聚甲基丙烯酸甲酯水蛭素人工晶状体的生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.21.016

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
水蛭素：是水蛭及其唾液腺中已提取出多种活性成分中活性最显著的一种成分，是由65-66个氨基酸组成的小分子蛋白质。水蛭素能高效抗凝血、抗血栓形成，以及阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反应等进一步血瘀现象。此外，它还能抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激。
聚甲基丙烯酸甲酯水蛭素人工晶状体：由硅胶、聚甲基丙烯酸甲酯、水凝胶符合水蛭素等材料制成，具有优良的物化性能和生物相容性，将其运用于白内障中效果理想，能够改善视力，能够为白内障的治疗提供新的思路，具有较高的临床应用价值。人工晶状体人工合成材料制成的植入眼内替代原来的晶状体的一种特殊透镜，其形状功能类似人眼的晶状体，具有质量轻、光学性能高、无抗原性、致炎性、致癌性和能生物降解等特性。

背景：传统晶状体虽然能够改善患者视力，但是材料生物相同性较差，炎症异物反应发生率较高。
目的：探讨聚甲基丙烯酸甲酯水蛭素人工晶状体的生物相容性，研究水蛭素多肽改性丙烯酸系人工晶状体在眼科疾病中的应用效果。
方法：①采用浸泡法在活化后的丙烯酸表面构建水蛭素多肽的生物涂层，通过细胞学观察聚甲基丙烯酸甲酯水蛭素晶状体的生物相容性。②将6只新西兰大白兔随机等分为常规组和水蛭素多肽组。常规组新西兰大白兔植入常规晶体，水蛭素多肽组植入聚甲基丙烯酸甲酯水蛭素人工晶状体。
结果与结论：①聚甲基丙烯酸甲酯水蛭素人工晶体在植入3 d后丙烯酸系人工晶体上细胞大量增殖，并且细胞形态铺展良好，而细胞膜上细胞较少且存在较多的呈球形未铺展状态；②水蛭素多肽组新西兰大白兔边缘攀附的细胞向人工晶状面迁移一些，但是并没有阻碍中心视野，而常规组依然覆盖者纤维化的细胞膜；与常规组相比，水蛭素多肽组植入后SchirmerⅠ试验值升高，而泪膜破裂时间减少；③结果提示聚甲基丙烯酸甲酯水蛭素人工晶状体具有优良的物化性能和生物相容性，将其运用于白内障中效果理想，能够改善视力，能够为白内障的治疗提供新的思路，具有较高的临床应用价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

ORCID: 0000-0002-4430-2778(李素华)

关键词: 生物材料, 材料相容性, 白内障, 水蛭素, 丙烯酸, 人工晶状体, 生物相容性, 物化性能

Abstract:

BACKGROUND: Because of poor biocompatibility, conventional intraocular lenses (IOLs) used to improve visual acuity can result in a higher incidence of inflammatory foreign body reactions.

OBJECTIVE: To study the biocompatibility and therapeutic effects of hirudin peptide-modified acrylic IOL on eye diseases.

METHODS: By immersion coating method, we prepared a polymethylmethacrylate IOL by the modification with hirudin polypeptides and observed its biocompatibility through the cytological observation. In this study, six New Zealand white rabbits were equivalently randomized into conventional and hirudin peptide grouppolypeptide hirudin group. Rabbits in the conventional group were given conventional lens implantation; while those in the hirudin peptide group underwent hirudin peptide-modified polymethylmethacrylate IOL.

RESULTS AND CONCLUSION: Three days after implantation of hirudin peptide-modified polymethylmethacrylate IOL, cells proliferated and spread well on the acrylic IOL, but on the cell membrane, there were a few cells most of which were gathered spherically with no spreading. In the hirudin peptide group, some cells attached to the border zone migrated to the IOL surface, but did not impede the central visual field; in the conventional group, the IOL surface was still covered by fibrotic cell membrane. Compared with the conventional group, the score in the Schirmer I test was increased but the breakup time of tear film decreased in the hirudin peptide group. To conclude, the polymethylmethacrylate IOL modified by hirudin peptides has good physicochemical properties and biocompatibility, increases visual acuity, and yields satisfactory outcomes in the cataract treatment, which provides a new insight into the treatment of cataract.

