过表达Brahma-相关基因1腺病毒载体对氧化应激诱导心肌细胞凋亡的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.40.014

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (40): 6021-6027.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.40.014

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过表达Brahma-相关基因1腺病毒载体对氧化应激诱导心肌细胞凋亡的影响

李素娟^1，2，袁文常³，麦云珮^1，2，侯宁^1，2

¹广州医科大学药学院药理学教研室，广东省广州市 511436；²广州心血管疾病研究所，广东省广州市 510260；³解放军兰州军区乌鲁木齐总医院检验科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000

修回日期:2016-07-17 出版日期:2016-09-30 发布日期:2016-09-30
通讯作者: 侯宁，副教授，硕士生导师，广州医科大学药学院，广东省广州市 511436
作者简介:李素娟，女，1987年生，广东省韶关市人，汉族，在读博士，主要从事糖尿病心肌病发病机制方向的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81402928)；广东省医学科研基金项目(B2012167)；广州市教育科研计划项目(2012C199)

Adenoviral vectors carrying Brahma-related gene 1 attenuates oxidative stress-induced apoptosis of cardiomyocytes

Li Su-juan^{1, 2}, Yuan Wen-chang³, Mai Yun-pei^{1, 2}, Hou Ning^{1, 2}

¹Department of Pharmacology, School of Pharmacy of Guangzhou Medical University, Guangzhou 511436, Guangdong Province, China; ²Guangzhou Institute of Cardiovascular Disease, Guangzhou 510260, Guangdong Province, China; ³ Clinical Laboratory Diagnostic Center, Urumqi General Hospital of Lanzhou Military Region of Chinese PLA, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Revised:2016-07-17 Online:2016-09-30 Published:2016-09-30
Contact: Hou Ning, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Pharmacology, School of Pharmacy of Guangzhou Medical University, Guangzhou 511436, Guangdong Province, China; Guangzhou Institute of Cardiovascular Disease, Guangzhou 510260, Guangdong Province, China
About author:Li Su-juan, Studying for doctorate, Department of Pharmacology, School of Pharmacy of Guangzhou Medical University, Guangzhou 511436, Guangdong Province, China; Guangzhou Institute of Cardiovascular Disease, Guangzhou 510260, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81402928; the Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province, No. B2012167; the Guangzhou Education Scientific Research Foundation, No. 2012C199

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

Brahma-相关基因1：是染色质重塑复合物SWI/SNF的核心亚单位，具有ATP酶活性，通过水解ATP释放的能量来改变染色体的结构，实现对基因表达的调控。目前的研究发现，Brahma-相关基因1通过调控心脏基因表达调节心肌分化、生长等心脏胚胎发育进程；对转基因动物的研究显示，成年阶段Brahma-相关基因1过表达参与心肌肥厚等病理生理过程。

Brahma-相关基因1与糖尿病心脏病的相关性：Xu等的研究结果显示，1型糖尿病小鼠心脏中Brahma-相关基因1表达显著降低；抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸能上调其表达。该结果提示，Brahma-相关基因1可能是氧化应激导致糖尿病心肌病的重要靶点，但由于缺乏直接的体外实验，氧化应激与Brahma-相关基因1的关系尚需进一步研究。

摘要

背景：Brahma-相关基因1是调节染色质重构的重要核蛋白，在糖尿病心肌病中表达降低。

目的：构建大鼠Brahma-相关基因1重组腺病毒载体，评价其在氧化应激诱导原代心肌细胞凋亡中的保护作用。

方法：构建Brahma-相关基因1重组腺病毒载体质粒，经人胚肾293T细胞包装、扩增、计算滴度后，将Brahma-相关基因1重组腺病毒转染入SD乳鼠原代培养心肌细胞，以空载体EGFP转染细胞及正常细胞作为对照，24 h后，荧光显微镜观察转染效率；荧光定量PCR、免疫印迹法检测细胞Brahma-相关基因1mRNA、蛋白表达；24 h后，分别加入100 µmol/L H₂O₂处理12 h，免疫印迹法检测Brahma-相关基因1蛋白表达、凋亡标志物cleaved-Caspase3表达，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

