不同孔隙率多孔钛铌合金的生物力学强度及细胞生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.38.013

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
钛铌合金：具有较高的强度和较低的弹性模量，更接近于人皮质骨，近几年来在临床医学上被作为人工髋关节及牙科植入材料。在长期已久的研究中表明，致密形钛合金植入物缺乏诱导骨组织长入的能力，并且由于材料密度较大，其稳定性也较差。因此有相关的学者指出采用多孔结构材料来代替致密形钛合金材料。
多孔结构材料：多孔表面有利于骨组织的长入，并且能够提供良好的生物形固定。有研究表明骨组织能够渗透到多孔材料中，提高骨组织与多孔材料的连接，并且多孔材料能够提高材料和组织细胞的生物相容性，提高玻连蛋白和纤连蛋白在合金表面的沉积，提高在细胞组织在钛合金表面的沉积，促进细胞组织与多孔材料的相容性。

背景：钛铌合金具有较高的生物力学强度及较低的弹性模量，更加接近于人皮质骨，目前已被广泛作为牙科、骨科及人工髋关节植入材料。
目的：观察不同孔隙率多孔钛铌合金的生物力学强度及细胞相容性。
方法：利用粉末冶金技术制备40%、70%孔隙率的多孔钛铌合金，检测两种多孔钛铌合金的孔径、弹性模量及抗压强度。将兔骨髓间充质干细胞分别接种于40%、70%孔隙率的多孔钛铌合金表面，接种3，24，72 h，观察细胞黏附与增殖情况。
结果与结论：①多孔钛铌合金孔径为200-500 μm，两种均以350，400 μm孔径为主，孔隙间三维连通，材料表面粗糙，70%孔隙率组孔隙呈蜂窝状，部分断裂，孔隙间连通；40%孔隙率组孔隙分布不均匀，孔隙间少有连通；两组钛铌合金均具有较高的抗压强度及较低的弹性模量，组间比较无差异；②两组钛铌合金均有利于细胞的黏附，70%孔隙率组表面的细胞黏附数量多于40%孔隙率组(P < 0.05)，且70%孔隙率组表面可见细胞外基质已形成，结果表明70%孔隙率多孔钛铌合金更有利于细胞的黏附。

ORCID: 0000-0001-9339-7964(王雷)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 多孔钛铌合金, 人工关节置换, 孔隙率, 生物力学强度, 生物相容性

Abstract:

BACKGROUND: Titanium-niobium alloy holds high biomechanical strength and low elastic modulus that is close to the human cortical bone, so it has been extensively used as implant materials of dental, orthopedics and artificial hip joints.
OBJECTIVE: To observe the biomechanical strength and cytocompatibility of porous titanium-niobium alloys with different porosities.
METHODS: Porous titanium-niobium alloys with the porosity of 40% and 70% were prepared using powder metallurgy technology. Afterwards, the pore size, elasticity modulus and compressive strength of the two alloys were detected. Then the rabbit bone marrow mesenchymal stem cells were seeded onto the 40% and 70% porous titanium-niobium alloys, and cell adhesion and proliferation were observed at 3, 24 and 72 hours after inoculation, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Pore size of porous titanium-niobium alloys with rough surface was 200-500 μm, and both main pore size was 350 and 400 μm, and there was three-dimensional connectivity between the pores; in the 70% group, honeycombed pores were partly fractured, and connected mutually; pores distributed unevenly and there was little communication between the pores in the 40% group. In addition, both groups had high compressive strength and low elastic modulus, but there was no difference between the two groups. Furthermore, both two alloys promoted cell adhesion, and the number of cell adhesion in the 70% group was significantly higher than that in the 40% group (P < 0.05), and extracellular matrix could be found in the 70% group. These results show that porous titanium-niobium alloy with the porosity of 70% is significantly conducive to cell adhesion.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Prostheses and Implants, Elasticity Modulus, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王雷，李强. 不同孔隙率多孔钛铌合金的生物力学强度及细胞生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(38): 5709-5715.

Wang Lei, Li Qiang.

Porous titanium-niobium alloys with different porosities: biomechanical strength and cytocompatibility

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(38): 5709-5715.

