周期性张应力作用下软骨细胞半胱氨酸蛋白酶12的表达规律

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.29.011

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (29): 4334-4340.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.29.011

• 软骨组织构建 cartilage tissue construction • 上一篇下一篇

周期性张应力作用下软骨细胞半胱氨酸蛋白酶12的表达规律

陈著科，李晓飞，张海宁

青岛大学附属医院关节外科，山东省青岛市 266000

收稿日期:2016-04-20 出版日期:2016-07-08 发布日期:2016-07-08
通讯作者: 张海宁，青岛大学附属医院关节外科，山东省青岛市 266000
作者简介:陈著科，男，1987年生，山东省邹城市人，汉族，2016年青岛大学医学部毕业，硕士，主要从事关节疾病防治研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81272056)

Effects of cyclic tensile stress on caspase-12 expression in chondrocytes

Chen Zhu-ke, Li Xiao-fei, Zhang Hai-ning

Department of Joint Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266000, Shandong Province, China

Received:2016-04-20 Online:2016-07-08 Published:2016-07-08
Contact: Zhang Hai-ning, Department of Joint Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266000, Shandong Province, China
About author:Chen Zhu-ke, Master, Department of Joint Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266000, Shandong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81272056

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
周期性张应力：在软骨细胞培养至第3代时，消化传代至6孔BioFlex特制细胞培养皿中继续培养48 h待用，将实验细胞置于多通道张应力加载系统内，施加周期为6 s(一个周期包括3 s受力和3 s放松)，拉伸率为20%，10次/min的力，同时设计不受力对照组，分别标记后待受力2，12，24，36，48 h时观察并收集相对应时间点的细胞待用。
半胱氨酸蛋白酶12：半胱蛋白酶是一组具有相似的氨基酸顺序、二级结构的半胱氨酸蛋白酶,与真核细胞凋亡密切相关，人体中现已发现11种，人的半胱氨酸蛋白酶12是近来被发现的，属于凋亡效应组，是内质网应激诱导细胞凋亡的所必需的，位于内质网外表面，利于其与通路的其他效应分子结合。

摘要
背景：过度力学刺激可引起细胞内质网应激，内质网应激在退行性疾病的发生发展过程中扮演重要角色，半胱氨酸蛋白酶12是内质网应激的特异性分子，内质网应激的强弱程度可由半胱氨酸蛋白酶12表达水平来体现。
目的：观察周期性张应力作用下软骨细胞半胱氨酸蛋白酶12的表达规律。
方法：以人软骨细胞为实验对象，对实验细胞成功分组后，运用细胞牵张力学加载系统，将加力组及其配对的相应Z-ATAD-FMK抑制剂组分别给予2，12，24，36，48 h的力学刺激条件，空白组(0 h)及其配对的Z-ATAD-FMK抑制剂组除不加力外培养条件和加力组完全相同。规定加力时间终止后，显微镜下观察细胞形态变化及生长状态，随即采用RT-PCR和Western blot检测各组半胱氨酸蛋白酶12基因和蛋白表达变化规律。
结果与结论：①细胞形态学观察结果显示，从加力2 h开始，细胞出现凋亡，到24 h此现象最明显，随着加力时间延长，细胞出现顺应力生长趋势，但细胞凋亡现象减弱。说明周期张应力可以使软骨细胞凋亡，内质网应激可能被激活，细胞体外受力模型建立成功；②半胱氨酸蛋白酶12基因与蛋白随时间延长表达趋势一致，加力24 h表达量达高峰，与空白和抑制剂组相比，差异均有显著性意义(P < 0.05)；③以此得出，周期性张应力可引起软骨细胞内质网应激，并影响半胱氨酸蛋白酶12表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-9765-1154(陈著科)