结果与结论：①构建的重组腺病毒成功转染至心肌细胞，转染效率达90%以上，被转染细胞的Brahma-相关基因1 mRNA、蛋白表达明显增高；②H₂O₂可显著抑制心肌细胞Brahma-相关基因1表达，诱导心肌细胞凋亡，刺激心肌细胞cleaved-Caspase3表达；Brahma-相关基因1重组腺病毒可减轻由H₂O₂导致的上述心肌细胞损伤；③结果表明，氧化应激能直接抑制心肌细胞Brahma-相关基因1表达，Brahma-相关基因1在氧化应激诱导的心肌细胞凋亡中发挥保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

ORCID: 0000-0003-4026-4142(李素娟)

关键词: 实验动物, 心血管及肺损伤与修复动物模型, Brahma-相关基因1, 腺病毒载体, 糖尿病心肌病, 氧化应激, 心肌细胞, 转染, 基因治疗, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Brahma-related gene 1 (Brg1), a catalytic subunit of an important chromatin remodeling complex, has been considered as a key nuclear transcriptional factor, and tends to be decreased in diabetic cardiomyopathy.

OBJECTIVE: To construct an adenovirus vector carrying Brg1, and observe its protective role in oxidative stress induced-cardiomyocyte apoptosis.

METHODS: The recombinant adenovirus plasmid was linearized and transfected into HEK293 cells using Fugene HD for packaging and amplification. The adenovirus particles were further purified, quantified, and sequentially transfected to cardiomyocytes of neonatal Sprague-Dawley rats. The Adeno-EGFP transfected and non-transfected cardiomyocytes were used as control group. 24 hours later, the transfection efficiency was observed by fluorescent microscope, and expressions of Brg1 mRNA and protein were detected by quantified PCR and western blotting. After treatment with 100 µmol/L H₂O₂ for 12 hours, the expressions of Brg1 protein and cleaved-Caspase 3 were measured by western blotting, and cell apoptosis was analyzed by flow cytometry.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The recombinant adenovirus vector of Brg1 had been successfully transfected into cardiomyocytes with higher expressions of Brg1 mRNA and protein, and the transfection efficiency reached more than 90%. (2) After H₂O₂ treatment, the Brg1 was significantly down-regulated in contrast to the up-regulation of cleaved-Caspase 3; the flow cytometry data showed that the apoptotic cells were increased. But in Adeno-Brg1 transfected cardiomyocytes, the H₂O₂ induced cell apoptosis was significantly decreased compared with non-transfected cells and empty vector transfected cells. (3) These results suggest that oxidative stress can directly inhibit the Brg1 expression, and overexpression of Brg1 can protect the cardiomyocytes from cell apoptosis induced by oxidative stress.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Genes, Cells, Diabetic Cardiomyopathies, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

李素娟，袁文常，麦云珮，侯宁. 过表达Brahma-相关基因1腺病毒载体对氧化应激诱导心肌细胞凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(40): 6021-6027.

Li Su-juan, Yuan Wen-chang, Mai Yun-pei, Hou Ning. Adenoviral vectors carrying Brahma-related gene 1 attenuates oxidative stress-induced apoptosis of cardiomyocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(40): 6021-6027.

图/表（结果） 1

2.1 重组腺病毒载体Adeno-Brg1转染心肌细胞的效率 原代培养新生大鼠心肌细胞转染Adeno-Brg1 24 h后，可见Adeno-Brg1转染组和空载体Adeno-EGFP转染组被转染的细胞搏动规律有力，透光度好，见图1。

荧光显微镜下观察可见，Adeno-Brg1转染组细胞核内绿色荧光明显增强，提示核内Brg1表达增高，阳性细胞转染率达90%以上，而空载体Adeno-EGFP转染组绿色荧光仅见于胞浆中，见图2。说明构建的重组腺病毒能感染心肌细胞，对细胞活性无明显影响。

2.2 重组腺病毒载体Adeno-Brg1对心肌细胞Brg1 mRNA表达的影响 分别利用RT-PCR、Real-time RT-PCR检测转染后Brg1 mRNA表达。转染24 h后，与对照组相比，Adeno-Brg1 mRNA表达量增加7.8倍(P < 0.01)；空载体Adeno-EGFP对心肌细胞Brg1 mRNA表达无明显影响(P > 0.05)，见图3。

