髓核细胞凋亡调控中的MicroRNA-182

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.42.010

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
MicroRNA：是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。到目前为止，在动植物以及病毒中已经发现有28 645个miRNA分子(Release 21: June 2014)。大多数miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster)的形式存在于基因组中。
质粒：是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。大部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的线粒体等胞器中。然而，1984年在Streptomyces coelicoler(天蓝色链霉菌)等放线菌以及在Borrelia hermsii(赫氏蜱疏螺旋体)等原核生物中，又相继发现线形质粒。

摘要
背景：前期从中发现hsa-miR-182可能与髓核细胞中凋亡相关基因细胞色素C(cytochrome C，Cycs)基因及钙调磷酸酶(calcineurin)的C亚基CnB(PPP3R1)基因有密切联系。
目的：以质粒为载体，将miR-182及细胞色素C和PPP3R1基因转染进髓核细胞系，检测细胞系中凋亡相关基因细胞色素C及PPP3R1的表达量，明确miR-182是否参与髓核细胞凋亡的调控。
方法：miR-182进行生物信息学预测，将其与预测得到的目标基因进行质粒合成并转染髓核细胞，并建立空白对照，最后进行细胞裂解检测目标基因表达情况。
结果与结论：①经检测，miR-182较空白对照组髓核细胞对细胞色素C基因的表达有明显的抑制作用(P < 0.05)；②与空白对照组比较，miR-182对于PPP3R1基因的表达无抑制作用。③结果表明，miR-182对于髓核细胞凋亡相关基因细胞色素C有明显抑制作用，可能参与髓核细胞凋亡的调控。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-6701-2397(赵波)

关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 髓核细胞, microRNA, 细胞色素C, 钙调磷酸酶亚基B基因, 凋亡

Abstract:

BACKGROUND: Previous study has found that hsa-miR-182 is probably related to the apoptosis-related genes such as cytochrome C (Cycs C) and calcineurin subunit CnB (PPP3R1) in nucleus pulposus cells.
OBJECTIVE: To determine whether miR-182 plays a regulatory role in nucleus pulposus cell apoptosis by detecting the relative gene expression levels after transfecting miR-182 with Cycs C and PPP3R1 into nucleus pulposus cells via plasmid delivery.
METHODS: After a bioinformatics prediction about miR-182, miR-182 and target genes were transfected into the nucleus pulposus cells, and at the same time, blank control group was established. Then the expression levels of the target genes were detected through cell lysis.
RESULTS AND CONCLUSION: miR-182 significantly inhibited the expression of Cycs C in nucleus pulposus cells compared with the blank control group (P < 0.05). Compared with the blank control group, miR-182 made no inhibitory effect on the expression of PPP3R1. These findings suggest that miR-182 may play a regulatory part in nucleus pulposus cell apoptosis by inhibiting the expression of Cycs C.

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Key words: MicroRNAs, Cytochromes C, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 3

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引言

材料方法

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计细胞体外观察实验。

1.2 时间及地点于2015年4至10月在西安交通大学医学院公共卫生学院地方病研究所完成。

1.3 材料

髓核细胞凋亡调控实验用主要试剂及仪器
试剂及仪器	来源
双荧光报告基因检测试剂盒	Promega
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN
XhoI、Not1	NEB
PsiCHECK-2Vector	Promega
DNA ligation kit	TOYOBO
Lipofetin 2000	Invitrogen
MicroRNAmimics、Negative control	GenePharma

1.4 实验方法

1.4.1 miR-182生物信息学预测

1.4.2 目的片段全基因合成化学合成目的基因片段，合成时在目的片段两端加上XhoI,NotI酶切位点。合成的基因片段克隆到PUC57载体，然后测序验证。

1.4.3 目的片段载体双酶切 37 ℃用Xho I和Not I酶切2 h，1%琼脂糖凝胶电泳，使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)并回收酶切产物。酶切体系如表1。

表1 载体酶切反应体系成分

Table 1 Components of restriction enzyme digestion for carrier

组分	体积
NotI	1 μL
XhoI	1 μL
10×O buffer	5 μL
目的DNA片段载体	20 μL(约2 μg)
H₂O	23 μL
总体积	50 μL

1.4.4 psiCHECK-2载体双酶切 37 ℃双酶切过夜；1%琼脂糖凝胶电泳，使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)并回收线性化的载体片段。反应体系如表2。

