五种松质骨理化性质的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.42.001

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (42): 6237-6243.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.42.001

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五种松质骨理化性质的比较

高寰宇，李彦林，肖渝，李龙滕，王国梁

昆明医科大学第一附属医院，云南省昆明市 650032

收稿日期:2016-07-17 出版日期:2016-10-14 发布日期:2016-10-14
通讯作者: 李彦林，博士生导师，教授，主任医师，昆明医科大学第一附属医院，云南省昆明市 650032
作者简介:高寰宇，男，1988年生，云南省普洱市人，哈尼族，2016年昆明医科大学毕业，硕士，主要从事骨组织工程研究。
基金资助:
云南省创新团队项目(2014HC018)；云南省医学学科带头人项目(D-201207)

Comparison of physicochemical properties of five kinds of cancellous bones

Gao Huan-yu, Li Yan-lin, Xiao Yu, Li Long-teng, Wang Guo-liang

First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Received:2016-07-17 Online:2016-10-14 Published:2016-10-14
Contact: Li Yan-lin, Doctoral supervisor, Professor, Chief physician, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China
About author:Gao Huan-yu, Master, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China
Supported by:
the Project of Innovation Team of Yunnan Province, No. 2014HC018; the Project of Medical Discipline Leader of Yunnan Province, No. D-201207

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
异种松质骨：作为天然骨组织工程支架来源，虽其抗原性强，但其来源广、成本低、便于加工且经过特定处理，如脱蛋白、煅烧、脱脂、冻干等，可减低或消除免疫原性，在作为骨缺损修复材料上有着巨大潜能。
牛、猪松质骨：与人松质骨在理化性质上存在着一定的差异，在选择天然衍生骨材料来源时应该考虑到其中存在的差异性，如在脱钙多孔支架的天然骨原料选择上，猪松质骨中蛋白质的量比牛骨中含量高，提示二者胶原含量的差异应引起研究者的注意。微型猪的Ca/P最高，这可能说明其中含有更多的杂质，或是其羟基磷灰石中含钙量更接近化学成分的羟基磷灰石，在选择天然衍生骨修复材料时，材料的Ca/P对支架材料机械性能与可能对间充质干细胞的成骨性影响亦应该得到重视。

摘要
背景：研究表明，异种松质骨衍生骨移植修复材料具有骨缺损修复能力，但鲜有异种骨与人骨成分对比的报道。
目的：分析猪、牛、人胫骨上端松质骨的化学成分、无机物相、钙磷含量、总蛋白质含量及形貌。
方法：将普通猪、牛、版纳微型猪、年轻人、老年人胫骨上端松质骨片切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的骨粒，根据不同的检测目的进行脱脂、干燥等预处理，采用傅里叶红外光谱、X射线衍射、等离子体发射光谱仪、扫描电镜、凯氏定氮法检测其化学成分、无机物相、钙磷含量、蛋白质含量，采用Nano Measurer 1.2与Photoshop cs6直方图功能分析电镜结果，测孔径与孔率。
结果与结论：①5种松质骨的主要无机物相为羟基磷灰石，无机质成分主要为磷酸盐类与碳酸盐类；②牛松质骨中钙含量低于其余4种松质骨(P < 0.05)，年轻人松质骨磷含量高于猪、牛松质骨(P < 0.01)，普通猪与版纳微型猪松质骨中蛋白含量高于其余3种松质骨(P < 0.05)；③5种松质骨的孔径均值在400-600 μm间，孔率在60%-70%间，并且以牛松质骨孔率最大；④结果表明，猪、牛松质骨在有机与无机物成分上与人骨存在一定的差异。

中国组织工程研究

杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-8734-6164(高寰宇)

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 支架材料, 天然骨衍生材料, 理化性质, 松质骨

Abstract:

