适量循环压应力影响细胞骨架促进关节软骨细胞的合成代谢

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.37.006

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
循环应力：指应力随时间呈周期性的变化具有一定的频率、强度和作用方式的力，在实验中力的周期为2 s、频率为0.5 Hz、强度用硅胶管的形变量衡量为3%和7%、作用方式分为拉伸和压缩。
软骨细胞的合成与分解代谢：反映软骨细胞分泌细胞外基质的能力，正常软骨细胞生长在软骨陷窝中，周围有大量细胞外基质主要包括蛋白多糖、Ⅱ型胶原等，是由软骨分泌，在研究中用蛋白多糖、Ⅰ、Ⅱ型胶原反映合成代谢，用基质金属蛋白酶13反映分解代谢。

摘要
背景：不同的力学刺激可以对软骨细胞的代谢水平产生影响，但其作用方式不明。
目的：研究在压应力和拉应力作用条件下，参与软骨细胞分解与合成代谢基因表达水平的变化。
方法：提取2周龄SD大鼠的关节软骨细胞，对原代软骨细胞进行鉴定。第1代软骨细胞施加应变量为3%和7%的循环拉应力和循环压应力，测定关节软骨细胞相关基因的改变。
结果与结论：当3%的循环拉应力作用于软骨细胞时，其合成代谢基因Ⅰ、Ⅱ型胶原，蛋白多糖 mRNA表达水平均降低；在3%的循环压应力下，蛋白多糖mRNA表达水平升高，Ⅰ型胶原mRNA表达水平降低(P < 0.001)，分解代谢基因基质金属蛋白酶13 mRNA表达水平下降(P < 0.01)；而当应变量达到7%时，循环拉应力和压应力会导致合成代谢相关基因普遍下降，前者还会使分解代谢基因基质金属蛋白酶13 mRNA表达水平升高(P < 0.05)。3%的循环压缩比3%的循环拉伸使细胞骨架更趋向卵圆形。提示在体外，适当的循环压应力有利于维持大鼠关节软骨细胞的生长特性，而小幅度的拉应力即可降低软骨细胞的合成能力，而应力的作用可能是通过改变细胞骨架引起的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-1975-9933(罗宗平)

关键词: 组织构建, 软骨细胞, 循环拉应力, 循环压应力, 关节软骨细胞, 细胞去分化, 细胞骨架, 细胞外基质蛋白, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Different mechanical stimulations may have an effect on the level of metabolism of chondrocytes, but the effect is not clear.
OBJECTIVE: To investigate expression level changes in metabolic genes that participate in cartilage cell decomposition and synthesis under compressive stress and tensile stress conditions.
METHODS: We obtained articular chondrocytes from 2-week-old Sprague-Dawley rats. Primary cultured chondrocytes were identified. Passage one chondrocytes received cyclic tensile stress and cyclic compressive stress of 3% and 7%, respectively, so as to measure articular changes in chondrocytes-related genes.
RESULTS AND CONCLUSION: When chondrocytes were subjected to cyclic tensile stress of 3%, synthetic metabolic gene collagen types I and II and proteoglycan mRNA expression levels were decreased. If 3% cyclic compressive stress was applied, proteoglycan mRNA expression levels were increased, and type I collagen mRNA expression levels were decreased (P < 0.001), and matrix metalloproteinase-13 mRNA expression levels were reduced (P < 0.01). When strain reached 7%, cyclic tensile stress and compressive stress could lead to a general decrease in anabolism-related genes. The former could also make matrix metalloproteinase-13 mRNA expression levels increased (P < 0.05). 3% cyclic compression ratio and 3% cyclic stretch made cytoskeleton become oval. These results indicated that in vitro, proper cyclic compressive stress is beneficial to maintain the growth characteristics of articular chondrocytes in rats. Small tensile stress can decrease the synthesis ability of chondrocytes. The effect of stress may be caused by changing the cytoskeleton.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Chondrocytes, Mechanics, Metabolism, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

莫骏，陈颖，仲冬艳，杨惠林，罗宗平. 适量循环压应力影响细胞骨架促进关节软骨细胞的合成代谢[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.37.006.