表2 载体双酶切反应体系成分

Table 2 Components of dual restriction enzyme digestion for carrier

组分	体积
NotI	1 μL
XhoI	1 μL
10×O buffer	5 μL
psiCHECK-2载体	10 μL(约1 μg)
H₂O	33 μL
总体积	50 μL

1.4.5 目的片段与的psiCHECK-2载体连接在无菌的0.5 mL Ep管配制以下反应体系(表3)，16 ℃连接过夜。

表3 载体连接反应体系成分

Table 3 Components of ligase reaction for carrier

组分	体积
线性化的psiCHECK-2载体	2 μL (约100 ng)
目的DNA片段	5 μL (约300 ng)
10xT₄DNALigaseBuffer	2 μL
T₄ DNALigase	1 μL
H₂O	10 μL
总体积	20 μL

1.4.6 连接产物的转化 ①冰浴中将5 μL连接产物分别加入至100 μL DH5α感受态细胞中。轻轻旋转混匀，冰浴30 min；②42 ℃水浴热休克90 s。③快速将管转移至冰浴中，冰浴3 min；④分别加入200 μL LB培养基，混匀，37 ℃、200 r/min 振荡培养1 h；⑤将菌液涂布于含氨苄青霉素的LB平板表面，室温下放置，至液体吸收。倒置平板，转移入37℃生化培养箱过夜培养。

1.4.7 阳性克隆筛选挑去单菌落克隆经并Xho I+Not I双酶切电泳鉴定，同时接种LB amp或kana液体培养基培养8 h。

1.4.8 测序及序列比对分析克隆经双酶切电泳鉴定后送测序，与预期序列一致的克隆保留，接种LB amp液体培养基20 mL培养12 h后提取质粒DNA。

1.4.9 髓核细胞转染以lipofectamine^TM 2000(简称lipo2000)转染48孔板：①转染前1 d，接种适当数量的髓核细胞于48孔培养板中，每孔加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞浓度能够达到70%-80%，共设置以下组别(表4)，每组3平行孔；②对于每个转染样品，按如下步骤准备质粒-lipo2000混合液：a)稀释质粒：用25 μL不含血清培养基稀释100 ng psicheck-CYCS 等重组质粒(V1)，轻轻混匀；用25μL不含血清培养基稀释hsa-miR-182 mimics或NC(V2)，轻轻混匀；b)稀释lipo2000：用25 μL不含血清培养基稀释 lipo2000(V3 )，轻轻混匀并室温孵育5min；c)将V1+V2与V3轻轻混匀，室温孵育20 min；③将质粒-lipo 2000混合液加入含有细胞和培养基的48孔板中，轻轻摇匀；④将培养板置于37 ℃的CO₂培养箱中培养48 h。培养4 h后，将孔里含有质粒-lipo 2000混合液的培养液移去，更换新鲜培养基。

表4 髓核细胞转染分组

Table 4 Transfection grouping of nucleus pulposus cells

组别	50 nmol/L	100 ng
1	hsa-miR-182	psicheck-CYCS
2	mir-NC	psicheck-CYCS
3	hsa-miR-182	psicheck-PPP3R1
4	mir-NC	psicheck-PPP3R1

1.4.10 Luciferase测定 ①将细胞用细胞裂解液裂解后，取5 μL胞裂解液与萤火虫荧光素酶缓冲液及底物 5 μL按promega双荧光报告系统测量试剂盒说明)混匀测量荧光强度，然后加入海肾荧光素酶反应缓冲液及腔肠素底物5 μL，混匀再次测得海肾荧光素酶活性。②将每个样品按照萤火虫荧光素酶活性进行均一化处理，比较海肾荧光素酶活性并绘制图表(注：psiCHECK.-2 Vector以萤火虫荧光素酶为内参)。