BACKGROUND: Existing evidence has shown that xenogeneic bone derived graft materials have the ability to repair bone defects, but little report is on the comparison of composition of xenogeneic bone and human bone.
OBJECTIVE: To analyze the chemical composition, mineral phase, calcium and phosphorus contents, total protein contents, and appearance of the cancellous bones of the tibia from pig, bovine and human.
METHODS: Cancellous bones of the tibia from pig, Banna miniature pig, bovine, young and old people were cut into bone particles of 0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm. After degreasing or drying treatment, chemical composition, mineral phase, calcium and phosphorus contents, total protein contents of bone particles were detected using Fourier transform infrared spectroscopy, X-ray diffraction, plasma emission spectroscopy, scanning electron microscopy, and Kjeldahl method, respectively. Nano Measurer 1.2 and Photoshop cs6 were used to measure pore diameter and porosity rate based on the results of scanning electron microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: The main inorganic phase of five kinds of cancellous bones was hydroxyapatite and the main chemical composition was phosphate and carbonate. The calcium content of the bovine cancellous bonewas lower than that of the other cancellous bones (P < 0.05) and the phosphorus content of the cacellous bone of young man was higher than that of the pig and bovine cancellous bones (P < 0.01). The total protein content in the cancellous bones of normal pig and Banna miniature pig was higher than that in the other three kinds of cancellous bones (P < 0.05). The pore diameter of five kinds of cancellous bones was 400 to 600 μm and the porosity rate was 60% to 70%. Moreover, the porosity rate of the bovine cancellous bone was the highest. Therefore, we conclude that there are some certain differences in the organic and inorganic components of the pig or bovine cancellous bones as compared with humans.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Tissue Scaffolds, Bone Transplantation, Tissue Engineering

中图分类号:

高寰宇，李彦林，肖渝，李龙滕，王国梁. 五种松质骨理化性质的比较[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(42): 6237-6243.

Gao Huan-yu, Li Yan-lin, Xiao Yu, Li Long-teng, Wang Guo-liang. Comparison of physicochemical properties of five kinds of cancellous bones[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(42): 6237-6243.

图/表（结果） 1

2.1 五种松质骨大体观 5种新鲜松质骨的横截面有大小不等孔隙，且孔隙中有骨髓和油脂填充，牛松质骨为乳白色，普通猪与版纳微型猪为粉红色，老人和年轻人松质骨为褐黄色，见图1。

2.2 五种松质骨的红光检测结果由图2可见，5种松质骨的出峰位置基本一致，说明5种松质骨中的化学成分大致相同，在3 428 cm^-1 处宽化的中强峰由样本中水成分引发；2 925，2 856，1 747 cm^-1处的强峰分别由脂类中的C-H键的不对称伸缩振动(νas)、C-H键的对称伸缩振动(νs)与-COOH的脂肪酮键的伸缩振动(νc=o)引起；1 600-1 700 cm^-1段与1 500-1 600 cm^-1段的弱峰分别归结为代表有机物(主要是蛋白质)Ⅰ级酰胺、Ⅱ级酰胺，其中酰胺Ⅰ主要由C=O的伸缩振动引起，酰胺Ⅱ由N-H弯曲振动与C-N 伸缩振动引发；在1 630 cm^-1处亦有水的振动峰。1 458，875，719 cm^-1的振动峰为碳酸根中的不同的C-O键的伸缩振动引起；875 cm^-1波段处主要为HPO₄^2-的基本振动出峰位置；900-1 200 cm^-1段主要反应骨中无机成分中的PO₄^3-成分，同时在这一波段中1 244 cm^-1处的振动峰可归结为Ⅲ级酰胺的出峰；565，601 cm^-1处的微弱峰主要是由磷酸盐的PO4^3-的O-P-O弯曲振动引起。5种骨红光结果提示其无机质成分主要为磷酸盐类与碳酸盐类。

2.3 五种松质骨的X射线衍射检测结果 5种松质骨的衍射峰大致相同，衍射峰宽大峰强弱，从2θ 30°-35°间的衍射主峰位置处未见明显分峰。用X射线衍射分析软件Jade 5.0对其进行物相分析，其中4种骨的主要衍射峰的位置与PDF#74-0565中羟基磷灰石的衍射峰(002)、(211)、(300)、(202)、(130)、(222)所在位置相对应，未见明显其他无机结晶相的衍射峰；老人松质骨在主衍射峰的(300)、(202)处相较其他骨可见分峰。5种骨衍射图提示松质骨中的无机结晶成分主要为羟基磷灰石，见图3。

2.4 五种松质骨的电镜扫描结果 5种松质骨横截面上的孔洞形状大小不规则，孔洞为骨小梁的相互交错连通形成，微型猪与普通猪松质骨的孔洞较于牛、人松质骨小，见图4。牛松质骨孔径为190-1 290 μm，普通猪松质骨孔径为150-710 μm，版纳微型猪松质骨孔径为130-700 μm，老人松质骨孔径为100-1 230 μm，年轻人松质骨孔径200-1 780 μm，牛松质骨的孔率最大且与年轻人相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.5 五种松质骨电感耦合等离子体光谱仪检测结果牛松质骨的钙含量最少，年轻人松质骨的磷含量最高，牛松质骨中钙、年轻人松质骨中磷含量与其他松质骨相比差异有显著性意义(P < 0.05，P < 0.01)，通过质量分数均值计算得各骨的Ca/P在1.5-1.9间，见表1。