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Key words: Cataract, Inflammation, Phakic Intraocular Lenses, Tissue Ergineering

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 4

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引言

白内障是一种发生在人眼肉晶状体上的眼科疾病，对于晶状体混浊者均可以视为白内障，该疾病已经成为中国致盲和视力残疾的主要原因之一。截止2010年中国白内障人数已经达到600多万，且需要进行人工晶状体植入者每年超过85万^[1]。目前，人工晶状体材料主要分为4类：聚甲基丙烯酸价值类、硅凝胶类、亲水性聚丙烯酸酯类以及疏水性聚丙烯酸酯类，这些材料各有优缺点，均可治疗白内障^[2]。但是，人工晶状体植入后由于生物相容性等问题容易产生眼内炎、眩光头晕或再次发生混浊，产生二次白内障^[3]。因此，临床上采取有效的措施解决人工晶状体二次混浊，提高生物相容性具有重要的意义^[4]。

生物相容性是指生物医用材料植入人体后与人体组织相互作用时、不引起有害变化的能力。人工晶状体属于白内障患者中常用的眼内植入物，其生物相容性对于患者治疗效果具有重要的影响^[5-6]。与一般的医学生物材料相比，人工晶状体的生物材料不应表现为有利于细胞增殖或迁移，其重点应该在术后炎症反应以及植入人工晶状体后的长期使用效果。Mali等^[7-8]最早提出人工晶状体的生物相容性标准，其应该具有良好的囊膜相容性与葡萄相容性。梁雪飞等^[9]研究显示，在研究人工晶状体生物相容性时可以根据人工晶状体的静态接触角、前方闪辉以及前囊膜混浊程度来评价人工晶状体的生物相容性。

水蛭素是从水蛭及其唾液中提取的世界上最强的凝血酶抑制剂，该物质具有较强的渗透能力和稳定性，胰蛋白酶和糜蛋白酶不会破坏其活性，并且在pH和温度变化较大时并不会产生水解，同时该物质还具有良好的抗凝血效果，由于水蛭素本身的结构和性能等能够保证其独特的性能^[10]。

人工晶状体由于其在眼内特殊的生理作用，选择的材料必须具有一定的透明度、机械强度、韧性等，使得人工晶状体在选择材料时必须可以形成高度晶格的聚合物材料。但是，传统的材料容易黏附异物，导致其透明度明显降低^[11-12]。表面改性则是利用物理作用或化学键作用其表面进行改性，但是并不会改变其物理或化学性能。但是，目前临床上将水蛭素多肽改性丙烯酸系人工晶状体并将其运用于白内障中报道较少^[13-14]。

实验以新西兰大白兔为研究对象，探索水蛭素多肽改性丙烯酸系人工晶状体的生物相容性及其在眼科疾病中的应用效果。

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材料方法

1.1 设计生物相容性研究。

1.2 时间及地点实验于2015年1月至2016年1月南昌大学医学院实验室完成。

1.3 材料

实验动物：SPF级新西兰大白兔6只，年龄(3±1)岁，雌雄不限，体质量为1.53-2.40 kg，平均(1.86±0.11) kg，由中南大学湘雅医院动物实验中心提供，实验动物许可证号为SYXK(湘)2011-0039。对新西兰大白兔的处理符合《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。将入选的新西兰大白兔采用随机对照方法分为常规组和水蛭素多肽组，每组3只。

1.4 方法

1.4.1 聚甲基丙烯酸甲酯水蛭素的生物构建取PBS将高浓度水蛭素溶液稀释到0-600 mg/L等不同质量浓度的溶液，摇匀，放置在玻璃瓶中，并将其放入4 ℃冰箱中进行保存^[15-16]。将聚甲基丙烯酸甲酯片放入到氨等离子体中，加入蓝色荧光粉，进行5 min处理，并将其放置在37 ℃真空干燥箱中进行24 h干燥^[17]。为了进一步研究水蛭素在表面结合的最优条件，采用紫外分光光度计、扫描电子显微镜等对材料的化学性能进行表征^[18-19]。

1.4.2 聚甲基丙烯酸甲酯水蛭素人工晶状体生物相容性将人工晶状体浸泡在体积分数75%乙醇中(时间控制在1 h)，取出后放在超净台中自然吹干，并放置新的48孔板中。将其分为丙烯酸系人工晶状体和聚甲基丙烯酸甲酯水蛭素人工晶状体。将第8代人脐带静脉内皮细胞采用胰蛋白酶消化并进行离心，将细胞悬液稀释到1×10⁷L^-1，每孔中植入300 μL细胞悬液，并放置在培养箱中培养，1，3，5以及7 d时荧光显微镜观察^[20-23]。

1.4.3 动物模型建立及人工晶状体植入采用紫外线照射方法建立新西兰大白兔白内障模型^[24-25]。采用浓度为1%的阿托品对双眼瞳孔进行放大，每周最少2次，使得瞳孔扩大保持在5 mm以上，将新西兰大白兔放置在代谢笼中，被照射的右眼对着紫外线管，每天持续照射8 h，连续照射8个月，建立新西兰大白兔白内障模型。

