当人脐带间充质干细胞培养至第3代，用流式细胞仪检测其表面抗原(CD105-PE、CD73-APC、CD34-PE、CD45-FITC)^[4]。

1.4.2 人关节软骨细胞的原代及传代培养 人关节软骨由深圳市第二人民医院创伤骨科提供，自愿者及其家属均签署知情同意书，实验方案经医院医学伦理会批准。

无菌条件下，取外伤患者截肢关节软骨，Ⅱ型胶原酶消化后过滤，离心，弃上清，收集软骨细胞，接种于新的培养瓶。待细胞达到80%-90%汇合时，消化、传代成第1代细胞，置37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱继续培养^[12]。

1.4.3 人脐带间充质干细胞和人关节软骨细胞共培养 取对数增殖期的第3代人脐带间充质干细胞和第2代人关节软骨细胞，接种于放有DMEM/F12培养液的六孔板直接共培养体系中，按表1所示比例共培养。

以分别单独培养人脐带间充质干细胞和人关节软骨细胞为空白对照，以转化生长因子β1细胞因子诱导人脐带间充质干细胞成软骨细胞为阳性对照。待细胞长至80%-90%汇合时，阳性对照组加入成软骨细胞诱导培养基进行培养；实验组和阴性对照组仍用DMEM/F12培养液进行培养。

1.4.4 Ⅱ型胶原的免疫荧光检测 共培养28 d后，细胞用PBS洗3次，40 g/L多聚甲醛固定10 min，然后用PBS洗3次，0.2%Triton X100透膜处理，再用PBS洗3次，5%的牛血清白蛋白(BSA)室温湿盒封闭30 min。PBS洗3次，Ⅱ型胶原一抗(1∶100)4 ℃孵育过夜。PBS洗3次，兔抗鼠的FITC标记的二抗(1：200)室温避光孵育60 min。PBS洗3次，DAPI室温避光孵育10 min，PBS洗3次，荧光显微镜观察并拍照^[13]。

1.4.5 实时定量PCR检测SOX9、COL1A1和COL2A1 mRNA表达 取第3代人脐带间充质干细胞、共培养前后及诱导分化后的人脐带间充质干细胞用Trizol试剂盒按说明书提取细胞总RNA。微量紫外分光光度计(Nanodrop)测RNA纯度及含量，各RNA样本(A₂₆₀/A₂₈₀)均在1.7-2.1。取2.5 μg RNA，根据反转录试剂盒说明书将RNA转录成cDNA。

Real-time PCR试剂盒进行实时定量PCR检测。取上述反转后cDNA产物1 μL做模板，以GAPDH作为内参照，利用SYBR Green Ⅰ染料实时定量PCR检测SOX-9、Ⅱ型胶原、Ⅰ型胶原基因在不同处理组中的相对表达量，qRT-PCR反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环；90 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min。重复3次实验，取平均值，用GADPH作为内参。数据分析采用??Ct方法^[12]，数据取3次重复实验的平均值，所使用引物序列见表2^[14]。

1.4.6 Western-blot检测SOX9、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原蛋白表达水平 共培养28 d后，用RIPA lysis buffer提取细胞总蛋白，SDS-PAGE电泳后转印到PVDF膜上。分别以SOX9、COL1A1和COL2A1 一抗及带HRP的二抗进行曝光检测蛋白的表达水平^[15]。

1.5 主要观察指标 ①人脐带间充质干细胞的表面抗原标志物检测结果；②Ⅱ型胶原的定性检测结果；③实时定量PCR检测SOX9、Col1a1和Col2a1 mRNA的表达；④Western-blot检测SOX9、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原蛋白表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS 16.0统计软件对实验数据进行进行One．Way ANOVA分析，P < 0.05表示差异具有显著性意义。

讨论

体外大量扩增软骨细胞是构建组织工程化软骨的一个关键步骤，在体外扩增过程中，软骨细胞容易发生去分化，导致软骨细胞表型丧失^[16-22]。软骨细胞去分化后产生的细胞外基质以I型胶原为主，与Ⅱ型胶原相比，其机械强度、弹性模量等力学性能明显降低^[23-24]。因此，如何避免软骨细胞去分化，维持软骨细胞表型成为软骨组织工程领域亟需解决的问题。