图/表（结果） 6

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引言

材料方法

1.1 设计观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2015年1至6月在陕西省中医院中医药研究所病理实验室完成。

1.3 材料

实验动物：1只4月龄新雄性西兰大白兔，体质量 2.4 kg，由北京大学医学部实验动物科学部提供，实验动物许可证：SYXK(京)2014-0039。

1.4 实验方法

粉末冶金法^[13-14]：首先按照实验设计配好粉末，其中粉末中钛粉和铌粉的质量比为2∶1。在行星球磨机中混合4 h，以保证混合均匀。然后将一定量的聚乙烯醇置入蒸馏水中，并加热直到溶解。等待冷却后取一定量的溶液加进钛铌粉中，充分均匀搅拌使其成为浆状物，每100 g金属钛铌粉与一定量的聚乙烯醇溶液混合，然后用泡沫放入溶液中，浸渍后放进真空干燥箱中，在真空干燥箱中时间在2-4 h，温度设置在70-80 ℃，真空度5 Pa以下。采用氩气为保护气氛来进行第1次烧结，保温时间2.0-3.0 h，烧结温度为1 400-1 500 ℃。继续升温之后，在氩气保护气氛中进行第2次烧结，保温时间为1.0-2.0 h，烧结温度为1 700-1 800 ℃。最后取出制备的样品后进行清洁处理，并检测该材料的性能。

孔隙率的控制：目前大多数的学者认为多孔材料的孔隙率越高，材料在置入体内对于毛细血管的生长具有积极意义，而毛细血管的生长又有利于骨组织的生长。电子束溶融法是一种有希望的快速制造工艺，可用于定制钛植入物的直接制作，以使个体化医疗成为可能，孔径从几十微米到500 µm，孔隙相互贯通，可满足工程支架材料的要求^[13]。虽然通过许多方法可获得所谓的高孔隙率，从45%-87%不等，但到目前为止尚未见有孔隙率100%多孔材料应用的报道^[14]。

多孔钛铌合金孔径及孔隙率的测定^[15-16]：对于制备的多孔钛铌合金表面进行喷金处理，在扫描电镜下观察来计算平均孔径值。并采用压汞法来测定孔隙率，首先测定材料体积，然后对其进行抽真空处理，在真空达到小于50 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)后将汞填充至材料周围，从外部对汞进行加压，并记录加压过程中汞的体积及加在汞上的压力。

孔隙率=进入孔中汞体积/多孔钛铌合金体积。

多孔钛铌合金的力学性能测量：在CMT 4000电子万能试验机上对多孔钛铌合金进行压缩试验后，对不同孔隙率材料的弹性模量、压缩强度进行评定分析。试验时将试样放在力学试样机的水平底座上，以一定的速率进行单向加载力，直到试样发生破坏，试样发生破坏的力Fmax称为最大加载力^[17-18]。

兔骨髓间充质干细胞的分离和培养：对新西兰大白兔进行麻醉，在左侧髂后上棘后下约1 cm骨质较平处行骨髓穿刺。将白兔穿刺部位备皮之后采用用络合碘消毒，然后用16号骨穿针垂直穿入白兔皮质，抽取骨髓3 mL^[19-20]。

在骨髓经过PBS洗涤稀释后加入到1.079 g/mL Percoll分离液上，在离心机中离心15 min后吸取第2层白色膜状层，然后加入适量PBS洗涤，再次离心5 min后去上清，然后收集到细胞悬液。用含体积分数10%的FBS培养基重悬细胞后接种在无菌培养瓶中。然后将细胞放置在37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度培养箱内进行培养，在5 d之后全量换液，并弃去非贴壁细胞。之后每4 d半量换液。等待细胞80%融合后，用一定比例的胰蛋白酶和EDTA混合液消化，并按照1∶3的比例进行传代。细胞传之5代用于实验。

骨髓间充质干细胞的鉴定：收集消化后的细胞，按 3 000个/cm²密度接种于6孔板或24孔板，待多数细胞贴壁后，换用含体积分数为10%FBS的高糖DMEM培养液，加入成骨诱导体系(含地塞米松1 mmoL/L、β-甘油磷酸钠 10 mmoL/L、抗坏血酸磷酸盐50 mmoL/L)，每3 d全量换液，维持二三周，用碱性磷酸酶试剂盒染色^[21-23]。

多孔钛铌合金材料表面细胞的黏附和增殖：将5代兔骨髓间充质干细胞以1×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于6孔板中，同时分别加入70%孔隙率多孔钛铌合金或者40%孔隙率多孔钛铌合金，培养3，28，72 h，电镜下观察处在时间的的细胞黏附情况。其次，血球计数板计数活细胞数量。取上述细胞，胰酶消化后，冷PBS重悬2次，制备单个细胞悬液，适当稀释后，于倒置显微镜下用血球计数板计数细胞数量。

细胞数=(4大格细胞数之和/4)×10⁴×稀释倍数×原液体积(mL)。

1.5 主要观察指标

多孔铌钛合金的孔径和孔隙率：计算多孔铌钛合金的孔径和孔隙率，并在电镜下观察材料表面特性。

多孔钛铌合金的力学性能：通过多孔铌钛合金的力学性能测量来探究多孔铌钛合金是否具有比较理想的抗压强度和弹性模量。

细胞相容性：通过观察多孔钛铌合金的材料表面细胞的黏附和增殖的数量，来探究材料的细胞相容性情况。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件对研究中得到数据进行统计学分析。计量资料采用t 检验，计数资料采用χ²检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