2.3 重组腺病毒载体Adeno-Brg1对心肌细胞Brg1蛋白表达的影响 Western-blot检测可见Brg1、GAPDH特异性条带，相对分子质量分别为210 000、37 000左右。转染Adeno-Brg1后心肌细胞目的蛋白表达显著高于空载体Ad-EGFP转染后心肌细胞的Brg1表达，见图4。

2.4 H₂O₂对心肌细胞Brg1表达的影响 100 µmol/L 的H₂O₂处理12 h，Western-blot结果显示，H₂O₂可显著抑制心肌细胞Brg1表达，见图5。

2.5 重组腺病毒载体Adeno-Brg1对H₂O₂诱导的心肌细胞凋亡的影响 腺病毒转染24 h后继续给予 100 µmol/L H₂O₂处理12 h，流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示，H₂O₂处理组能明显诱导心肌凋亡，细胞凋亡增加175%；而Adeno-Brg1转染组，细胞凋亡率降低35%；单纯腺病毒转染组和空载体Ad-EGFP转染组对细胞凋亡无明显影响，见图6。

Western-blot结果显示，H₂O₂显著诱导凋亡标志蛋白cleaved-Caspase3表达，Adeno-Brg1转染后能显著抑制H₂O₂诱导的cleaved-Caspase3表达，结果与流式细胞仪检测结果一致；单纯腺病毒转染组和空载体组对cleaved-Caspase3表达无影响，见图5。

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引言

糖尿病心脏病是糖尿病最常见、最严重的并发症之一，约3/4的2型糖尿病患者均并发有心脏疾病^[1]。糖尿病患者不但心力衰竭的发病率比非糖尿病者高，其左心室功能及预后也明显低于非糖尿病患者^[2]。大量研究资料已证实，持续高糖、高脂环境诱导的氧化应激是引起糖尿病心脏并发症的独立危险因素，但其具体机制尚不完全清楚，因此，阐明糖尿病心脏并发症、心功能障碍的机制，建立有效的治疗方法和手段，对于改善糖尿病患者生活质量，延长患者寿命具有十分重要的意义。

Brahma-相关基因1 (Brahma-related gene 1，Brg1)是染色质重塑复合物SWI/SNF的核心亚单位，具有ATP酶活性，通过水解ATP释放的能量来改变染色体的结构，实现对基因表达的调控^[3]。目前的研究发现，Brg1通过调控心脏基因表达调节心肌分化、生长等心脏胚胎发育进程；对转基因动物的研究显示，成年阶段Brg1过表达参与心肌肥厚等病理生理过程^[4-6]。但目前为止，对Brg1在心脏中的研究仍较为局限。最近的研究发现，糖尿病时心脏Brg1表达降低是导致心功能障碍的重要因素^[7]；持续氧化应激可能是抑制心脏Brg1表达的原因之一，但其具体机制亟待深入研究。

由于目前缺乏特异性调节Brg1表达的化合物，实验根据腺病毒载体感染不分裂细胞、转染效率高等特点，利用基因工程技术构建腺病毒表达载体诱导原代分离培养的乳鼠心肌细胞Brg1基因持续过表达；并在体外环境下建立心肌细胞氧化应激模型，观察氧化应激对Brg1表达的影响；观察Brg1过表达后对氧化应激诱导的心肌细胞损伤是否具有保护作用，从而为后续基因治疗糖尿病心肌病奠定体外细胞实验基础。

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材料方法

1.1 设计 基因学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年4月至2015年6月在广州医科大学药学院药理学系实验室完成。

1.3 材料

实验动物：健康SPF级1-3 d SD乳鼠30只，雌雄不拘，由广东省医学动物实验中心提供。实验中对动物的处理方式符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准依据^[8]。

质粒：AdEASY系统(pAd-Track-CMV质粒、含Ad-EASY-1质粒的大肠杆菌BJ5183)购自广州Cyagen公司。

1.4 实验方法

乳鼠心肌细胞的原代分离培养：心肌细胞培养参照文献[9]的方法。取新生1-3 d的SD乳鼠左室心肌组织，利用胰蛋白酶消化法、差速贴壁法分离、纯化心肌细胞，以2×10⁵/孔接种于6孔板。培养至第2天，换用无抗生素含体积分数5%胎牛血清的DMEM培养基和Brdu (0.1 mmol/L)。培养第3天换用不含Brdu的上述无血清培养基，可见95%的心肌细胞搏动，即可进行后续实验。