2.6 凯氏定氮检测结果猪松质骨的总蛋白含量相对较高，普通猪蛋白含量除与微型猪外的三骨相比存在统计学差异(P < 0.05) ，见表1。

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引言

材料方法

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计对比观察实验。

1.2 时间及地点 2014年12月至2015年6月在昆明医科大学生物医学工程中心、昆明医科大学公卫学院实验室、昆明医科大学电镜室、云南大学现代技术检测中心完成。

1.3 材料市售普通猪、牛胫骨各5根(非相同个体)，版纳微型猪胫骨5根[非相同个体，均由昆明医科大学实验动物中心提供，实验合格证SYXK(滇)2012-0008]，年轻人创伤性截肢胫骨上端骨片数块(平均年龄32.3岁，其中女2例、男3例，由昆明医科大学第一附属医院急诊外科提供)，老年人膝关节置换胫骨上端骨片数块(平均年龄62.3岁，其中男3例、女2例，由昆明医科大学第一附属医院运动医学科提供)，收集标本均在取得患者及其家属同意后进行。用骨锯等工具将骨松质骨部分切成约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小，进行相应预处理后检测。

1.4 实验方法

傅里叶变换红外光谱分析：随机选取5种新鲜松质

不同松质骨理化性质的比较分析实验的仪器与试剂：
试剂及仪器	来源
体积分数30%过氧化氢	西陇化工有限公司
氯仿、甲醇	天津化学试剂三产
扫描电子显微镜	日本日立公司S-3000N
傅里叶红外光谱仪	美国热电尼高力公司AVATAR-360-FT-IR
转靶X射线衍射仪	日本理学公司TTR18kW铜靶
电感耦合等离子体发射光谱仪	日本岛津公司ICP-1000
电热恒温鼓风式干燥箱	上海鸿都电子科技公司 DHG-9101-3S
马弗炉	洛阳力宇炉灶JNL-16XB
实验用电炉	北京永光明实验仪器公司
超声清洗机	上海跃进医用光学器械厂CQ-100A-DST

骨各10块，放入60 ℃干燥箱内，干燥12 h后研磨成粉后压片，放入傅里叶红外光谱仪内检测，仪器分辨率为4 cm^{- 1}、扫描累加32 次、扫描范围4 000-400 cm^{- 1}。

X射线衍射检测无机物相：随机选取5种新鲜松质骨各15块，分别浸泡于氯仿∶甲醇(1∶1体积分数比)中 6 h，风干后放入干燥箱中50 ℃烘干12 h，研磨成粉末状，放入X射线衍射仪器内检测，仪器工作条件为： Cu Kα(λ=1.540 56 nm)、检测电压40 kV、电流200 mA、扫描角度5°-80°、扫描步长4(°)/min。结果用Jade 5.0分析。

等离子体发射光谱仪检测钙磷含量：随机选取5种新鲜松质骨各10块，每种骨5个平行样。放入陶瓷坩埚内于电炉上加热无烟后，马弗炉中600 ℃煅烧2 h，除去有机质^[8]。每种检测样本称量后盐酸溶解，加热干燥定容后放入等离子体发射光谱仪中检测，仪器工作条件为：功率1.2 kW、观测高度15 mm、冷却气15 L/min、净化气3.5 L/min、等离子气1.2 L/min，使用Ca、Mg、Fe标准液。通过公式Ca/P=(mCa/mP)×(31/40)，m为元素质量百分比均值，31与40分别为磷、钙相对原子质量(结果保留2位小数)^[31]。

扫描电镜形貌结构观察：随机选取5种新鲜松质骨各5块，用氯仿∶甲醇(1∶1体积分数比)中浸泡6 h，并用体积分数30%过氧化氢浸泡48 h，用双蒸水于40 kHz超声清机内洗2 h。乙醇系列脱水，冻干，黏样喷金后放入扫描电镜。随机选取每块样品2张形貌照片,用Nano Measurer 1.2测量电镜中孔径长轴。用Photoshop cs6软件直方图功能计算孔率，孔率=孔面积的象素÷整幅图片象素×100%^[9]。

凯氏定氮检测：随机选取5种新鲜松质骨各10块，每种骨5个平行样，50 ℃烘干48 h后，分装送至昆明医科大学公卫学院实验室检测。

1.5 主要观察指标 5种松质骨的化学基团、有机无机成分、钙磷含量、蛋白含量及表面形貌。

1.6 统计学分析数据用SPSS 17.0统计软件对结果进行方差齐性、正态分布检验后用单因素方差检验，显著性水平为α=0.05或0.01，数据均用x(_)±s表示。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

