富血小板血浆修复膝关节骨关节炎

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.42.004

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
膝关节炎：是一种以退行性病理改变为基础的疾患。多患于中老年人群，其症状多表现为膝关节疼痛、上下楼梯痛甚、坐起立行时膝部酸痛不适等。也会有患者表现肿胀、弹响、积液等，如不及时治疗，则会引起关节畸形和残废。
富血小板血浆：为新鲜血液经低速离心制备而成。主要用于各种原因所致的血小板减少症和血小板功能缺陷患者出血的预防和治疗。

摘要
背景：富血小板血浆因含有大量血小板源性生长因子对膝骨性关节炎有较好的疗效，但目前对关节面软骨的修复效果尚有争议。
目的：观察富血小板血浆对兔膝骨关节炎模型的关节软骨修复作用。
方法：采用Hulth法建立右膝骨关节炎兔模型，分别于右膝关节腔灌注富血小板血浆和玻璃酸钠，并设置模型组和假手术组作对比。造模后8周，测定各组兔关节滑液中一氧化氮水平，观察关节面形态及软骨修复情况。
结果与结论：①关节面软骨形态比较：富血小板血浆治疗组关节面损伤修复情况明显好于其他3组；②富血小板血浆治疗组软骨组织Mankin’s评分和关节液中一氧化氮水平均低于模型组和玻璃酸钠治疗组(P < 0.05)，高于假手术组(P < 0.05)；③结果说明：膝关节腔灌注富血小板血浆对兔膝骨关节炎模型的关节软骨修复效果较好，效果优于玻璃酸钠灌注。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-6945-5519(何本祥)

关键词: 组织构建, 软组织工程, 富血小板血浆, 膝骨关节炎, 玻璃酸钠, 一氧化氮, 关节腔注射, 细胞组织切片, 软骨修复, 关节软骨评分

Abstract:

BACKGROUND: Platelet-rich plasma (PRP) containing high levels of platelet-derived growth factor for knee osteoarthritis has achieved good clinical results; however, the effects of RPR on the repair of damaged articular cartilage are still controversial.
OBJECTIVE: To study the effects of RPR on the repair of damaged articular cartilage in a rabbit model of knee osteoarthritis.
METHODS: The model of osteoarthritis in the rabbit right knee was established by Hulth’s method. Autologous PRP (0.5 mL) (PRP group), sodium hyaluronate (0.5 mL) (sodium hyaluronate group), and normal saline (model group) were injected into the right knee joint cavity, respectively. The morphology of articular surface and nitric oxide contents in knee joint fluid were observed and determined at 8 weeks after surgery.
RESULTS AND CONCLUSION: The morphology of articular cartilage in the PRP group was better than that in the other three groups. Mankin scores of articular cartilage and nitric oxide contents of knee joint fluid in the PRP group were significantly decreased compared with the model and sodium hyaluronate groups that in (P < 0.05), while increased compared with the sham-operation group (P < 0.05). Our results suggest that repair effects of PRP on the damaged articular cartilage are superior to sodium hyaluronate treatment.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Knee, Osteoarthritis

中图分类号:

R318

吴骁，檀亚军，咸杰，何本祥. 富血小板血浆修复膝关节骨关节炎[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(42): 6259-6264.

Wu Xiao, Tan Ya-jun, Xian Jie, He Ben-xiang. Platelet-rich plasma for the repair of damaged articular cartilage in a rabbit model of knee osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(42): 6259-6264.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析纳入新西兰大白兔24只，造模前后无感染和死亡，均进入结果分析，无脱失值。

2.2 各组关节液中一氧化氮水平变化富血小板血浆治疗组关节液中一氧化氮水平均低于模型组和玻璃酸钠治疗组(P < 0.05)，高于假手术组(P < 0.05)，各组间均差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2，3。

2.3 各组软骨外观形态变化假手术组软骨面完整、光滑，光泽度好，整体呈现淡蓝色偏白，未见受损状况；模型组软骨面缺损，粗糙，光泽度差，无修复表现，整体颜色偏红，提示较强炎症反应；富血小板血浆治疗组软骨面完整光滑，光泽度较好，比假手术组稍差，损伤区域已有修复和纤维组织填充，整体略呈红色，提示有弱炎症反应；玻璃酸钠治疗组软骨面完整，光滑度与光泽较富血小板血浆治疗组稍差，损伤区域已有修复和纤维组织填充，整体颜色略成红色，提示有弱炎症反应，见图1。