构建重组Adeno-Brg1：按FuGENE HD使用说明将PacⅠ线性化的Adeno-Brg1转染入HEK293T细胞(由广州医科大学分子医学实验中心提供)中，转染24 h后观察细胞绿色荧光蛋白表达情况。7 d后收集细胞和培养上清，反复冻融以释放病毒颗粒，收集病毒上清液浓缩并检测病毒滴度，经PCR扩增鉴定后得到10¹¹ pfu/mL的Brg1腺病毒。

重组腺病毒转染心肌细胞：心肌细胞培养72 h后，将Adeno-Brg1病毒液与含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基混合均匀，添加至细胞中，置于恒温密闭式培养箱中进行培养，培养条件为体积分数为5%CO₂、37 ℃。培养12 h之后更换新鲜含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养12 h，以进行后续实验。在同等条件下进行空载病毒Adeno-GFP转染，以正常培养的心肌细胞为对照组。

RT-PCR检测心肌细胞Brg1 mRNA表达：转染24 h后，分别提取Adeno-Brg1和空载体Adeno-EGFP转染组心肌细胞的总RNA，经MMLV反转录酶合成cDNA，QuantiTect^® SYBR^® Green PCR kit在ABI7500荧光定量PCR仪进行目的基因PCR扩增。以GAPDH表达为内参照，Brg1表达量的计算公式：相对含量=2^-^??Ct，通过PCR扩增循环数和各循环荧光信号强度分析并计算结果。

Western-blot检测心肌细胞Brg1蛋白表达：转染 24 h后，分别收集Adeno-Brg1和空载体Adeno-EGFP转染组的心肌细胞，RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，经BCA法定量后煮沸5-10 min，蛋白冷却上样，经SDS-PAGE电泳、转膜、抗体结合、荧光显影并摄图分析。为保证每孔上样等量蛋白，显影后的膜重新封闭，再孵GAPDH一抗做内参照。

H₂O₂处理腺病毒转染的心肌细胞：重组腺病毒转染心肌细胞24 h后，暴露于37 ℃、100 µmol/L 的H₂O₂ 12 h，随后用PBS漂洗细胞3次，进行后续凋亡标志物和Brg1的检测。

Western-blot检测心肌细胞Brg1蛋白、cleaved- Caspase3表达：转染前后的心肌细胞经H₂O₂处理后，RIPA提取细胞总蛋白，经蛋白定量后与上样缓冲液充分混合进行电泳，电泳结束将蛋白条带转印至PVDF膜，室温摇床封闭1 h，随后分别孵育Brg1(1∶1 000)、cleaved-Caspase 3(1∶1 000)抗体4 ℃过夜。次日，TBST洗膜后加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体(1∶1 000)，室温摇床孵育1 h，经荧光显影检测目的蛋白表达。

Annexin-V/PI双染法检测转染心肌细胞的凋亡：用无酚红、无EDTA的胰酶消化H₂O₂处理的转染前后的心肌细胞，收集(1-5)×10⁵细胞，加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞及5 μL Annexin V-EGFP混匀后，加入 5 μL Propidium Iodide，混匀，室温避光、反应5-15 min；应用流式细胞仪检测细胞凋亡，计算凋亡百分率。

1.5 主要观察指标 Brg1腺病毒表达载体转染心肌细胞的效率；转染后心肌细胞Brg1表达的情况；H₂O₂对心肌细胞Brg1表达的影响；Brg1腺病毒载体转染后对H₂O₂诱导的心肌细胞凋亡的影响。

1.6 统计学分析 数据以x(_)±s表示，利用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析，两组间比较用LSD-t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

随着中国人民生活方式的快速转变，糖尿病在中国的流行已成为人们高度关注的问题。最新研究表明，目前中国糖尿病患者有9 000万，准糖尿病患者已达1.4亿^[1]。与非糖尿病患者相比，糖尿病患者心脏并发症发生率高，最终由于心室重构、心力衰竭而死亡，严重威胁人们生命安全^[10-11]。目前的研究认为糖尿病状态下机体持续的糖脂代谢紊乱、氧化应激、炎症等因素是导致糖尿病心功能障碍的重要因素^[12-15]，但其具体机制尚不完全清楚。因此，阐明继发于糖尿病的心脏功能障碍发生机制，建立有效的治疗方法和手段，是全世界共同关注的热点问题。