常规组新西兰大白兔植入常规晶体，水蛭素多肽组植入聚甲基丙烯酸甲酯水蛭素人工晶状体。植入后每天注射80万单位青霉素钠，1次/d，连续注射3 d。

1.4.4 透明度观察植入人工晶状体后8个月，裸眼观察眼内透明度。透明：灯光照射下眼内清晰透明，未见浑浊样；反之为不透明。

1.4.5 SchirmerⅠ试验植入前1 d、植入后1，7，30 d对2组新西兰大白兔进行SchirmerⅠ试验。取5 mm× 35 mm有刻度的滤纸，一端反折5 mm。轻放被测炎下结膜囊中外1/3，5 min取出滤纸，测量滤纸被浸润长度作为SchirmerⅠ试验值。

1.4.6 泪膜破裂时间正常值为10-15 s。< 10 s为低分泌，< 5 s为干眼。通过裂隙灯显微镜上的钴蓝光观察荧光染色后的角膜测定。

1.5 主要观察指标 ①聚甲基丙烯酸甲酯水蛭素人工晶状体生物相容性。②人工晶状体透明度。③SchirmerⅠ试验值。④泪膜破裂时间。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0软件对采集到的数据进行分析，其中符合正态分布的数据进行单因素方差分析，存在统计学意义予以LSD法两两比较。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

白内障是临床上常见的疾病，该疾病已经成为我国致盲的首要原因。目前，国内外对于白内障的治疗更多的以白内障摘除联合人工晶状体植入术治疗为主。但是，患者行人工晶状体植入过程中容易造成血-房水屏障遭到破坏，从而造成眼部大量蛋白质以及细胞进入房水中，并且能够在材料的表面吸附，引起患者发生炎症异物反应^[26-27]。患者如果不采取积极有效的方法处理将会造成晶状体上皮细胞发生纤维化，从而导致囊膜混浊。目前，临床上对于晶状体合成材料进行了较多研究，主要包括4类，这些材料各有其优点，但是材料植入眼内后容易产生眼内炎，严重者甚至会产生二次白内障。当前，有2种问题容易造成晶状体二次混浊^[28]：①晶状体内部发生钙化，造成房水中的钙离子以及磷酸盐离子经过渗透作用而进入晶状体，间接的形成一种过饱和溶液，导致晶体析出^[29-30]。②晶状体生物相容性差。二次白内障生物相容性临床上主要包括葡萄膜生物相容性以及囊膜相容性。但是，当前材料生物相同性均比较差，难以满足白内障患者人工晶状体植入需要^[31-32]。

由于人工晶状体的特殊性以及人体生理作用要求，植入的晶状体必须具备一定的透明度、机械强度，并且不容易黏附蛋白质、细胞等，常规的材料均难以符合要求，容易造成其透明度下降^[33]。表面改性是近年来使用较多的一种方法，它是利用物理或化学在人工晶状体材料进行改性，并且改性后并不会改变材料本身的物理及化学性能，可以有效的提高材料的生物相容性。同时，表面改性还能够保持材料本身具备的理化性能^[34]。实验聚甲基丙烯酸甲酯水蛭素人工晶状体在植入3 d后丙烯酸系人工晶体上细胞大量增殖，并且细胞形态铺展良好，而原生质上细胞较少且存在较多的呈球形未铺展状态。

水蛭素属于临床上使用较多的药物之一，是目前公认的最强的凝血酶抑制剂，具有良好的亲和力，能够与凝血酶相互结合，可以诱导成纤维细胞的增殖，刺激内皮细胞产生，从而能够促进增值膜形成^[35]。同时，水蛭素还能够激活其释放血小板，从而能够产生血液聚集。当人工晶状体植入眼部后，水蛭素能够充分发挥作用，诱导、激活细胞、蛋白质等，促进人工晶状体和周围组织的相互融合^[36]。实验中，水蛭素多肽组新西兰大白兔边缘攀附的细胞向人工晶状体表面迁移一些，但是并没有阻碍中心视野，而常规组依然覆盖者纤维化的细胞膜。此外，聚甲基丙烯酸甲酯水蛭素人工晶状体在白内障患者中应用时制备相对比较简单，能够有效的改善机体视力，促进其早期恢复^[37]。实验中，2组兔植入人工晶体后SchirmerⅠ试验和泪膜破裂时间差异无显著性意义(P > 0.05)；水蛭素多肽组植入后1，7以及30 d SchirmerⅠ试验和泪膜破裂时间显著高于常规组(P < 0.05)。

综上所述，聚甲基丙烯酸甲酯水蛭素人工晶状体具有优良的物化性能和生物相容性，将其运用于白内障中效果理想，能够改善视力，能够为白内障的治疗提供新的思路，具有较高的临床应用价值。

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