2.4 各组兔软骨组织形态变化苏木精-伊红染色结果显示：①假手术组为正常软骨形态，软骨层次明确，基质分散均匀，表层软骨细胞整体表现为梭形，纵轴基本与软骨表面呈平行排列，中层软骨细胞呈圆形，细胞大小基本相同，细胞分布无特定规律。第3层，为柱状细胞层，可见多个软骨细胞纵向组合，呈柱状排列，方向大体与软骨面垂直，潮线与钙化软骨层清晰可见^[20-22]；②模型组可见软骨层变薄，甚至消失，整体细胞数量最多，表层软骨细胞消失，呈断裂或者碎裂现象，中层软骨细胞与第3层柱状细胞减少，层次不清，分布排列极度紊乱，可见坏死变性的软骨细胞，潮线向上移动；③富血小板血浆治疗组可见软骨表面较为平整，稍逊于假手术组，部分区域仍有不平整，细胞形态正常，层次分布也较明确，接近于正常软骨，但表面软骨层与中层较假手术组减少，细胞数量少于模型组；④玻璃酸钠治疗组切片软骨表面整体较为平整，但不如富血小板血浆治疗组，部分区域仍有断裂。表层与中层软骨变薄，但细胞形态基本正常，深层次软骨结构变化不明显，但层次的分界线模糊。见图2。

甲苯胺蓝染色显示，假手术组染色很均匀，无软骨基质失染。模型组染色弱，有部分软骨基质失染，富血小板血浆治疗组和玻璃酸钠治疗组相对模型组染色较弱，见图3。

2.5 各组Mankin’s评分变化富血小板血浆治疗组软骨组织Mankin’s评分均低于模型组和玻璃酸钠治疗组(P < 0.05)，高于假手术组(P < 0.05)，见表4，5。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2015年6至9月在成都体育学院运动医学重点实验室(国家体育总局运动医学重点实验室、四川省运动医学重点实验室)完成。

1.3 材料

动物：健康雄性6-8月龄新西兰大白兔24只，体质量(2.25±0.20) kg，由四川省生命科学研究院动物中心提供。

富血小板血浆：采用Landesberg方法制备富血小板血浆^[9-11]。自兔耳中心动脉采取动脉血5 mL，注入肝素抗凝的真空采血管中，反复晃动采血管5-20次以使抗凝剂与血液完全混合，防止血液凝固。放入离心机以 200×g离心10 min，得到的血液分为3层，上层主要是纤维蛋白原为主要成分的上清液、中层为白细胞及血小板为主要成分的富血小板血浆层、下层为红细胞层，用 5 mL注射器抽吸掉上清液层与富血小板血浆层至富血小板血浆下3 mm，注入另一干净无菌离心管中，把该试管放入离心机，再次200×g离心10 min，得到3层。

上层为贫血小板层，中层为富血小板血浆层，下层为少量红细胞。用吸管吸取绝大部分上层液体并遗弃，留取少量血清，与富血小板血浆层，红细胞层震荡均匀匀，共得到0.5-0.7 mL富血小板血浆。经测试血小板浓度为之前常规血液血小板浓度的3-5倍，符合富血小板血浆标准的要求。

1.4 实验方法

1.4.1 分组及造模兔适应性喂养1周后，按体质量标号排序，采用随机数字表将24只新西兰大白兔随机分成4组：假手术组、模型组、富血小板血浆治疗组和玻璃酸钠治疗组，每组6只。

造模手术前禁水，禁食6 h。按照1 mL/kg腹腔注射体积分数10%水合氯醛，进行全身麻醉^[12]。除假手术组外，其他3组兔均按Hulth法^[13-15]，切除右膝内侧半月板并剪断内侧副韧带与交叉韧带，建立膝关节炎模型。术后用生理盐水冲洗关节腔，分别进行右膝关节囊与皮肤缝合。

术后连续3 d肌注庆大霉素以预防感染，1次/d，注射剂量按照Meeh-Rubner公式计算^[16]。术后实验动物均放回笼舍正常饲养，不予制动措施。假手术组仅在右膝关节内侧作同等规格的皮肤切口，不破坏侧副韧带，不进入关节腔，随即缝合切口。

1.4.2 给药造模2周后，假手术组与模型组同一时间给予1 mL等量生理盐水右膝关节腔注射，每周1次，持续5周。富血小板血浆治疗组予以自体0.5 mL的富血小板血浆右膝关节腔注射，3周/次，持续2次。玻璃酸钠治疗组予以0.5 mL玻璃酸钠右膝关节腔注射，每周1次，持续5周。

1.5 主要观察指标

1.5.1 关节液一氧化氮水平采用硝酸还原酶法对采集的24只兔右膝关节液样本中一氧化氮水平进行检测。硝酸还原酶使NO^3-还原为NO^2-，利用不同浓度关节液对光度吸收值的不同，以测定一氧化氮水平，一氧化氮水平(μmol/L)=所得值/标准值×标准品浓度(100 μmol/L)×样品测试被稀释的倍数。实验试剂盒购自南京建成生物研究所，实验严格按照说明书所示步骤操作。

1.5.2 Mankin’s评分在光学显微镜下，观察软骨组织细胞结构并结合关节软骨Mankin’s评分^[17-19]进行评价，见表1。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计学分析，计量资料采用x(_)±s表示，组间正态分布数据差异的比较采用单因素方差分析和LSD法，不满足正态分布差齐性的软骨组织结构、软骨细胞数量和潮线采用Kruskal-Wallis H 检验分析，P < 0.05表示差异具有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程