在20世纪60年代由研究提出了“骨结合”的理念，为假体置入奠定了理论基础。骨结合是指体内植入物与骨之间紧密结合，是骨-植入物稳定的前提条件^[26-27]。骨结合包括材料的生物相容性、材料的形状设计、材料表征等多方面的影响因素^[28-29]。而影响骨-植入物结合稳定性的关键因素是材料形状设计及材料的表征。支架材料还必须具有适应细胞黏附、增殖的环境，并能维持细胞正常表型表达。目前相关研究发现，多孔设计能改善植入物和骨组织的相容性，提高骨-植入物的稳定性^[30-31]。钛材料是目前应用较广泛的生物材料之一，具有质量轻、强度高等良好的物理特性。最近研究表明，钛和钛合金等金属作为一种良好的金属材料已被广泛应用到医学领域，特别是在骨科疾病及牙科疾病等领域^[32-33]。但钛材料置入体内后，容易在其与骨组织间形成致密纤维组织，所以稳定性差，并且其难以诱导骨组织长入^[34-35]。为了填补这种单一材料的缺陷，有相关研究提出采用多种金属材料合金的方式来填补这种缺陷。在最初的性能研究中显示，钴铬合金具有较好的骨骼整合能力，因此具有较好的稳定性^[36-37]。但钴和铬都是重金属，长期使用会在体内富集，对人体造成毒害^[38]。另外也有相关学者提出采用钽和镍合金来作为研究材料，这种合金材料虽然无毒，稳定性也较好，但可塑性较差，因此这种材料的应用也不是十分的广泛。通过对各种合金材料的研究发现，对于材料的选择不仅要符合安全无害要求，还要符合强度的要求^[39-40]。最近有专家学者指出，钛铌合金具有较高的强度和较低的弹性模量，更接近于人皮质骨，近几年来在临床医学上被作为人工髋关节及牙科植入材料。在长期已久的研究中表明，致密形钛合金植入物缺乏诱导骨组织长入的能力，并且由于材料密度较大，其稳定性也较差。因此有相关的学者指出采用多孔结构材料来代替致密形钛合金材料。临床研究显示，多孔表面有利于骨组织的长入，并且能够提供良好的生物形固定。有研究表明骨组织能够渗透到多孔材料中，提高骨组织与多孔材料的连接^[41-42]，并且多孔材料能够提高材料和组织细胞的生物相容性，提高玻连蛋白和纤连蛋白在合金表面的沉积，提高在细胞组织在钛合金表面的沉积，促进细胞组织与多孔材料的相容性。随着细胞组织与多孔材料的结合，也能够提高骨组织在空隙内的生长，提高材料稳定性^[43]。实验利用粉末冶金术来制备多孔钛铌合金，评估该材料的生物力学强度、孔隙率、孔径及生物相容性，为新型多孔钛铌合金的研制提供基础实验依据。

实验制备了不同孔隙率多孔钛铌合金，并从孔径及孔隙率、生物力学等方面对多孔钛铌合金进行评估，同时进行了细胞黏附和增殖实验，在电镜下观察细胞的黏附和增殖情况。此次实验发现：多孔钛铌合金材料的孔径为200-500 μm，两种均以350 μm和400 μm孔径为主，孔隙间三维连通，材料表面粗糙，70%孔隙率钛铌合金孔隙呈蜂窝状，部分断裂，孔隙间连通；40%孔隙率钛铌合金孔隙分布不均匀，孔隙间少有连通。40%孔隙率组弹性模量约为2.67 GPa，抗压强度约为 81.34 MPa；70%孔隙率组弹性模量约为2.23 GPa，抗压强度约为94.8 MPa。两组材料之间抗压强度与弹性模量比较差异无显著性意义(P > 0.05)。两者均具有较高的抗压强度及较低的弹性模量。兔骨髓间充质干细胞在接种3 h之后呈长梭形，黏附于材料表面；在细胞接种24 h之后，呈长梭形伪足状突起，细胞紧紧贴附于材料表面，细胞之间以伪足状突起建立起相互联系；两组钛铌合金表面均已形成细胞团，而且细胞密集度较高，但在电镜下可以看到70%孔隙率组细胞外基质已形成，细胞沿孔隙边缘向孔隙深部长入。孔隙间三维连通，可以有效促进骨组织的长入。多孔钛铌合金材料也已达到了最初的低弹性模量设计目标，而且生物力学强度大，不仅可有效延长其在体内的使用寿命，而且能获得较好的骨整合效果。

综上，多孔钛铌合金具有较理想的抗压强度和弹性模量，在体内的使用寿命较长，同时稳定性较强，同时高孔隙率的多孔钛铌合金更利于细胞的增殖和新骨的形成。

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