异种松质骨作为天然骨组织工程支架来源，虽其抗原性强，但其来源广、成本低、便于加工且经过特定处理，如脱蛋白、煅烧、脱脂、冻干等，可减低或消除免疫原性，在作为骨缺损修复材料上有着巨大潜能^[10-11]。猪、牛松质骨具有天然网孔结构，经过物理化学处理后任能保留骨小梁、小梁间隙三维结构形态，这种天然结构有利于细胞的黏附和长入，为细胞外基质的分泌提供宽大表面积和内部空间，是较为理想的天然骨移植材料来源^[5^，^12]。

红光分析中的样本未进行脱脂处理，所以在 2 925 cm^-1 与2 856，1 747cm^-1处出现了油脂的分子的强振动峰^[13]，这些强峰并不全由松质骨中的脂质产生，亦有孔隙中的骨髓成分中的油脂。在1 500- 1 700 cm^-1间出现的酰胺Ⅰ、Ⅱ的振动峰，猪骨与年轻人骨的酰胺Ⅰ、Ⅱ的振动比老人和牛骨的更强^[13-15]，但是1 630 cm^-1处也是水的吸收振动峰位置^[16]，结合猪骨和年轻人的骨在3 428 cm^-1的水吸收振动峰比牛骨和老人骨的强的结果，参看酰胺Ⅱ振动强度更能反应松质骨中蛋白质含量差别，并与凯氏定氮的结果综合分析，即牛骨和老人骨在总蛋白的含量上也比两种猪骨与年轻人骨蛋白质含量低，所以可认为猪松质骨的蛋白质含量较牛的高，与年轻人松质骨的蛋白含量接近。1 458，875，719 cm^-1附近是CO₃^2-振动峰^[17]，5种骨在这几个波段都出现了大致相同的峰形，有研究指出人骨中含有2.3%-8 %的碳酸盐^[18]，骨中的碳酸盐会以替代OH^-或PO₄^3-形式存在于骨羟基磷灰石中，其分子式可表达为Ca_10−x/2[(PO₄)_6−x(CO₃)_x][(OH)_2−2y(CO₃)_y ]，x和y为CO₃^2-替代OH^-或PO₄^3-的数目^[17]。无机的天然生物骨衍生移植材料，因其碳酸盐成分在高温下可分解成氧化物形式，如氧化钙等，这些物质通常在液体环境中可与水发生化学反应成为可溶性物质，不利于材料机械性能维持^[32]，同时钙磷支架材料降解速度太快亦会造成局部pH变化和大量钙磷离子或为微粒的释放，这会导致支架周围组织的炎症反应，不利于骨组织的修复。但也有研究指出，在双相陶瓷中含有少量的氧化钙，材料降解虽更快,但成骨性与未含有氧化钙材料相比未见显著差异^[19]。875 cm^-1亦可归结到HPO₄^2-的基础衍射峰处^[2-3^，^13]，有报道称骨中含有少量的CaHPO₄•2H₂O^[20]。565 cm^-1、601 cm^-1为PO₄^3-特征峰位置，五种骨在这两位置处都出现了相同的振动峰，说明骨中存在磷酸盐类物质。在羟基磷灰石红光光谱中900-1 200 cm^-1这一范围内也是PO₄^3-特征峰位置^[2-3^，^13-14^，^17]，5种骨在这一范围中的峰形可见无明显差别，其中以老人骨与牛骨较为相似，猪骨与年轻人骨较为相似，推测这可能与老人、牛骨中PO₄^3-被其他分子取代导致分子键振动差异有关^[17^，^22]，这需进一步的研究。新鲜骨中无机物是否为羟基磷灰石在学界依旧有着不小的争论，在此次实验红光检测中，未于3 570， 630 cm^-1处出现OH^-的吸收振动峰^[21]，这与文献中指出的天然的骨磷灰石不含或者是极少含有OH^-，或是其受到CO₃^2-或PO₄^3-替换导致晶格扭曲光谱峰宽化红光无法检测到相符合^[22]。

