重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料的制备与性能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.38.006

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
重组人骨形态发生蛋白/骨修复材料：具有良好的生物相容性和力学性能，保留了自然骨的天然结构，重组人骨形态发生蛋白与骨修复材料特异性结合，克服了重组人骨形态发生蛋白在体内不易扩散和易降解的缺点，并实现重组人骨形态发生蛋白2的缓慢释放。能更好的满足创伤、感染、肿瘤及发育异常等原因所导致的骨缺损的修复要求，将在创伤修复领域特别是骨缺损的修复中发挥巨大作用。
骨形态发生蛋白2：主要对未分化间充质细胞和骨系细胞起到聚集和分化作用。在骨形成早期，骨形态发生蛋白2不仅可使未分化间质细胞向骨形成中心聚集并分化为骨细胞，而且可使成纤维细胞、成肌细胞及骨髓基细胞逆转分化为骨细胞。

背景：制备具有天然骨结构，能够结合生物因子的骨修复材料成为研究的热点。
目的：制备重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料，评估其释放、活性及诱导异位成骨的能力。
方法：首先制备含有胶原结合域的重组人骨形态发生蛋白2，然后将胶原结合域与骨修复材料中的胶原相结合，经过冷冻干燥制备重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料，采用ELISA法检测重组人骨形态发生蛋白2的体外释放情况。将C2C12细胞滴加到重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料上(重组人骨形态发生蛋白2剂量分别为0.25，0.5，1 μg/块)，72 h后检测细胞碱性磷酸酶活性。将含0，2，5，10 µg重组人骨形态发生蛋白2的重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料分别埋置于SD大鼠肌肉内，埋置2，4周后，检测磷酸酶活性与新骨生长情况。将CY7标记的重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料埋置于SD大鼠后肢肌肉窝内，观察重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料的稳定性。
结果与结论：重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料内的重组人骨形态发生蛋白2在45 d内基本没有释放；C2C12细胞的碱性磷酸酶活性随复合材料中重组人骨形态发生蛋白2剂量的升高而升高；重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料植入体内的稳定性较好，碱性磷酸酶活性、异位成骨随重组人骨形态发生蛋白2剂量的增加而升高。结果表明，重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料保证了重组人骨形态发生蛋白2的稳定性，使其不易释放，提高了其异位诱导成骨能力。

ORCID: 0000-0002-5916-6596(刘启省)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 重组人骨形态发生蛋白2, 基因工程, 骨修复材料, 骨缺损, 释放, 异位成骨

Abstract:

BACKGROUND: It has become a hotspot to prepare the bone repair material that exhibits natural bone structure and is used in combination with biological factors.
OBJECTIVE: To prepare the recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2)/bone repair material, and to evaluate its capacities of release, activity and ectopic osteoinduction.
METHODS: A collagen-binding domain was added to the N-terminal of native rhBMP-2 that allowed bind to collagens in the bone repair material. Then, rhBMP-2/bone repair material was obtained through freeze-dried method. The releasing ability of rhBMP-2 in vitro was assayed by ELISA. C2C12 cell lines were loaded to the composite material with 0.25, 0.5 and 1 µg rhBMP-2, respectively. Afterwards, alkaline phosphatase activity was detected at 72 hours. The composite materials with 0, 2, 5 and 10 µg rhBMP-2 were implanted into the quadriceps of Sprague-Dawley rats, respectively. Alkaline phosphatase activity and the newly formed bone were detected at 2 and 4 weeks after implantation. The CY-7-labeled composite material was implanted into the quadriceps of Sprague-Dawley rats to observe its stability.
RESULTS AND CONCLUSION: Substantially no rhBMP-2 from the rhBMP-2/bone repair material was released within 45 days. The alkaline phosphatase activity of C2C12 was in a rise with the increased concentration of rhBMP-2. The stability of the composite material in vivo was better, the alkaline phosphatase activity and ectopic bone formation increased as the concentration of rhBMP-2 rose. To conclude, the rhBMP-2/bone repair material preserves the stability of rhBMP-2, and improves ectopic osteoinduction ability.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words:

Bone Morphogenetic Proteins, Alkaline Phosphatase, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

刘启省，张东刚. 重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料的制备与性能[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(38): 5664-5671.

Liu Qi-sheng, Zhang Dong-gang.

Preparation and properties of recombinant human bone morphogenetic protein-2/ bone repair material

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(38): 5664-5671.

