纳米羟基磷灰石复合树脂材料细胞毒性及在牙体缺损修复中的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.38.011

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
肿瘤干细胞：牙科光固化复合树脂虽然已在临床上得到应用，但在性能方面仍然存在某些不足，所以如何进一步提高其性能成为目前研究的热点之一。羟基磷灰石是脊椎动物骨骼和牙齿的主要无机成分，已被广泛应用于口腔医学之中。纳米羟基磷灰石具有良好的生物活性、生物相容性、生物安全性，其晶体结构在成分方面与牙体硬组织及天然骨十分接近。以往王云等报道，以含55%的纳米羟基磷灰石与光固化树脂基质制备成的复合材料，其压缩强度和挠曲强度能够达到牙科修复材料的要求。
材料修复牙体缺损后的评估指标：龈沟液主要由各种龈下菌斑微生物的代谢产物等组成，与牙周组织炎症的发生之间存在十分密切的联系。在机体正常健康状态下，天冬氨酸转氨酶大多存在于细胞胞质中，如果出现组织遭到破坏及细胞坏死的情况，便会有大量的天冬氨酸转氨酶出现在细胞外。因此，天冬氨酸转氨酶可作为牙周组织破坏的早期标志物之一。碱性磷酸酶主要参与骨代谢，如果受到一定因素的影响导致牙周组织遭到破坏，牙周膜细胞便会出现破裂，导致碱性磷酸酶水平的显著上升。

背景：有研究发现，将纳米羟基磷灰石与光固化树脂基质制备成复合材料，其压缩强度和挠曲强度能够达到牙科修复材料的要求。
目的：检测纳米羟基磷灰石复合树脂材料的细胞毒性，分析其修复牙体缺损的效果。
方法：①体外实验：采用10%、50%、100%浓度的纳米羟基磷灰石复合树脂材料浸提液分别培养第5代牙周膜成纤维样细胞与L-929细胞，以新鲜细胞维持液的为阴性对照，培养7 d内检测细胞增殖A值。②体内修复试验：选择57例牙体缺损患者，其中男37例，女20例，年龄15-31岁，均采用纳米羟基磷灰石复合树脂材料进行修复，修复后随访3年，检查修复体完整性、边缘适合性、颜色匹配情况，以及牙周探诊深度、龈沟出血指数、牙齿松动度、菌斑指数、龈沟液量、天冬氨酸转氨酶水平等。
结果与结论：①体外实验：不同浓度纳米羟基磷灰石复合树脂材料浸提液对牙周膜成纤维样细胞与L-929细胞的增殖均无影响；②体内修复试验：修复后随访3年，患者牙周探诊深度、龈沟出血指数、牙齿松动度、菌斑指数、龈沟液量、天冬氨酸转氨酶水平较修复前显著下降(P < 0.05)，碱性磷酸酶水平未出现明显改变(P > 0.05)；出现修复体不完整3例，颜色不匹配4例，边缘不适合3例；③结果表明：纳米羟基磷灰石复合树脂材料无细胞毒性，修复牙体缺损可维持良好的牙周健康状态，具有良好的生物相容性。

ORCID: 0000-0001-5789-1543(王璞)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 纳米材料, 纳米羟基磷灰石, 复合树脂, 牙体修复, 细胞毒性, 生物相容性, 应用价值

Abstract:

BACKGROUND: It has been found that the compressive strength and flexural strength of nano- hydroxyapatite combined with light-cured resin matrix can neet the requirements of dental restorative materials.
OBJECTIVE: To detect the cytotoxicity of nano-hydroxyapatite/composite resin, and to analyze its effects on the dental restoration.
METHODS: In vitro test: passage 5 periodontal ligament fibroblast-like cells and L-929 cells suspensions were cultured in the 10%, 50%, 100% of nano-hydroxyapatite/composite resin extracts, respectively, and fresh maintenance medium functioned as negative control group. Absorbance values were detected within 7-day culture. In vivo repair test: 57 cases with tooth defect were enrolled containing 37 males and 20 females aged from 15 to 31 years old, and all were subjected to nano-hydroxyapatite/composite resin treatment. A 3-year follow-up was undergone to detect the completeness, marginal adaptation and color matching of the restoration, as well as the periodontal probing depth, sulcus bleeding index, tooth mobility, dental plaque index, gingival crevicular fluid and aspartate aminotransferase level.
RESULTS AND CONCLUSION: In vitro test results showed that the different concentrations of nano- hydroxyapatite/composite resin extracts had no effects on both periodontal ligament fibroblast-like cells and L-929 cells. In vivo repair test results found that after 3 years of follow-up, the periodontal probing depth, sulcus bleeding index, tooth mobility, dental plaque index, gingival crevicular fluid and aspartate aminotransferase level of patients were significantly decreased than those before repair (P < 0.05), but the alkaline phosphatase level revealed no significant change (P > 0.05). Unfortunately, three cases with incomplete restoration, four cases with color mismatching, and three cases with the inadaptable edge occurred. To conclude, the nano-hydroxyapatite/composite resin holds good biocompatibility and no cytotoxicity, which can maintain a good periodontal health condition in the dental restoration.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Hydroxyapatites, Composite Resins, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王璞，韦丽宾. 纳米羟基磷灰石复合树脂材料细胞毒性及在牙体缺损修复中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(38): 5697-5702.