关键词: 组织构建, 软骨细胞, 周期性张应力, 内质网应激, 半胱氨酸蛋白酶12, 牵张力学, RT-PCR, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Excessive mechanical stimulation can lead to endoplasmic reticulum stress. Endoplasmic reticulum stress plays an important role in the occurrence and development of degenerative diseases. Caspase-12 is a specific molecule of endoplasmic reticulum stress, and the intensity of endoplasmic reticulum stress can be reflected by caspase-12 expression.
OBJECTIVE: To observe the expression rule of Caspase-12 in chondrocytes under the cyclic tensile stress.
METHODS: Human chondrocytes were used as test subjects. After group assignment, mechanical loading system was used. The loading group and corresponding Z-ATAD-FMK inhibitor group received 2, 12, 24, 36, and 48 hours of mechanical stimulation. The blank group (0 hour) and the paired Z-ATAD-FMK inhibitor group received the same process as the loading group except the loading. After loading, cell morphology and growth were observed under the microscope. RT-PCR and western blot assay were used to detect the expression changes of caspase-12 gene and protein in each group.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Morphological observation results demonstrated that apoptosis appeared at 2 hours after loading, peaked at 24 hours. With prolonged time, cell growth showed the trend along stress, but apoptosis weakened. It is indicated that cyclic tensile stress could make chondrocyte apoptosis. Endoplasmic reticulum stress might be activated. The model of cells in vitro was established successfully. (2) Caspase-12 gene and protein expression showed consistent trend, and peaked at 24 hours, which showed significant differences as compared with the blank and inhibitor groups (P < 0.05). (3) Cyclic tensile stress can induce chondrocyte endoplasmic reticulum stress, and affect caspase-12 expression.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Chondrocytes, Endoplasmic Reticulum, Cysteine Proteases, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

陈著科，李晓飞，张海宁. 周期性张应力作用下软骨细胞半胱氨酸蛋白酶12的表达规律[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(29): 4334-4340.

Chen Zhu-ke, Li Xiao-fei, Zhang Hai-ning. Effects of cyclic tensile stress on caspase-12 expression in chondrocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(29): 4334-4340.

图/表（结果） 1

2.1 加力细胞光镜下形态正常细胞呈多角形，形态不规则，空白组(0 h)多此特征。从加力2 h开始，细胞开始不同程度脱落，边缘模糊变圆钝，体积缩小，形态结构不清，细胞出现凋亡(细胞体积变小，染色质浓缩，染色质边集)，到24 h此现象最明显，随着加力时

间延长，细胞出现顺应力生长趋势，但细胞凋亡现象减弱(图1)，提示周期张应力可以使软骨细胞凋亡，内质网应激可能被激活，实验模型建立成功。

2.2 周期性张应力作用下半胱氨酸蛋白酶12基因表达空白组(0 h)中并非没有半胱氨酸蛋白酶12表达，从2 h表达量开始升高，到24 h表达量达到峰值，加力时间24 h后，表达量递减，加力组与空白组(0 h)对比差异均有显著性意义。加力组中的抑制剂对半胱氨酸蛋白酶12的表达有明显抑制，但没有完全被抑制，空白组(0 h)与抑制剂组表达量上相当(图2)，说明周期性张应力可促使细胞表达半胱氨酸蛋白酶12相关基因。不可否认的是，细胞受力同时也发生不同程度的内质网应激，值得一提的是Z-ATAD-FMK对半胱氨酸蛋白酶12具有特异性抑制作用，但不同时间段内其抑制程度差别原因有待进一步研究。

2.3 周期性张应力对半胱氨酸蛋白酶12蛋白表达的影响在张应力作用下，随着加力时间的延长，加力24 h蛋白表达量最高，越过峰值后，表达量再次趋减，和半胱氨酸蛋白酶12基因表达规律相似。在蛋白表达方面，加力组与空白组差异有显著性意义，同样，Z-ATAD-FMK对其蛋白表达也有不同程度的抑制(图3，4)，表明蛋白是基因表达的结果，力学刺激对半胱氨酸蛋白酶12的表达有着重要影响，内质网应激同样也是半胱氨酸蛋白酶12蛋白产生的原因。