图/表（结果） 8

2.1 重组人BMP-2/骨修复材料体外释放实验使用人BMP-2 ELISA Kit绘制体外释放曲线，见图1。

由图可见，在对照组(天然BMP-2/骨修复材料)中，天然BMP-2在第1天时即出现约60%的总量释放，随后趋于平缓，在第20天时基本释放完全；而重组人BMP-2/骨修复材料则直至第45天时释放浓度均很低，基本没有释放。

2.2 重组人BMP-2/骨修复材料体外活性检测空白对照组和阴性对照组无碱性磷酸酶活性，而样品组及阳性对照组具有明显碱性磷酸酶活性，且样品组的碱性磷酸酶活性随着重组人BMP-2剂量的升高而升高，显示出剂量依赖效应，见图2。

2.3 重组人BMP-2/骨修复材料在大鼠体内的异位诱导成骨情况 A组-D组随着暴露剂量的增加，碱性磷酸酶含量亦明显增加，组间两两比较差异有显著性意义 (P 均< 0.05)。E组注射部位肌肉组织内碱性磷酸酶活性也有所升高，第2周时，与其余4组相比差异有显著性意义(P < 0.05)；第4周时，与A组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，但低于B组、C组、D组(P < 0.01)，见图3。

A组和E组中央区和周边区未见明显新生骨，随着暴露剂量的增加，植入材料内可见大量新生骨组织形成，其骨陷窝内骨细胞明显、骨小梁的表面见成骨细胞，骨髓腔明显(C组、D组表现尤为明显)，呈现出剂量依赖性关系，说明重组人BMP-2/骨修复材料具有明显的异位诱导成骨活性且具有一定的剂量依赖性，见图4。

病理软件统计结果表明，暴露的B组、C组、D组新生骨/总组织面积比值呈剂量依赖性增强，组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)，中央区和周边区无显著差异(P > 0.05)，E组未见明显骨细胞分化，见图5，说明与重组人BMP-2特异性结合的骨修复材料对重组人BMP-2的诱导成骨活性具有延长及放大作用。

2.4 重组人BMP-2/骨修复材料体内稳定性及降解后分布情况活体成像系统检测结果显示，实验组重组人BMP-2在2只大鼠体内均有明显分布(荧光表达)，0-8 h位荧光逐步暴露释放过程，荧光强度呈逐渐增强趋势，8 h后荧光强度逐渐减弱，至10 d仍有较强荧光表达，表达量约为最高荧光强度值(8 h)的23%，见图6，对照组无荧光表达。实验21 d后，实验组埋置部位仍有少量荧光表达，其他部位无明显荧光表达，说明蛋白基本分布在植入部位，没有明显随体液流失；对照组均无荧光表达，见图7，实验21 d时，解剖大鼠，取心、脾、肝、肾、肺、埋植部位肌肉进行检测，对照组均无荧光表达，而实验组在心、肝、脾无荧光标记，肾有极少量荧光标记，肺部亦可见荧光标记，埋植部位仍有少量荧光表达，肾和肺部荧光强度分别约为埋植部位的1.2%和4.7%，见图8，表明埋置21 d后，重组人BMP-2仍大部分集中在埋置部位，说明其体内稳定性较好。

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引言

临床中骨缺损最常用的方法为自体骨移植和异体骨移植，自体骨供体的有限性及供骨区的相关并发症限制了其应用，增加了患者痛苦；而异体骨则具有较大的抗原性，容易产生剧烈的免疫排斥反应，导致植骨失败。因此，寻找和开发能够替代自然骨的人工骨修复材料，成为组织工程领域中一个亟需解决的问题。制备具有与天然骨结构、组分及功能均相似的仿生型骨支架成为骨组织工程中的研究热点^[1]。理想的骨修复材料应接近天然骨，在生物学性能上要求达到：①组织相容性好，置入体内后不产生免疫排斥反应；②有骨传导性：保持了天然骨的三维结构，有利用血管、神经的进入；③有骨诱导性：材料中有利于成骨的生物大分子并在新骨的生成过程中逐步降解^[2-3]。