染色质高度紧密的折叠阻止转录因子、辅助因子与DNA结合，而染色质重构通过解除这样的结构而促进转录活动的正常进行^[16]。Brg1作为染色质重组复合物SWI/SNF的关键亚单位，利用其ATP酶活性通过水解ATP释放的能量，在基因的转录、调控、复制、重组等方面起重要作用^[17-18]，调控多个组织、器官生长发

育^[16^，^19-21]。在心脏发育过程中，Brg1也发挥重要调控作用^[5-6^，^22]。胚胎期，Brg1通过调控心脏BMP10、p57kip2基因表达促进细胞增殖^[3^，^23]；心内膜表达的Brg1通过抑制ADAMTS1保持心脏形态发育的微环境^[6]；Brg1表达降低与遗传性心力衰竭呈正相关^[5]。随着不断的生长发育，心脏Brg1表达逐渐降低，至成年阶段维持在较低水平。在成年阶段，压力超负荷等应激状态能促进心肌Brg1表达，激活的Brg1通过与HDAC、PARP形成复合物促进胚胎基因β-MHC的表达参与心肌肥厚的病理进程^[4]。这些研究结果显示，Brg1不但参与心脏胚胎发育进程，在心脏疾病的病理生理过程中也扮演重要角色。

最近有研究发现，Brg1也参与糖尿病心脏病的发展过程中。Xu等^[7]的结果显示，1型糖尿病小鼠心脏中Brg1表达显著降低；抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸能上调其表达。该结果提示，Brg1可能是氧化应激导致糖尿病心肌病的重要靶点，但由于缺乏直接的体外实验，氧化应激与Brg1的关系尚需进一步研究。

由于目前缺乏特异性调控Brg1表达的化合物，而原代培养的乳鼠心肌细胞作为终末分化细胞，具有外源基因导入难的特点，为深入研究Brg1在糖尿病心肌病、氧化应激中的作用，作者此次实验利用基因重组技术构建重组腺病毒载体，用HEK293T细胞包装扩增出腺病毒Adeno-Brg1，经鉴定病毒滴度不低于10¹¹ pfu/mL。将Adeno-Brg1转染至原代心肌细胞，24 h后荧光显微镜下观察计数，该病毒载体转染效率在90%以上；并进一步经荧光定量RT-PCR和免疫印迹法证实，Adeno-Brg1不但能高效转染心肌细胞还能诱导细胞Brg1的mRNA和蛋白表达稳定、持续增高。这一系列结果证实腺病毒载体Adeno-Brg1构建成功，可进行后续实验。

为进一步研究氧化应激对心肌Brg1表达的直接影响，本实验利用过氧化氢建立心肌细胞氧化应激模型，免疫印迹结果显示，过氧化氢处理组Brg1表达明显降低，该结果与糖尿病心脏的研究一致^[7]，提示Brg1是氧化应激的重要下游靶点，持续的氧化应激能抑制心脏Brg1表达。已有研究表明，Brg1表达减少会导致离散的异染色质溶解，阻止有丝分裂进程，导致基因组的不稳定性，最终导致细胞坏死或凋亡^[24]。而持续的氧化应激是导致心肌细胞凋亡的重要因素。因此本实验将细胞凋亡作为细胞损伤的观察指标。结果显示过氧化氢刺激12 h细胞凋亡数目明显增多，凋亡标志物cleaved- Caspase 3表达上调；Adeno-Brg1过表达Brg1后，心肌细胞凋亡数目降低35%，Cleaved-caspase 3表达减少；这些结果显示上调Brg1能保护氧化应激诱导的心肌凋亡，提示Brg1降低是氧化应激诱导心肌细胞凋亡的重要核内机制。

综上所述，实验首次在体外研究中证实氧化应激对Brg1表达的影响：氧化应激能直接抑制心肌细胞Brg1表达；过表达Brg1对氧化应激诱导的细胞凋亡具有保护作用。此研究结果提示Brg1是氧化应激导致心功能损伤的重要靶点，通过调控Brg1表达可增强心肌组织抗氧化能力，改善心脏功能。研究为阐明糖尿病心肌病发病的分子机制奠定实验学基础，并为糖尿病心肌病的基因治疗提供新靶点。

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