1.5 主要观察指标 ①测序及序列比对分析结果。②Luciferase测定结果。

1.6 统计学分析应用SPSS 13.0进行t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

细胞色素C是一个凋亡相关的基因。细胞色素C是一个主要作用参与呼吸链和电子传递作用的促凋亡因子^[6]。一旦释放到胞浆中，细胞色素C就会通过激活Caspase9和3变成凋亡通路的致命一环^[6-7]。椎间盘退变时存在髓核细胞明显过度凋亡的现象，不同的试验中均能在形态学上观察到髓核细胞的凋亡要明显高于对照组。目前有不少关于髓核细胞凋亡的基因以及相关信号通路的研究，发现有多条凋亡通路参与椎间盘退变时髓核细胞的凋亡。Park等^[8]的研究发现突出的椎间盘组织中FASR的表达增加，椎间盘突出可能是是由FAS介导的椎间盘细胞的凋亡引起的，并且FAS的表达情况还与椎间盘突出的类型相关。Wang等^[9]在实验中发现椎间盘退变时BAX和CASPASE-3的表达要明显高于正常对照，同时椎间盘退变组的髓核细胞密度也相应降低，凋亡的阳性细胞数显著增加，从而认为BAX和CASPASE-3在髓核细胞凋亡的过程中起着重要的作用。Haschtmann等^[10]也在研究中发现终板软骨的损伤可以引起髓核和纤维环细胞的凋亡和坏死，而且在分子水平上可以见到CASPASE-3和前凋亡蛋白FASL等的表达有上调。Wang等^[11]则是更进一步，系统的研究了椎间盘退变所涉及的凋亡调节通路，发现FAS、FASL、BAX、CYT-C、GADD53和CASPASE-3/8/9等都表现出明显的表达变化，所以认为当椎间盘发生退变时会涉及内质网通路、死亡受体通路和线粒体通路等多条凋亡调节通路，这些凋亡调节通路在椎间盘退变的不同时期发挥其调节作用。根据上述研究可以发现，在椎间盘退变时髓核细胞以及纤维环细胞在凋亡过程中，CASPASE-3/9出现明显的表达变化，而且细胞色素C在凋亡通路中通过激活CASPASE-3/9来发挥作用，因此选用细胞色素C来进行microRNA筛选结果的验证实验。

钙调磷酸酶(calcineurin)是一种钙离子/钙调蛋白依赖的丝氨酸/苏氨酸半百磷酸酶，是一个61 ku大小的催化亚基(CnA)和一个19 ku大小的调节亚基(CnB)组成的异源二聚体。钙调磷酸酶参与了一系列包括T细胞激活、凋亡、神经退变性疾病和心肌肥大等生理和病理过程。传统上认为CnB(PPP3R1)作用就是调节CnA的磷酸化活动。CnB缺陷的胸腺细胞会丧失所有钙调磷酸酶活性，而且在阳性选择出现缺陷，阴性选择却不受影响2。然而近年来的研究却表明胞浆CnB能够同热休克蛋白60、微管蛋白3、胱冬酶原-34以及PSMA7进行反应，因此可以在不依赖CnA的磷酸化活性的情况下在细胞凋亡和蛋白酶体通路中起作用。这些结果都暗示了CnB具有不依赖于CnA调节亚基这一角色的其他功能。Su等^[12]研究CnB抑制肿瘤生长的机制时，发现CnB可以诱导巨噬细胞RAW264.7中TNF相关的凋亡诱导配体的表达。同时Wang等^[13]也通过研究发现，钙离子激活的钙调磷酸酶可以诱导细胞凋亡，他们发现钙调磷酸酶可以使Bcl-2家族的促凋亡成员BAD去磷酸化，因而加强BAD和Bcl-xL异二聚体来促进凋亡的发生。PPP3R1作为常见凋亡通路之一，在实验中选择PPP3R1来作为细胞色素C的对照，验证miR-182对凋亡通路是否具有一定生物学功能。

MiR-182是经常在癌症中表达上调的miRNAs。在非小细胞肺癌中，多项研究都报道miR-182的表达上调，而且被广泛的认为是一种致癌基因^[14-18]。Zhang等^[19]的研究也表明miR-182的高表达可以促进结直肠癌细胞的生长和侵袭。在作者先前的microRNA芯片研究和动态PCR研究中，都发现miR-182在椎间盘退变患者的髓核细胞中的表达显著降低，所以选择miR-182来与细胞色素C和PPP3R1进行质粒转染观察miR-182在细胞系中对细胞色素C和PPP3R1是否具有抑制作用。实验结果表明miR-182桥接的细胞色素C的表达相较于空白对照有着明显的下降，只有空白对照的60%，差异有统计学意义(P < 0.05)，因此可以认为miR-182对于细胞色素C的表达具有抑制作用，而在椎间盘退变时，miR-182的表达显著降低^[5]，对于细胞色素C的抑制作用减弱，由此可以推测髓核细胞以及纤维环细胞的凋亡可能与miR-182的表达降低有关，因此可以度miR-182 进行深入研究来明确miR-182是否可以用来作为早期检测椎间盘退变的生化指标。

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