Mo Jun, Chen Ying, Zhong Dong-yan, Yang Hui-lin, Luo Zong-ping. Moderate cyclic compressive stress accelerates anabolism of articular chondrocytes by affecting cytoskeleton[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.37.006.

图/表（结果） 1

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引言

材料方法

设计细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点实验于2014年12月至2016年1月在苏州大学附属第一医院南区骨科研究所完成。

1.3 材料健康SPF级雌性SD大鼠5只，鼠龄2周，购自昭衍(苏州)新药研究中心有限公司，许可证号SCXK (苏)2013-0003。

1.4 方法

1.4.1 大鼠软骨干细胞的分离和纯化取2周龄SD大鼠5只，颈椎脱臼处死，打开大鼠肩关节和髋关节关节囊，分离软骨周围软组织，取表层透明软骨放入PBS中备用。将获得的软骨组织移入5 mL的EP管，用小剪刀剪碎至1 mm³，PBS洗。将碎软骨组织块移入6孔板，加入2 mL胰酶(0.25%)消化10 min，吸弃胰酶，PBS洗3次后加2 mLⅡ型胶原酶(2 g/L)消化10 h。消化后的含有软骨组织的混合液经200目滤网过滤，1 000 r/min离心5 min，弃上清，重悬细胞，原代培养软骨细胞。3 d后换液弃去未贴壁细胞及杂质，以后每隔3 d换液^[9]。

大鼠关节软骨细胞体外测试所用试剂和仪器：
试剂及仪器	来源
胰酶、胎牛血清	GIBCO公司
高糖培养基	HyClone公司
Ⅱ型胶原酶、乙醇、氯仿、异丙醇、DAPI、鬼笔环肽、纤连蛋白	Sigma公司
甲苯胺蓝	Biosharp公司
反转录试剂盒	Thermo公司
MTT试剂盒、Gel red	碧云天试剂公司
PCR扩增仪、SYBR GREEN	Bio-Rad公司
倒置相差显微镜及照相系统	Olympus公司
反转录仪	Biometra公司
Trizol	Ambion life technologies公司
等离子体清洗机	铭恒公司
拉伸测试仪	衡翼仪器
医用硅胶管	卡默尔公司

1.4.2 细胞增殖能力的检测将原代软骨细胞接种到96孔板，以每孔5 000个的数量接种，分别于第1，3，7天测量490 nm处的吸光度值。待原代软骨细胞长满后，进行甲苯胺蓝染色、骨架及核染色^[10-11]，观察细胞形态。甲苯胺蓝染色步骤：细胞PBS清洗后，40 g/L的多聚甲醛固定2 h，洗去多聚甲醛，甲苯胺蓝染液染色1 h。骨架染色步骤：细胞PBS清洗，40 g/L多聚甲醛室温固定10 min，清洗，0.1%的Triton X-100处理10 min，清洗，体积分数1%胎牛血清处理背景60 min，1∶100稀释的鬼笔环肽处理40 min，清洗，1∶300稀释的DAPI染色10 min，洗去浮色。

1.4.3 RT-PCR检测将2周的SD大鼠软骨的原代细胞和第1代细胞以200 000/孔的数量接种在6孔板，待扩增至90%的融合度时，收集细胞，测Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA的表达情况。