已有大量的研究表明，利用共培养技术可为软骨组织工程提供优质的种子细胞，如通过人脐带间充质干细胞与软骨细胞共培养有望解决种子细胞的供应问题。首先，人脐带间充质干细胞高表达CD73和CDl05，低表达CD34和CD45，镜下形态呈纤维细胞样，符合间充质干细胞的细胞学特性^[25-28]，还可分泌成纤维细胞生长因子促进软骨细胞增殖^[29]。其次，软骨细胞分泌多种生长因子，如转化生长因子β、骨形态发生蛋白、胰岛素样生长因子等^[30-32]，促进间充质干细胞向成软骨细胞分化，并分泌甲状旁腺素相关蛋白抑制间充质干细胞在分化过程中肥大化^[33]。

罗二梅等^[34]利用Transwell体系将人脐带间充质干细胞和兔膝关节软骨细胞按1∶4，1∶3，1∶2，1∶1，2∶1，3∶1及4∶1(人脐带间充质干细胞：兔膝关节软骨细胞)的比例共培养，21 d后发现原人脐带间充质干细胞的甲苯胺蓝染色及免疫荧光反应均呈阳性，且GAG、Ⅱ型胶原含量及mRNA表达量1∶4实验组均要高于其他实验组和阳性对照组，研究表明人脐带间充质干细胞和兔关节软骨细胞的间接共培养可明显促进人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化，且最佳间接共培养比例为1∶4。Zuo等^[35]将大鼠的软骨细胞和骨髓间充质干细胞以2:1比例在体外分别直接和间接共培养3周后用流式细胞仪分离，通过实时定量PCR和免疫印迹检测发现，直接共培养组中软骨细胞的SOX-9、Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖(aggrecan) mRNA和蛋白表达水平明显高于间接共培养组中软骨细胞的表达水平，并在骨髓间充质干细胞也发现类似的结果，研究表明直接共培养比间接共培养更有利于骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。然而，人脐带间充质干细胞和软骨细胞共培养的最佳比例仍未确定。

实验将人关节软骨细胞与人脐带间充质干细胞体外直接共培养28 d，免疫荧光检测Ⅱ型胶原表达，共培养组均呈阳性，且组内无明显差异，共培养组荧光强度比阳性对照组和空白对照组强，而人脐带间充质干细胞空白对照组荧光染色呈阴性，提示直接共培养可诱导人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化，5∶1共培养组可大量缩减软骨细胞用量，并达到较为理想的诱导效果。实时定量PCR检测显示共培养组和阳性对照组的SOX9 mRNA表达较空白对照组有明显升高，3∶1共培养组最突出；共培养组和阳性对照组的Ⅱ型胶原mRNA表达较空白对照组有明显升高，阳性对照组最突出，提示共培养和药物诱导均可促进人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化。Western-blot检测显示共培养组的SOX9和Ⅱ型胶原蛋白表达较阳性对照组和空白对照组有明显提高，且组内无明显差异，提示共培养可促进人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化， 5∶1共培养组可节省软骨细胞用量，并产生理想的诱导效果。上述结果提示共培养可有效促进人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化。

人关节软骨细胞与人脐带间充质干细胞直接共培养 28 d后，免疫荧光检测Ⅱ型胶原表达，共培养组的荧光强度比人关节软骨细胞空白对照组强，提示直接共培养有利于维持软骨细胞表型。实时定量PCR检测显示共培养组和阳性对照组的Ⅰ型胶原A1 mRNA表达受到明显抑制，而人关节软骨细胞空白对照组的Ⅰ型胶原A1 mRNA表达水平明显升高，提示共培养和药物诱导均可抑制人关节软骨细胞去分化，利于维持软骨细胞表型。Western-blot检测显示共培养组和阳性对照组的Ⅰ型胶原蛋白表达水平较低，而人关节软骨细胞空白对照组的Ⅰ型胶原蛋白表达水平较高，提示共培养和药物诱导均可有效抑制人关节软骨细胞去分化，维持软骨细胞表型。上述结果提示共培养可有效抑制软骨细胞去分化，维持软骨细胞表型。

结论：研究结果提示一定比例的直接共培养可明显增强人脐带间充质干细胞成软骨分化的能力，且有效抑制细胞纤维化，人脐带间充质干细胞与人关节软骨细胞直接共培养的适宜比例或为5∶1。然而，人脐带间充质干细胞分化为软骨细胞的具体机制还需进一步研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

直接共培养诱导人脐带间充质干细胞向软骨细胞的分化

Differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into chondrocytes induced by direct co-culture with chondrocytes

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