综上结果，细胞在周期性力学因素影响下，软骨细胞可发生内质网应激反应，在促使半胱氨酸蛋白酶12的表达发生变化的同时，也同样导致了细胞不同程度的凋亡。

参考文献

[1] 康思宁,刘强. 骨关节炎病理过程与关节软骨特性的改变[J]. 中华关节外科杂志(电子版),2007,1(4):275-278.
[2] 贾萍萍. 钙网蛋白调控的Ca~(2+)信号途径在应力介导成肌细胞凋亡中的作用及机制研究[D].青岛大学,2013.
[3] Guilak F. Biomechanical factors in osteoarthritis. Best Pract Res Clin Rheumatol.2011;25(6):815-823.
[4] Lee HJ, Lee SH, Park SH, et al. Purification of catalytically active caspase-12 and its biochemical characterization. Arch Biochem Biophys. 2010;502(1): 68-73.
[5] Fan J, Long H, Li Y, et al. Edaravone protects against glutamate-induced PERK/EIF2alpha/ATF4 integrated stress response and activation of caspase-12. Brain Res. 2013;1519:1-8.
[6] Liu Y, Wang J, Qi SY, et al. Reduced endoplasmic reticulum stress might alter the course of heart failure via caspase-12 and JNK pathways. Can J Cardiol. 2014;30(3):368-375.
[7] Wang X, Qian YJ, Zhou Q, et al. Caspase-12 silencing attenuates inhibitory effects of cigarette smoke extract on NOD1 signaling and hBDs expression in human oral mucosal epithelial cells. PLoS One. 2014;9(12):e115053.
[8] Zhang YH, Zhao CQ, Jiang LS, et al. Cyclic stretch-induced apoptosis in rat annulus fibrosus cells is mediated in part by endoplasmic reticulum stress through nitric oxide production. Eur Spine J. 2011;20(8): 1233-1243.
[9] 马光斌,陆伦根. 内质网应激的细胞效应分子机制[J]. 生命科学,2012,24(3):287-291.
[10] Kimura M,Ichimura S,Sasaki K,et al. Endoplasmic reticulum stress-mediated apoptosis contributes to a skeletal dysplasia resembling platyspondylic lethal skeletal dysplasia, Torrance type, in a novel Col2a1 mutant mouse line. Biochem Biophys Res Commun. 2015;468(1-2):86-91.
[11] Kyathanahalli C,Organ K,Moreci RS,et al. Uterine endoplasmic reticulum stress-unfolded protein response regulation of gestational length is caspase-3 and -7-dependent. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015; 112(45):14090-14095.
[12] Cao YP, Hao YM, Liu QJ,et al. The relationship between endoplasmic reticulum stress and its particular apoptosis way caspase-12 and apoptosis in renal cortex of diabetic rats. Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi. 2011;27(2):236-240.
[13] Xu L, Han F, Mandal A, et al. Diazoxide attenuates hypothermic preservation-induced renal injury via down-regulation of CHOP and caspase-12. Nephrol Dial Transplant. 2010;25(12):3859-3867.
[14] Mao JF, Huang BK, Sun Z, et al. Effects of lipopolysaccharide and dexamethasone on the expression of Kisspeptin/GPR54 in mouse hypothalamus. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2016;96(11): 897-900.
[15] Kosuge Y, Miyagishi H, Shinomiya T, et al. Characterization of Motor Neuron Prostaglandin E2 EP3 Receptor Isoform in a Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Biol Pharm Bull. 2015; 38(12):1964-1968.
[16] 娄鹏程,王海萍,李光乾,等. Z-ATAD-FMK预处理对癫痫持续状态后大鼠海马Caspase-12表达的影响和神经元的保护作用[J].温州医学院学报,2011,41(5):446-450.
[17] Wang QL, Zhao L, Feng N, et al. Lacidipine attenuates TNF-alpha-induced cardiomyocyte apoptosis. Cytokine. 2015;71(1):60-65.
[18] 孙晓雷,赵斌,马信龙,等.循环牵张应力对人骨关节炎软骨细胞增殖的影响[J].天津医药,2013,41(11):1073-1075.
[19] 刘文,王燕,宋玲,等.周期性张应力促进兔髁状突软骨细胞的增殖[J].中国组织工程研究,2014,18(20):3144-3148.
[20] 李尚志,刘海春,武文亮,等.机械应力作用下促进骨不连愈合的疗效[J]. 山东大学学报(医学版),2015,53(2):22-26.
[21] 方航,张荣凯,陈郁鲜,等.机械应力相关基因在骨关节炎软骨下骨的表达[J].中国组织工程研究,2013,17(22): 4084-4090.
[22] Rutkowski DT, Arnold SM, Miller CN, et al. Adaptation to ER stress is mediated by differential stabilities of pro-survival and pro-apoptotic mRNAs and proteins. PLoS Biol. 2006;4(11):e374.
[23] Roberson EC, Tully JE, Guala AS, et al. Influenza induces endoplasmic reticulum stress, caspase-12-dependent apoptosis, and c-Jun N-terminal kinase-mediated transforming growth factor-beta release in lung epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 2012;46(5):573-581.
[24] Zhang Q, Liu J, Chen S, et al. Caspase-12 is involved in stretch-induced apoptosis mediated endoplasmic reticulum stress. Apoptosis. 2016;21(4):432-442.