在5种骨的X射线衍射图中，衍射主峰处2θ角分别为31.745°、32.174°、32.876°的(211)、(112)、(300)晶面衍射峰未完全分开且宽化，一方面说明脱脂骨中羟基磷灰石结晶低，另一方面说明其晶粒的尺寸小^[23]。尽管天然骨煅烧后的衍射峰与化学计量羟基磷灰石相似^[9]，但天然骨中化学成分复杂，晶体结构中包含有HPO₄^2-、Na⁺、 Mg²⁺、Sr²⁺、 K⁺、 Cl^-、F^-等元素^[17]。有研究认为天然骨中羟基磷灰石是一种结晶不完善，长度为50-100 nm的棒状晶体^[24]，且分子式非Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂而是Ca_10−x(HPO₄)_x(PO₄)_6-x(OH)_2−x(0<x<2)，Ca/P在1.33- 1.67间^[25]。实验中松质骨经过600 ℃煅烧以除去有机质后做钙磷元素检测，结果以质量百分比表示并通过换算后求得煅烧骨中Ca/P，牛骨在钙的总量上相较其他骨明显偏低，计算得Ca/P为1.57，这可能提示煅烧后牛骨的主要物相虽近似标准化学成分的羟基磷灰石^[2^，^4]，但其分子式亦不是Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂，而应该接近Ca_10−x(HPO₄)_x(PO₄)_6-x(OH)_2−x(0<x<2)。有报道称人骨钙磷比为1.78±0.05^[17]，实验中普通猪、微型猪、老年人的Ca/P计算结果与之相近。猪骨的Ca/P较牛骨与人骨大，老年人的Ca/P较年轻人大，且计算得出的Ca/P都超过了1.67，这可能说明生物煅烧骨的羟基磷灰石中存在着其他含钙非磷酸钙盐类的杂质，如：氧化钙可由碳酸盐类分解形成，标准化学成分的98.5%羟基磷灰石与1.5%氧化钙混合物其Ca/P为1.71^[26]，或含CO₃^2-的羟基磷灰石亦会使Ca/P大于1.67^[18]。钙磷陶瓷的机械性能与Ca/P也有一定关系，研究反应钙磷陶瓷的机械性能随着Ca/P的增加而增加，但Ca/P>1.67后机械性能减低。同时研究指出Ca/P为1.58的羟基磷灰石/β-磷酸三钙陶瓷对间充质干细胞的成骨影响较Ca/P 为1.62、1.60的陶瓷显著^[33]。

多孔性是骨组织工程支架的基本要求，三维多孔结构(孔径孔隙率、连通性、形状)影响骨长入方式、数量、支架力学性能，普遍认为生物多孔支架的孔径应在100- 600 μm之间，推荐材料孔径要大于300 μm^[27-28]，Holmes^[34]研究提示人骨单位所需孔径在200-400 μm间，平均大小223 μm。牛、普通猪、微型猪的松质骨孔径均值大小分别为(490.57±195.63)，(384.80± 122.18)，(426.36±139.92) μm，这与Komlev 等^[35]研究得出的牛骨衍生材料孔径(455±155) μm相近，这一结果虽然与人骨孔径有明显的差别，但其孔径大小足以满足骨移植材料的要求。材料的孔率超过30%后，材料内部孔间会相互连通形成网络结构利于组织的长入，但是孔率的大小往往与材料机械强度呈负相关，多孔材料的孔率控制在40%-60%，既兼顾连通性又可兼顾机械强度^[29-30]。实验检测牛松质骨、普通猪、微型猪的孔率分别为(68.78± 5.45)%、(61.95±2.18)%、(62.96± 1.76)%，所以猪、牛松质骨作为骨衍生移植材料在孔率和孔径方面有着天然的优势。

此次实验所得的Ca/P通过均值计算得来，未用能谱检测进行进一步确认，可能存在一定误差。在蛋白检测方面，凯氏定氮为总氮测定方法，若要更精确了解骨中的胶原含量，还需做氨基酸检测以此来反映骨胶原含量。

牛、猪松质骨，与人松质骨在理化性质上存在着一定的差异，在选择天然衍生骨材料来源时应该考虑到其中存在的差异性，如在脱钙多孔支架的天然骨原料选择上，猪松质骨中蛋白质的量比牛骨中含量高，提示二者胶原含量的差异应引起研究者的注意。实验中微型猪的Ca/P最高，这可能说明其中含有更多的杂质，或是其羟基磷灰石中含钙量更接近化学成分的羟基磷灰石，在选择天然衍生骨修复材料的时，材料的Ca/P对支架材料机械性能或对间充质干细胞的成骨性影响亦应该得到重视。猪和牛松质骨具有的天然三维网状结构与其化学物理成分类似于人骨，在作为异种骨组织工程天然衍生材料方面仍有很大潜能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

五种松质骨理化性质的比较

Comparison of physicochemical properties of five kinds of cancellous bones

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