在已知的生长因子中，骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein2，BMP-2)的成骨作用最强。已有研究证实BMP-2对成骨细胞、软骨细胞的分化及功能具有重要的调节作用^[4-5]，它能跨种诱导未分化间充质干细胞向成骨细胞方向增殖和分化，促进成骨^[6]，使成纤维细胞具有成骨表型^[7-8]。然而，BMP-2在体液中扩散快速，半衰期短，容易酶解，治疗浓度降低快，不能持续刺激靶细胞以充分发挥其诱导活性。而通过提高BMP-2的使用剂量来促进成骨，则会因为剂量太高产生一系列并发症，可能导致组织肿胀、产生炎症，促进不期望的异位骨生成，还可在骨痂内形成囊肿样病变^[9-16]。所以，目前的研究热点是将BMP-2与载体结合，建立稳定的BMP-2释放系统，减少BMP-2的释放以维持植入位点局部浓度，降低并发症的发生率，使BMP-2能够发挥更大的作用^[17]。

中国科学院戴建武等发现一段含7个氨基酸具有胶原靶向结合能力的寡肽，即胶原结合域(collagen- binding domain，CBD)，将胶原结合域通过肽键与BMP-2的N端结合，形成具有胶原靶向结合能力的重组人BMP-2，将重组人BMP-2溶于水与胶原浸泡时，重组人BMP2会通过其胶原结合域的氨基酸侧链与Ⅰ型胶原形成共价键实现结合，构建一种新的重组人BMP-2局部释放系统，实现重组人BMP-2持续缓慢释放^[18-19]。据此，通过基因工程方法制备包含胶原结合域的重组人BMP-2，将具有胶原靶向结合能力的重组人BMP-2与骨修复材料(主要成分为胶原和羟基磷灰石)结合，建立新的重组人BMP-2缓释系统，形成理想的具有骨诱导性的重组人BMP-2/骨修复材料。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计观察对比实验。

1.2 时间及地点实验于2015年10月至2016年1月在同济大学完成。

1.3 材料 C2C12细胞购于中国协和医科大学基础医学所细胞中心。

实验动物：五六周龄雄性SD大鼠，体质量180- 200 g，由山东绿叶制药有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK鲁20090009。

骨修复材料：由烟台正海生物科技股份有限公司提供，商品名海奥®骨修复材料，是已获得SFDA注册批准的Ⅲ类医疗器械，主要成分为胶原蛋白和羟基磷灰石，保留了天然的胶原蛋白成分与骨天然结构，利于吸附内源性生长因子。

主要试剂与仪器：胎牛血清、DMEM高糖培养基(Gibco)；碱性磷酸酶检测试剂盒、人BMP-2 ELISA Kit(sigma)；高压均质机(APV-2000)；离心机(thermo)；415型台式原位灭菌发酵罐(New Brunswick BioFlo)；电子天平(PL202)；超声波细胞粉碎机(JY99-IID)；XHF-D高速分散器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；多功能活体成像系统(FxPro)。

1.4 实验方法

1.4.1 重组人BMP-2/骨修复材料的制备

重组人BMP-2菌种的制备：中科院遗传与发育生物学研究所戴建武博士组完成质粒重组、细菌转化及单克隆筛选等菌种制备工作，提供了能高效表达包含CBD区域的重组人BMP-2菌种。

重组人BMP-2高密度发酵：将工程菌无菌操作划平板37 ℃培养12-18 h，以菌落直径1.0-2.0 mm为宜，用接种环挑选单克隆接种于100 mL含卡那霉素(30 mg/L)的LB培养基中37 ℃振荡培养4 h，作为一级种子液，将培养好的一级种子液接种于300 mL含卡那霉素(30 mg/L)的LB培养基中，37 ℃振荡培养12-18 h，种子A600值应达到4.0-6.0，作为二级种子液。将二级种子液接种到发酵罐中，37 ℃搅拌培养5 h，至A₆₀₀值达到20以上时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，相同条件下继续诱导培养5 h。培养结束后，离心收集菌体。重悬菌体制成菌悬液，分别采用高速分散器、APV均质机、超声波破碎仪等手段重悬、破碎菌体后，低温高速离心收集包涵体。

重组人BMP-2的纯化和复性：将包涵体以1 g包涵体：10 mL溶解液的比例溶解于包涵体裂解液中，高速分散器3 000 r/min剪切3 min，然后在恒温摇床中25 ℃温和振荡6 h，12 000×g高速离心30 min，收集上清液，再经0.45 μm滤膜过滤即为包涵体裂解液。包涵体裂解液分别经过离子交换层析、蛋白复性、肝素亲和层析、凝胶过滤层析等纯化过程得到重组人BMP-2原液，蛋白纯度可达到95%以上。按照《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》对重组人BMP-2原液进行检测，其生物学活性、蛋白质含量、蛋白纯度、分子量、外源性DNA残留量、宿主菌蛋白残留量、残余抗生素活性、细菌内毒素检查、等电点、紫外光谱扫描、肽图、N-末端氨基酸序列均符合规定。