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Nano-hydroxyapatite/composite resin: cytototoxicity and application in dental restoration

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图/表（结果） 3

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引言

材料方法

1.1 设计体外观察性实验与回顾性病例分析。

1.2 时间及地点试验于2012年10月至2015年12月在河北医科大学第二医院完成。

1.3 材料

细胞：牙周膜成纤维样细胞、L-929细胞均由上海盈公生物技术有限公司提供。

主要试剂和仪器：纳米羟基磷灰石(北京市意华健科贸有限责任公司)；双酚A-甲基丙烯酸缩水甘油酯(美国Sigma公司)；双甲基丙烯酸二缩三乙二醇、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯、(浙江天杭生物科技有限公司)；MTT液(上海酶联检测技术有限公司)；二甲基亚砜、胎牛血清(上海起福生物科技有限公司)；链霉素(北京杰辉博高生物技术有限公司 )；青霉素(北京百奥莱博科技有限公司)；DMEM(北京政博伟业生物科技有限公司)；培养板(南京有为生物科技有限公司)；超净工作台(浙江天杭生物科技股份有限公司)；全自动生化分析仪(上海盈公生物技术有限公司)。

1.4 对象纳入57例牙体缺损修复患者，其中男37例，女27例，年龄15-31岁，平均(20.12±2.35)岁。同一患者多颗牙均选择同一修复方法，治疗均由同一组医师进行操作。

纳入标准：牙体缺损达到2/3-3/4者；以往均接受常规充填治疗，效果不佳者；已接受根管治疗，经检查根尖区未发现阴影者；牙根未出现松动现象者。

排除标准：牙周炎、牙龈炎患者；咬合关系异常者；根管形态异常者；临床资料不完备者。

1.5 方法

1.5.1 纳米羟基磷灰石复合树脂材料的制备将双酚A-甲基丙烯酸缩水甘油酯与活性稀释剂双甲基丙烯酸二缩三乙二醇按照7∶3的质量混合，添加丙酮。充分溶解后添加光引发剂樟脑醌和有机胺活化剂甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯(质量分数0.5%-1.0%)，充分搅拌后静置。1 d后添加稀释剂，并按照质量分数55%的比例添加纳米羟基磷灰石，对二者进行充分搅拌，搅拌均匀后保存备用，利用模具制备纳米羟基磷灰石复合树脂试件，保存备用。

1.5.2 体外实验

材料浸提液的制备：取纳米羟基磷灰石复合树脂材料10 mg，置于无菌小玻璃瓶内，于120 ℃、444.82 kPa高温高压消毒20 min，再用紫外灯照射30 min后，无菌环境下加入10 mL细胞维持液，然后置于37 ℃，二氧化碳培养箱中120 h，用含胎牛血清、链霉素、青霉素的DMEM培养基配置成浓度为10%、50%、100%的浸提液备用。

细胞毒性检测^[7-9]：常规原代和传代培养牙周膜成纤维样细胞，收集第5代细胞用于细胞毒性实验。将第5代牙周膜成纤维样细胞、L-929细胞悬液分别接种在96孔培养板中，观察细胞生长情况，待细胞贴壁之后，去掉原培养液，添加不同浓度纳米羟基磷灰石复合树脂材料浸提液，并将新鲜细胞维持液设为阴性对照组，于培养箱中培养7 d后，每孔添加MTT液(5 g/L)培养4 h，弃掉上清液，添加100 μL二甲基亚砜，振荡溶解10 min后用酶标仪测量每孔490 nm处吸光度(A)值。