RT-PCR步骤：细胞中加入1 mL的Trizol裂解 15 min，加入200 μL的氯仿混匀静置15 min。离心，取400 μL上清至另一EP管，加入0.5 mL异丙醇混匀，静置，离心。取沉淀，体积分数75%乙醇纯化后晾干。2 μg的RNA按20 μL的体系一步法反转录，反转录体系包括 4 μL的缓冲液、2 μL的dNTP Mix、1 μL的Oligo(DT)、 1 μL的Ribolock Rnase Inhibitor、1 μL的RevertAid M-Mulv Reverse Transcriptase、11 μL的RNA和水。cDNA按照20 μL的体系进行荧光扩增，其体系为：0.5 μL的上游引物、0.5 μL的下游引物、10 μL的SYBR-green、9 μL的cDNA和水，最后得到循环数Cq值。GAPDH引物序列：上游：5’-AGA CAG CCG CAT CTT CTT GT-3’，下游：5’-TAC TCA GCA CCA GCA TCA CC-3’^[12]。Ⅰ型胶原引物序列：上游：5’-GCC CAG AAG AAT ATG TAT CAC CAG A-3’，下游：5’-GGC CAA CAG GTC CCC TTG-3’^[13]。Ⅱ型胶原引物序列：上游：5’-ATG AGG GCC GAG GGC AAC AG-3’，下游：5’-GAT GTC CAT GGG TGC AAT GTC AA-3’。蛋白多糖引物序列：上游：5’-GAG AGG GGT GAA TGG AAC GAT GTC-3’，下游：5’-ATC TTT CTT CTG CCC AAG GGT TCT G-3’。基质金属蛋白酶13引物序列：上游：5’-CAT ACG AGC ATC CAT CCC GAG AC-3’，下游：5’-CTC AAA GTG AAC CGC AGC ACT GAG-3’^[14]。RT-PCR结果为循环数Cq值，将实验组与对照组的Cq值按2^-^??Ct转换，结果表示为mRNA的相对倍数。

1.4.4 应力刺激对第1代软骨细胞的影响剪取6根直径12 mm、厚2 mm、长72.5 mm的医用硅胶管，并在管的正上方剪0.5 cm²的小孔，将硅胶管清洗干净并晾干，放入等离子清洗机处理5 min，然后取出管放入超声清洗机中清洗1 h，放入体积分数75%乙醇中处理1周，取出硅胶管在超净台中晾干，安装在力学测试用架子上，正上方的小孔用透气膜密闭，并加入纤连蛋白孵育3 h。

将第1代软骨细胞按200 000/根的数量接种到表面经等离子清洗和纤连蛋白预处理的硅胶管中，其中2根给予0.5 Hz、3%、2 h/d、3 d的循环拉应力刺激；2根给予0.5 Hz、3%、2 h/d、3 d的循环压应力刺激；剩余2根作为对照。收集细胞测定基因Ⅰ、Ⅱ型胶原、蛋白多糖、基质金属蛋白酶13的mRNA水平，并对扩增产物cDNA进行琼脂糖凝胶电泳。将应变量改为7%，重复以上步骤(图1)。其中，3%的循环压和拉应力模拟小幅的应力刺激，7%的循环压和拉应力模拟大幅过度的应力刺激。

1.5 主要观察指标 ①原代软骨细胞增殖活性及染色后形态；②2周龄原代及第1代软骨细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原的mRNA水平；③循环拉/压应力作用下软骨细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原、蛋白多糖和基质金属蛋白酶13 mRNA的表达水平；④应力作用后细胞骨架的形态改变

1.6 统计学分析数据以x(_)±s表示，采用SPSS 16.0软件进行分析，对结果使用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验，P < 0.05差异有显著性意义。

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讨论

关节软骨分为3层：储备层，生发层与肥大层。储备层比生发层和肥大层胶原更多，3层蛋白多糖和水的含量也有略微差异。这种分布很可能与软骨细胞的力学感应是相关的，许多软骨细胞的体外力学实验可以解释这些现象^[15-16]。

实验过程的第一步是获取去分化之前的软骨细胞。许多文献研究表明，随着软骨细胞的传代，软骨细胞会发生去分化现象^[17-18]，Ⅰ型胶原mRNA表达水平会反超Ⅱ型胶原的表达，而正常情况下，软骨细胞Ⅱ型胶原的表达是远高于Ⅰ型胶原的。因此在对软骨细胞进行体外实验时应该选用早期代数的软骨细胞。虽然去分化现象可以通过加入细胞因子，如转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2等来延缓^[19-21]，但是此时的软骨细胞或多或少已经产生了变化。在实验中采用从SD大鼠中提取的第1代关节软骨细胞作为实验对象，经RT-PCR检测Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA的表达水平，并结合甲苯胺蓝染色、骨架及核染色进行形态学观察鉴定，同时检测原代软骨细胞的增殖活性，以保证获得的软骨细胞具有良好的软骨特性及活性。