重组人BMP-2/骨修复材料的制备：配制一定量的重组人BMP-2溶液，将其加入预灭菌的骨修复材料(混合比例为5 mL∶1 g)半成品，25 ℃温和震荡孵育2 h，然后再经过冷冻干燥，分装，⁶⁰Co辐照灭菌，即得重组人BMP-2/骨修复材料。

1.4.2 重组人BMP-2/骨修复材料体外释放实验将重组人BMP-2/骨修复材料放置于15 mL的离心管内，加入10 mL PBS(pH=7.4)，37 ℃温和振荡，分别于6 h、1 d、5 d取样，之后每隔5 d取样1次，每次取样200 μL/次，使用人BMP2 ELISA Kit检测洗脱释放情况。绘制重组人BMP-2的累计释放曲线。以CHO表达的天然BMP-2直接滴加的方式制备BMP-2/骨修复材料作为对照，比较两组材料重组人BMP-2释放情况。

1.4.3 重组人BMP-2/骨修复材料的体外活性检测 BMP-2对C2C12细胞具有强烈的转分化作用，可抑制其向肌细胞方向分化转而向成骨细胞方向分化，因此可通过C2C12细胞对重组人BMP-2的活性进行检测。将骨修复材料(空白对照组)、含有一定重组人BMP-2的(0.25，0.5，1 μg/块)重组人BMP-2/骨修复材料(样品组)提前浸泡于DMEM高糖培养基中，37 ℃浸泡4 h。用完全培养基培养C2C12细胞，长至70%-80%的融合度时，将细胞消化，接将消化后的细胞以2×10⁵/块滴加到骨修复材料和重组人BMP-2/骨修复材料上，继续培养72 h后检测碱性磷酸酶活性。阴性对照组为不经过任何处理的C2C12细胞，阳性对照组为向C2C12细胞中加入0.25，0.5，1 μg的重组人BMP-2原液。

1.4.4 重组人BMP-2/骨修复材料在大鼠体内的异位诱导成骨情况及其剂量依赖关系

实验分组及干预：取检疫合格SD大鼠，按体质量随机分5组，每组10只，A-D组植入重组人BMP-2 /骨修复材料，其对应重组人BMP-2的剂量分别为0，2，5，10 μg/块。处理方法为用手术刀在大鼠股四头肌切开约 1 cm长的切口，切开肌肉层后，在肌肉层埋植对应重组人BMP-2 /骨修复材料，两侧埋植，每侧植入1块；E组为肌肉注射组，处理方法为在大鼠股四头肌处注射5 μg BMP-2原液，两侧注射，每侧注射5 μg。

碱性磷酸酶活性测定：术后2，4周每组各处死5只动物，2周时取两侧植入材料，4周时取一侧植入材料(另一侧做切片)，去除周围肌肉组织，称质量并记录，剪碎，加入生理盐水5 mL，匀浆5 000 r/min离心14 min，取上清液，检测碱性磷酸酶活性(U)，再以标本湿质量(mg)为除数，即得碱性磷酸酶的活性(U/mg)。

诱导新骨生长情况：术后4周，取出植入材料，常规组织切片，苏木精-伊红染色，观察材料诱导新骨生长情况等。采用Image-Pro Plus 6.0软件分析新生骨占总组织面积的比值。

1.4.5 重组人BMP-2/骨修复材料的体内稳定性及降解后分布情况

CY-7标记重组人BMP-2/骨修复材料的制备：骨修复材料作为载体，它在体内的稳定性及对重组人BMP-2的缓释是一个关键性因素，花菁染料CY-7是性能优良的荧光标记染料，摩尔吸光系数在荧光染料中是最高的，常被应用于生物分子标记，荧光成像及其他荧光生物分析。在过去几十年间，花菁染料作为一种稳定的光谱敏化剂^[20-23]，被广泛应用于光学成像^[24]、生物医药制药^[25]、非线性光学与激光物理学，特别是单分子检测技术等各种光物理学和光化学研究之中。为了保证系统的灵敏性与特异性，实验采用了再荧光染料中摩尔吸光系数最高的CY-7来标记重组人BMP-2，获得重组人BMP-2标记CY-7荧光染料，每块骨含有25 μg重组人BMP-2。