引言

骨关节炎是由于机械性和生物性的多种因素共同作用后导致的软骨细胞、细胞外基质成分以及软骨下骨的降解和合成动态平衡系统被破坏的全关节性疾病，机械性和生物性的因素在骨性关节炎的发生发展中占剧了重要的位置，其他各种原因也都是最终归咎于这两个决定性的因素发挥作用的^[1]。软骨细胞是软骨的唯一细胞成分，周期性张应力对软骨细胞的生物特性有重要影响，同时又与软骨细胞的生理功能密切相关。周期性张应力不仅可以使软骨细胞产生形变，还可影响细胞内蛋白和离子浓度特别是Ca²⁺浓度变化^[2]。Guilak等^[3]使用微吸技术使软骨细胞形变后，发现细胞内Ca²⁺浓度明显增加，而Ca²⁺又将是启动内质网应激的重要信使。

半胱氨酸蛋白酶12是近年在细胞程序化死亡的研究中被发现，迄今为止，半胱氨酸蛋白酶家族共有14种蛋白被证实存在，其中半胱氨酸蛋白酶12是其家族中的不可或缺的重要成员，是参与细胞凋亡的效应因子^[4]。正常细胞内，半胱氨酸蛋白酶12都是非活性形式存在，只有当细胞内环境遭受重大刺激造成紊乱后，其活性才得以激活并发挥作用^[5-6]。其中内质网应激是细胞对外刺激的紧急反应，其重要作用是决定细胞的结局如抵抗、适应以及凋亡。内质网应激效应表现为诱导内质网内的应激蛋白表达，半胱氨酸蛋白酶12的激活是内质网应激的特异途径，而非内质网应激介导的无半胱氨酸蛋白酶12活化^[7]。

近年来，半胱氨酸蛋白酶12的研究主要集中在胰腺、心肌及神经元细胞，但在软骨细胞研究甚少。Z-ATAD-FMK是半胱氨酸蛋白酶12的特异性抑制剂，具有很好的细胞膜通透性，可选择性抑制半胱氨酸蛋白酶12的活性。

实验以软骨细胞为实验基础，借助应力加载系统对软骨细胞施以最易引起内质网应激的力学刺激^[8]，观察半胱氨酸蛋白酶12在不同应力时间下的表达变化，从而揭示周期性张应力与半胱氨酸蛋白酶12表达的关系。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外对比观察实验。

1.2 时间及地点于2015年4至11月在青岛大学附属医院中心实验室完成。

1.3 材料

实验细胞：实验用软骨细胞全部来自青岛大学附属医院关节外科全膝关节置换患者，年龄(44.0±11.6)岁，男5例，女9例。所有患者均已签署知情同意书，实验方案经青岛大学附属医院伦理委员会批准。

人软骨细胞与周期性力学关系实验的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
DMEM低糖培养液、胎牛血清	Hyclone公司，美国
0.25%胰蛋白酶、青/链霉素	Sigma公司，美国
BioFlex 6孔培养板	Flexcell 公司，美国
半胱氨酸蛋白酶12兔抗人抗体	Immunoway公司，美国
HRP标记的山羊抗兔IgG	康为世纪，北京
鼠抗β-actin单克隆抗体辣根酶标记山羊抗小鼠IgG	中杉金桥，北京
Trizol试剂盒、RT-PCR试剂盒	Takara，日本
Bio-rad凝胶成像系统	Biorad 公司，美国

1.4 实验方法

人软骨细胞的分离和培养：全膝关节置换术中切取表面光滑、有光泽软骨组织，剪碎约1 mm³大小，加入胰蛋白酶后37 ℃水浴震荡消化30 min，再加入0.2%Ⅱ型胶原酶于37 ℃环境消化4 h，离心取沉淀加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于体积分数5%CO₂、 37 ℃培养箱中培养。细胞融合度达到80%-90%用胰蛋白酶消化细胞，按1∶2比例进行传代接种培养。