1.5.3 体内修复治疗^[10-12] 利用纳米羟基磷灰石复合树脂材料对患者进行修复治疗。治疗前对患者进行常规牙周清洁和牙体预备等，57例患者一共接受68件固定修复体，其中后牙冠33件，前牙冠25件，贴面2件，嵌体8件。修复前对患者进行常规根管治疗和检查，对58颗死髓牙进行X射线片检查，其中40颗根尖尚未发育完全，行根尖诱导成形治疗，其余18颗牙根发育完成或根尖孔封闭，根管充填严密，死髓牙均进行全冠修复。修复桩核之后，常规预备牙体并进行排龈等，硅橡胶2次法取印模，制作全冠。并在患者口内进行试戴，观察并询问患者的试戴情况，适当予以调整，最后进行黏固。治疗结束后嘱患者按时复诊，连续观察3年。

术后随访与观察^[13-15]：修复结束后，对患者进行3年的随访。分别于修复后1，2，3年，用全自动生化分析仪检测牙周碱性磷酸酶水平。观察修复效果，包括修复体完整情(完整、不完整)、颜色匹配情况(匹配、不匹配)、边缘适合情况(适合、不适合)。修复后1，2，3年，记录牙齿松动度、菌斑指数、牙周探诊深度、龈沟出血指数和龈沟液量和天冬氨酸转氨酶水平。

1.6 主要观察指标体外实验细胞增殖及体内修复效果。

1.7 统计学分析对研究过程中的相关数据予以完整记录与收集，使用SPSS 18.0软件进行统计学分析。牙周探诊深度等指标组间比较予以单因素方差分析，组内比较予以配对t 检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

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讨论

日常生活中，多种原因会导致牙体缺损的出现，例如龋病、外伤、严重磨耗、酸蚀等^[16]。

对于不同程度的牙体缺损患者，可以通过一定的方式进行修复治疗^[17-19]。在临床牙科修复治疗过程中，纳米羟基磷灰石均为常用的材料^[20-23]。在体液的作用下，纳米羟基磷灰石会出现降解，释放出处于游离状态的钙和磷，并被人体组织吸收和利用，进而形成新的组织，发挥出骨传导作用。羟基磷灰石有着良好的空间网状结构和良好的组织、细胞相容性，是一种理想的修复材料^[24-28]。此次实验中，选择以纳米羟基磷灰石复合树脂材料为例，检测材料的细胞毒性^[29-32]，分析其在牙体修复中的应用效果。考虑到所检测的纳米羟基磷灰石复合树脂材料需要应用于牙体的修复之中，材料的接触环境中存在大量的成纤维细胞^[33]。为此，选择利用L-929细胞、牙周膜成纤维样细胞进行细胞毒性实验。实验结果显示，不同浓度纳米羟基磷灰石复合树脂材料浸提液与阴性对照组之间差异均无统计学意义。上述结果表明，纳米羟基磷灰石复合树脂材料不会对响L-929细胞、牙周膜成纤维样细胞的正常增殖产生影响。

试验中，通过对患者进行牙体修复，修复后不同时间进行随访，均获得了理想的修复效果。另外，在进行牙体缺损修复的过程中，还需要维持良好的口腔和牙周条件^[34]。此次研究中，选择修复后不同时间对患者的菌斑指数和碱性磷酸酶水平等指标进行观察，来了解相应的修复效果。龈沟液主要由各种龈下菌斑微生物的代谢产物等组成，与牙周组织炎症的发生之间存在十分密切的联系^[35-37]。在机体正常健康状态下，天冬氨酸转氨酶大多存在于细胞胞质中，如果出现组织遭到破坏及细胞坏死的情况，便会有大量的天冬氨酸转氨酶出现在细胞外^[38]。因此，天冬氨酸转氨酶可作为牙周组织破坏的早期标志物之一。碱性磷酸酶主要参与骨代谢，如果受到一定因素的影响导致牙周组织遭到破坏，牙周膜细胞便会出现破裂，导致碱性磷酸酶水平的显著上升^[39-40]。此次试验结果还显示，修复后1，2，3年患者的牙周探诊深度、龈沟出血指数、牙齿松动度、菌斑指数、龈沟液量、天冬氨酸转氨酶水平均出现显著下降，修复后1，2，3年患者的碱性磷酸酶水平均未出现明显改变。修复后随访3年，患者均未出现材料相关不良反应。即表明纳米羟基磷灰石复合树脂材料用于牙体修复之中，可以获得理想的修复效果，并维持良好的牙周健康状态。

综上所述，纳米羟基磷灰石复合树脂材料与L-929细胞、牙周膜成纤维样细胞发生直接接触之后，不会发生细胞毒性，不影响细胞的增长增殖。将其应用于牙体修复之中，可以获得理想的修复效果，并维持良好的牙周健康状态，具有良好的生物相容性，是一种理想的修复材料。

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