实验分组干预：取雄性健康SD大鼠，用手术刀在大鼠后肢肌肉窝切开约1 cm长的切口，切开肌肉层后，在肌肉层埋植不含重组人BMP-2骨修复材料的作为对照组，埋置重组人BMP-2/骨修复材料(标记CY-7)的作为实验组，每组2只大鼠。

术后0 h、4 h、8 h、24 h、48 h、72 h、7 d、10 d将两组大鼠麻醉，进行活体荧光，观察蛋白在体内的分布情况。实验第21天，将动物处死，取心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺等脏器进行荧光观察，观察蛋白在各个器官的分布情况，评价复合材料蛋白的缓释情况及体内代谢分布情况。

1.5 主要观察指标重组人BMP-2/骨修复材料的释放、活性及诱导异位成骨的能力。

1.6 统计学分析采用Image-Pro Plus 6.0软件进行t检验和方差分析。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

骨组织形成是一个由多种因素调节的复杂而有序的过程。在细胞水平上看，骨组织形成有两种方式，即膜内成骨和软骨内成骨，前者的新生骨组织在结缔组织膜中由间充质细胞直接形成，后者是指结缔组织内的间充质细胞首先分化为软骨组织，然后钙化成骨。从分子水平上看，骨组织的形成过程就是生物大分子在细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的信息转导过程。在骨组织形成过程中，激素与生长因子调节之间既有相对独立，又相互联系。

一般认为，局部生长因子在骨组织形成的调节过程中起着主导作用。尤其骨形态发生蛋白类是其中惟一能够单独诱导间充质细胞向骨组织方向分化的生长因子，是骨组织形成过程中最关键的调节因子。实验表明，低浓度骨形态发生蛋白类能够诱导间充质细胞向骨组织形成区移行；中等浓度骨形态发生蛋白类可促进间充质细胞向成软骨及成骨细胞方向分化；而高浓度骨形态发生蛋白类则能促进进间充质细胞的增生。

研究认为，BMP-2主要对未分化间充质细胞和骨系细胞起到聚集和分化作用^[26]。在骨形成早期，BMP-2不仅可使未分化间质细胞向骨形成中心聚集并分化为骨细胞，而且可使成纤维细胞、成肌细胞及骨髓基细胞逆转分化为骨细胞。其主要过程是：增加或抑制这些细胞内的某些特异性蛋白的分泌，使成纤维细胞分化为成骨细胞，成肌细胞快速分化为肥大的软骨细胞，并促进基质钙化。对于成骨细胞，BMP-2则可使之维持其特有细胞表型，并诱导成骨细胞标志物的增高，促进细胞外基质钙化。在骨形成后期，BMP-2还作为一种破骨细胞分化因子与其它支持破骨细胞分化因子直接或间接刺激破骨细胞分化，参与骨的重建。在骨组织形成过程中，BMP-2通过自分泌和旁分泌，在细胞及细胞间质之间传导信息，调节细胞的分化和增生^[27-29]。

由于骨缺损的修复是一个相对缓慢的过程，而重组人BMP-2在水相及室温环境下容易失去生物活性，在体内还容易被蛋白酶所酶解，直接使用达不到理想的骨再生效果，因此通过基因工程的方法制备包含胶原结合域的重组人BMP-2，利用含有胶原结合域的rhBMP-2与含有胶原的骨修复材料相结合，制备出负载有效量的重组人BMP-2的重组人BMP-2/骨修复材料。重组人BMP-2/骨修复材料不仅具有良好的生物相容性和力学性能，保持了天然骨的三维多孔隙疏松结构，能使宿主的血管和细胞进入植骨块形成新骨，而且还可以保持重组人BMP-2的生物活性，并实现重组人BMP-2的缓慢释放，能更好地满足创伤、感染、肿瘤及发育异常等原因所导致的骨缺损的修复要求^[30]。

体内外实验表明，重组人BMP-2/骨修复材料在体内外稳定性较好，释放较慢、较长时间内具有较强的骨诱导活性，不仅能显著提高骨损伤的修复能力，同时也显著减少重组人BMP-2的用量，降低了使用风险，将在创伤修复领域特别是骨缺损的修复中发挥巨大作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程