建立周期性张应力细胞加载模型：取生长完好的软骨细胞接种至BioFlex 6孔培养板上，各孔2 mL含体积分数10%胎牛血清DMEM培养液的6个培养板在原来条件不变情况下等量加入10 μg的Z-ATAD-FMK，置于培养箱中培养24 h。细胞分为空白组(0 h)、加力组(2，12，24，36，48 h)，每组都有相应Z-ATAD-FMK抑制剂组与其配对，待融合至80%时，将BioFlex 6孔细胞培养板全部置于细胞加力仪中受力：周期为6 s(一个周期包括3 s受力和3 s放松)，拉伸率为20%，同时受力环境为体积分数5%CO₂、37 ℃培养箱中，各组同时种板，空白组不做受力处理，严格标记每组的受力时间。加力时间满足后分别收集细胞待用。

RT-PCR检测半胱氨酸蛋白酶12基因表达：待加力组细胞满足加力时间后，将各组细胞同时提取总RNA，纯度检测后反转录试剂盒合成cDNA，见表1。反转录体系为37 ℃、15 min；85 ℃，5 s，再PCR检测。PCR反应体系：95 ℃、5 min，1个循环；95 ℃、30 s，40个循环；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，65 ℃、1 min，利用LightCycler®480 System分析标准曲线。实验数据采用软件GraphPad 5.0进行分析得出结果。

表1 各基因序列

Table 1 Each gene sequence

基因名称	基因序列
GAPDH 半胱氨酸蛋白酶12	正义链：5’-TAT GAC AAC TCC CTC AAG AT-3’ 反义链：5’-GAT CCA CAA CGG ATA CAT T-3’ 正义链：5’-AAT GGA ATC TGT GGG ACC AA-3’ 反义链：5’-GAA CCA AAC AAT CCC AGC AC-3’

Western Blot检测半胱氨酸蛋白酶12蛋白表达：待加力组细胞满足加力时间后，将各组软骨细胞用PBS冲洗3次后，按每板300 μL预先配制好的RIPA裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)裂解细胞，冰上裂解1 h后刮取收集总蛋白并测定总蛋白浓度，加入SDS上样缓冲液(RIPA∶SDS=4∶1)金属浴变性后凝胶电泳，电转移至硝酸纤维素膜上，10%脱脂牛奶封闭摇床2 h，5%脱脂牛奶中加兔抗人半胱氨酸蛋白酶12抗体(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，再与山羊抗兔IgG室温下孵育90 min，同样T-PBS冲洗3次，10 min/次，经Bio-rad凝胶成像系统显影后采集图像。

1.5 主要观察指标 ①细胞加力后形态学变化；②周期性张应力作用下半胱氨酸蛋白酶12基因表达情况；③周期性张应力作用下半胱氨酸蛋白酶12蛋白表达情况。

1.6 统计学分析实验数据采用SPSS 17.0统计软件处理，实验结果以x(_)±s表示，RT-PCR和Western Blotting数据行配对t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

软骨细胞直接影响关节软骨的生理功能，在对维持关节软骨和软骨基质的动态平衡稳定占据重要地位。软骨细胞对机械牵张力非常敏感，在有外界机械应力影响下，软骨细胞的渗透压环境会发生改变，细胞处于相对缺氧状态，软骨细胞则通过自身内质网应激调整自身状态稳定，内质网应激通过影响细胞功能对机械张应力性质大小做出生理或病理性反应^[9]。

内质网是细胞内钙离子和蛋白质翻译合成的重要场所，研究证明过度力学刺激可引起细胞内Ca²⁺稳态失衡和蛋白质发生错误折叠^[10]，这种亚细胞器的病理状态称为内质网应激。在有机械压力的情况下，内质网的内环境被破坏，蛋白质的加工受损，这导致错误折叠蛋白不断积累的应激反应，即未折叠蛋白反应。未折叠蛋白反应可以恢复内质网状态平衡，异或激活细胞自身促凋亡途径发生凋亡，这两种状况主要取决于细胞所受压力的强度大小和持续时间长短以以及细胞的种类。内质网应激介导的细胞调亡死亡受体和线粒体介导的调亡途径不同，近年来研究发现，内质网应激与多种疾病的发生、发展及治疗密切相关。内质网应激并非百害无一利，在作为细胞损伤机制的同时，同时也是细胞抵抗应激的重要举措^[11]，一定程度的内质网应激可以上调分子伴侣表达对抗应激，如果此反应能力较低则会增加细胞对刺激损伤的敏感性，但如应激过强，保护机制也失效，半胱氨酸蛋白酶12才得以被激活^[12]。