文献记载了许多对细胞进行拉伸试验的装置，其中以Flexercell Strain Unit (FX-4000™，Flexercell International Corp.)为代表，其基本原理是负压牵引，通过调节由膜密闭的空间内的压力使细胞黏附的膜发生拉伸，实现对细胞的拉伸。实验中的拉伸装置是由生物力学测试仪基础上改造过来的，力通过传动结构先牵引螺丝，后拉伸细胞黏附的硅胶管。该装置最大的优势是能够同时对细胞进行拉伸与压缩测试并调节其应变量：细胞的拉伸是待细胞长满硅胶管之后，拉伸硅胶膜实现的；细胞的压缩是将细胞接种在提前拉伸到原长的103%的硅胶膜上，待细胞完全融合后，只需让拉伸的管子恢复原长，细胞便处于压缩态下。

为了使黏附在硅胶管上的软骨细胞贴附牢固，硅胶管要进行特殊的处理。通常的方法是用特定的细胞外基质蛋白处理，一般选择Ⅰ型胶原和纤连蛋白^[22-23]。实验发现使用纤连蛋白或者Ⅰ型胶原处理的管子虽然更能促进细胞贴附，但其贴附强度依旧不够。所以作者在用细胞外基质蛋白对硅胶管预处理之前，先对其表面进行等离子处理^[24]。这种处理可以使介质表面羟基化，更有利于培养液及细胞的铺展。

实验选取2种应力和2个幅度施加于软骨细胞，测定合成代谢基因Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、蛋白多糖与分解代谢基因基质金属蛋白酶13。其中，Ⅰ、Ⅱ型胶原有很好的弹性可以抵抗张力，蛋白多糖通过水分的抽吸来抵抗渗透压力，基质金属蛋白酶的主要功能是降解细胞外基质中的蛋白成分包括胶原和蛋白多糖^[25]。Chen等^[26]发现小幅的循环拉应力可以通过组蛋白的脱乙酰化促进Ⅱ型胶原和蛋白多糖合成；余晓明发现短期的循环压应力可以影响细胞骨架促进细胞蛋白多糖的合成^[27]。3%和7%的应变量分别模拟小幅和过度应力作用对软骨细胞的影响^[28-29]。较小的循环压缩应变有利于维持甚至促进软骨细胞的合成能力，而应变力增加时，对软骨细胞的表达系统产生了影响，抑制了软骨细胞的合成能力；循环拉伸应变，不管幅度的大小，对软骨细胞的合成能力都具有抑制作用。基质金属蛋白酶13基因在应力作用下与合成代谢相关基因的表达表现出相反的趋势。已经有大量的实验测试了不同拉伸作用时间的循环拉应力及压应力对软骨细胞的影响，但相关报导的结果不尽相同。软骨细胞在7%的应变下，即使作用6 h也可能促进软骨合成代谢基因的表达^[30]。但可以肯定的是，适度的循环压应力确实有利于维持软骨细胞的特性，促进软骨细胞蛋白多糖的合成^[31-33]，其影响主要是通过影响细胞骨架实现的。这项研究不仅可以增加对应力可能参与的骨关节炎的认识，同时也可以为未来软骨生物反应器的研发提供一点参考。

文章从细胞基因水平表明，力学刺激可以对软骨细胞的合成与分解代谢产生影响，适当的压应力有利于维持软骨细胞的合成代谢能力，而拉应力对软骨细胞的影响主要是负面的，而应力对细胞代谢的影响是通过改变细胞骨架引起的。后续的实验研究将测定其他应力刺激强度和持续时间对软骨细胞代谢水平的影响，并进一步探讨其机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程