半胱氨酸蛋白酶12作为内质网应激的特异性分子，其激活条件是内质网应激的结果，半胱氨酸蛋白酶12的表达和内质网应激出现的时机并非具有时效性，Xu等^[13]报道内质网应激导致了GRP78-前半胱氨酸蛋白酶12-前半胱氨酸蛋白酶7复合物的形成，过度应激使复合物裂解，最终释放了活性半胱氨酸蛋白酶12，激活下游的凋亡效应因子促使细胞凋亡。Mao等^[1⁴^]研究中用去甲肾上腺素导致的PC12细胞凋亡发现Z-ATAD-FMK能显著减少半胱氨酸蛋白酶12的表达并缓解细胞的凋亡；Kosuge等^[15]在大鼠海马脑片培养时，应用了Z-ATAD-FMK处理的海马细胞发现可以减轻衣霉素介导的细胞凋亡。Z-ATAD-FMK是一种半胱氨酸蛋白酶12选择性不可逆抑制剂，具有良好的细胞通透性，选择性阻断半胱氨酸蛋白酶12活性作用^[16]，抑制剂主要是基于半胱氨酸蛋白酶12底物的切割位点的特异性，连接化学基团从而达到抑制效果，但此种抑制属于竞争性抑制，故不会改变半胱氨酸蛋白酶12的结构^[17]。

实验通过软骨细胞体外培养技术，利用力学加载系统以引发细胞发生内质网应激为中介，根据半胱氨酸蛋白酶12表达情况来揭示力学加载时间长短对其表达是否具有影响。

实验运用RT-PCR与western blot技术检测周期性张应力作用下半胱氨酸蛋白酶12表达变化，初步结论显示了周期性张应力与内质网应激激活半胱氨酸蛋白酶12表达的关系。结果显示，不同张应力刺激下细胞出现不同程度凋亡现象，在达到顶峰前，伴随时间的延长凋亡越来越明显，该迹象表明周期性张应力引起了细胞凋亡并伴随时间依赖趋势，凋亡峰值过后，凋亡现象出现反时间依赖趋势，凋亡并非继续加强，而是出现平稳下降，此结果暗示细胞自身在被应激损伤的同时也在积极应对应激，从侧面也反映出周期性张应力也可使细胞出现增殖。

由内质网应激引起的未折叠蛋白反应，首先可通过减缓或暂停蛋白合成或释放改善细胞生理状态，当细胞无法承受外界的巨大应激原时，内质网则通过凋亡通路消除受损又不能修复的细胞。有体外实验表明，压力作用时间在24 h以内时，软骨细胞的增殖活性趋势是随力量大小逐渐增高；超过24 h以后，软骨细胞增殖活性趋势逐渐下降，DNA的表达同时也被明显抑制^[18^-^19]。

半胱氨酸蛋白酶12作为内质网应激的特异产物，表达量的高低不仅能直接说明周期性张应力可引起细胞内质网应激，也可间接反映内质网应激的强弱程度，在达到24 h峰值过程中表达量稳步升高，说明细胞在应力刺激下内质网应激越来越剧烈，期间细胞个体也因此不同程度凋亡，在遭受重创之后，细胞本能做出应激反应，如上调内质网分子伴侣等保护机制，也可以增值形式替补损伤或凋亡的细胞^[20^-^21]，加力24 h之后的半胱氨酸蛋白酶12表达趋势则是这种保护措施的最好解释。

Z-ATAD-FMK为半胱氨酸蛋白酶12的竞争性抑制剂，在不改变酶结构的前提下对半胱氨酸蛋白酶12产生竞争性抑制。实验结果中半胱氨酸蛋白酶12特异性抑制剂Z-ATAD-FMK对加力组抑制效应并不完全，有学者推论，人体中半胱氨酸蛋白酶12与半胱氨酸蛋白酶4结构功能存在某些相似基团，半胱氨酸蛋白酶4可能参与了代替半胱氨酸蛋白酶12的凋亡信号调节，而不被完全抑制的部分可能是半胱氨酸蛋白酶4的相似基团^[22]，因此，虽然细胞中的半胱氨酸蛋白酶12被完全抑制，但和其相似的基团的基因和蛋白仍然表达，造成了结果的假象。作者此次实验中半胱氨酸蛋白酶12虽被抑制，但内质网应激仍然存在，半胱氨酸蛋白酶12介导的凋亡途径中可能存在其他未知的通路。有趣的是，在空白组(0 h)中半胱氨酸蛋白酶12居然也有少量表达，原因可能是周期性张应力只是加速了半胱氨酸蛋白酶12的表达，正常细胞本身就产生该蛋白酶介导凋亡^[23-24]。但空白组(0 h)抑制剂作用微乎其微，关于是否抑制剂存在抑制有效应阈值的问题有待进一步探究。

通过实验结果不难发现，持续周期性张应力不但激发软骨细胞内质网应激，侧重于半胱氨酸蛋白酶12表达量方面来看，应力对内质网应激的强弱程度也有深刻影响。因此作者此次研究结果表明，周期性张应力可引发软骨细胞内质网应激，并影响半胱氨酸蛋白酶12表达，可根据半胱氨酸蛋白酶12表达量直接反应内质网应激程度，在细胞表现最大应激能力后，逐渐调整细胞状态使内质网功能渐趋平稳，Z-ATAD-FMK对半胱氨酸蛋白酶12的产生有明显抑制作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

周期性张应力作用下软骨细胞半胱氨酸蛋白酶12的表达规律

Effects of cyclic tensile stress on caspase-12 expression in chondrocytes

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 1

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	刘翔翔, 黄云梅, 陈文列, 林如辉, 卢小冬, 李钻芳, 许亚晔, 黄美雅, 李西海. 早期骨关节炎模型大鼠半月板白区细胞的超微结构变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1237-1242.
[2]	谢崇新, 张磊. 保留与不保留残端重建前交叉韧带术后膝关节退变的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 735-740.
[3]	邓桢翰, 黄勇, 肖璐璐, 陈昱霖, 朱伟民, 陆伟, 王大平. 骨形态发生蛋白在关节软骨再生过程中的作用与应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 798-806.
[4]	马泽涛, 曾晖, 王德利, 翁鉴, 冯松. 微小RNA-138-5p与软骨细胞增殖和自噬的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 674-678.
[5]	童洁, 廖瑛, 陈政宇, 孙光华. 骨关节炎软骨细胞自噬及丝裂原活化蛋白激酶信号通路的调控[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3246-3251.
[6]	余成帅, 杜刚, 庞慎宁, 劳山. 促炎脂肪因子Chemerin促进一氧化氮表达调节软骨细胞的增殖与代谢[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 258-263.
[7]	马笃军, 彭力平, 陈锋, 蒋顺琬, 姜劲挺, 高坤, 林展鹏. 基因编辑技术在骨关节炎基因治疗中的作用与意义[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 298-303.
[8]	张为, 崔帅帅, 周志超, 胡小华, 杨晓红. 微小RNA调控组蛋白去乙酰化酶治疗骨相关疾病的发展现状[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2767-2774.
[9]	吴钰坤, 韩杰, 温帅波. 骨折愈合过程中Runx2基因的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(14): 2274-2279.
[10]	张云青, 王健, 阳春华, 李聪. miR-335-5p靶向程序化细胞死亡基因5对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(14): 2142-2147.
[11]	杨帆, 刘保一, 刘家河, 杨佳慧, 覃开蓉, 赵德伟. 体外培养SD大鼠关节软骨细胞原代至第3代的形态学特点[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(14): 2161-2165.
[12]	张传辉, 李建军, 杨军. 动态压力对负载胰岛素样生长因子1基因兔脂肪间充质干细胞增殖能力和机械性能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 1982-1987.
[13]	王越, 王新军, 袁银鹏, 王宇泽. DAIa2GIP 抑制软骨细胞线粒体凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1652-1657.
[14]	税晓平, 李春莹, 曹艳霞, 苏全生. 有氧和抗阻运动干预2型糖尿病模型大鼠周围神经内质网应激相关蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1693-1698.
[15]	张煦坚, 赵振群, 刘万林. 激素性股骨头缺血坏死发病机制中的内质网应激[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1759-1765.