外科生物补片修复退变椎间盘纤维环

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.16.006

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (16): 2324-2332.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.16.006

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外科生物补片修复退变椎间盘纤维环

朱旭¹，马原¹，孟祥玉²，田慧中¹

新疆医科大学第六附属医院，1脊柱外一科，2微创脊柱外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000

收稿日期:2016-02-25 出版日期:2016-04-15 发布日期:2016-04-15
通讯作者: 马原，硕士，主任医师，副教授，新疆医科大学第六附属医院脊柱外一科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000
作者简介:朱旭，男，汉族，1987年生，新疆医科大学在读硕士，医师。
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(2014211C135)

Surgical biomaterials to repair the ruptured annulus fibrosus due to intervertebral disc degeneration

Zhu Xu¹, Ma Yuan¹, Meng Xiang-yu², Tian Hui-zhong¹

1First Department of Spine Surgery, 2Department of Minimally Invasive Spine Surgery, Sixth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2016-02-25 Online:2016-04-15 Published:2016-04-15
Contact: Ma Yuan, Master, Chief physician, Associate professor, First Department of Spine Surgery, Sixth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Zhu Xu, Studying for master’s degree, Physician, First Department of Spine Surgery, Sixth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2014211C135

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

外科生物补片：广泛应用于修复缺损的硬脑(脊)膜等组织，具有张力强、无粘连、来源广泛等多项优势采用聚氨酯膜复合材料修复退变椎间盘纤维环，对修复椎间盘承载负荷、扭曲力、维持椎间隙高度等具有一定的作用。

椎间盘退行性病变：是指椎间盘自然老化、退化的病理生理过程。随着年龄的增长，过度的活动和超负荷的承载，使椎间盘加快出现老化，严重的椎间盘退行性病变可以引起腰腿痛甚至神经损害，影响工作能力和生活质量。

背景：近年来国内外采用实验动物构造腰椎间盘退变模型，结合组织工程、细胞工程、基因工程等技术手段修复退变椎间盘已成为当前研究热点。

目的：观察病探索外科生物补片对兔椎间盘纤维环缺损修复作用的生物学效应。

方法：随机选取兔的L_3-4，L_4-5，L_5-6椎间盘，分别设为空白组、对照组及实验组，实验组做椎间盘纤维环切开造模及外科补片修补；对照组仅做椎间盘纤维环切开建立椎间盘退变模型；空白组仅显露相应椎间盘。随机选取6只兔分别于术前，术后1，2，4，8，12周行腰椎X线及MRI检查；于术前选取1只兔，术后1，2，4，8，12周每周选取3只兔，处死后获取相应椎间盘组织行苏木精-伊红染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，观察外科生物补片对早期椎间盘退变的干预效果。

结果与结论：①椎间盘高度指数百分比：术后1，2，4周，对照组和实验组椎间盘高度指数百分比随时间进展呈持续减小趋势；②影像学和组织学变化：术后2周，实验组和对照组MRI T2WI信号强度、苏木精-伊红染色分级评分明显升高(P < 0.05)，实验组和对照组苏木精-伊红染色显示髓核细胞随术后时间推移逐渐减少，纤维环缺损处逐步被肉芽、纤维组织填充，生物膜与外层纤维环贴合紧密；③Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：术后随时间延长，实验组和对照组髓核组织染色逐渐由阳性转为阴性；④结果证实：纤维环切开法造模可引起椎间盘早期剧烈的退变；外科生物补片与外层纤维环组织良好的贴合并有封堵纤维环缺损阻止髓核进一步突出的作用；但该法并不能抑制椎间盘持续退变。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
ORCID: 0000-0002-0014-7411(马原)

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 外科生物材料, 椎间盘退变, 椎间盘高度指数, 磁共振T2加权像, 免疫组织化学染色, 新疆维吾尔自治区自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, animal models of lumbar disc degeneration have been popularized to explore the effect of tissue engineering, cell engineering and genetic engineering technologies on intervertebral disc degeneration.

OBJECTIVE: To investigate the influence of biological patches on rabbit anulus fibrosus repair.

METHODS: L_3-4, L_4-5, L_5-6 segments from rabbits were randomly divided into normal control group (the intervertebral disc was exposed correspondingly), control group (the annulus fibrosus was only cut with a surgical scalpel) and experimental group (the annulus fibrosus was cut and sutured with the surgical biomaterial). Six rabbits were selected randomly to take the lumbar X-ray and MRI preoperatively and 1, 2, 4, 8, 12 weeks postoperatively; one rabbit was chosen preoperatively and three rabbits selected respectively at 1, 2, 4, 8, 12 weeks postoperatively to execute hematoxylin-eosin and type II collagen immunohistochemistry.

RESULTS AND CONCLUSION:At postoperative 1, 2 and 4 weeks, the disc height index decreased significantly in the control and experimental groups. MRI and histopathological examination showed that the T2WI signal intensity and hematoxylin-eosin grading were both increased significantly in the control and experimental groups at 2 weeks after surgery (P < 0.05). With time, the number of nucleus pulposus cells gradually reduced in the control and experimental groups. Annulus fibrosus defects were filled with granulation and fibrous tissues, and the biofilm was tightly fused with the annulus fibrosus. Findings from the type II collagen immunohistochemical staining showed that the histological staining of the nucleus pulposus was gradually changed from positive to negative in the experimental and control groups. Therefore, cutting the annulus fibrosus can lead to severe disc degeneration at early period, and surgical biomaterials can be integrated with the annulus fibrosus well to seal annulus fibrosus defects and further prevent nucleus pulposus protrusion. However, this approach cannot restrain the continuous process of disc degeneration.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Intervertebral Disk, Biocompatible Materials

朱旭，马原，孟祥玉，田慧中. 外科生物补片修复退变椎间盘纤维环[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(16): 2324-2332.

Zhu Xu, Ma Yuan, Meng Xiang-yu, Tian Hui-zhong. Surgical biomaterials to repair the ruptured annulus fibrosus due to intervertebral disc degeneration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(16): 2324-2332.

图/表（结果） 8

2.1 实验动物数量分析全部32只兔术中出血较少(15-20 mL)，未发生腹膜破裂；麻醉过量致死1只，术后肠道感染、脱水致死1只，剩余30只兔均进入最后的数据分析。实验用兔术后1 h内苏醒，1只术后3 d发生双下肢瘫痪，无尿便失禁发生。兔椎间盘纤维环退变造模及生物补片修复流程见图3。

2.2 各组腰椎影像学结果术前腰椎X射线显示：椎体及椎间盘排列整齐，椎间隙平整、清晰，椎体前后缘无明显增生骨赘，上下软骨终板无钙化；术后1-4周可见实验组、对照组椎间隙高度均减小(P < 0.05)，但未见明显椎体前后缘骨赘、上下终板软骨钙化形成；术后8，12周实验组和对照组椎间隙高度均持续降低，但差异无显著性意义(P > 0.05)，而椎体前后缘有骨赘形成，软骨终板有钙化(图4)。

两组间术后同时间点比较差异无显著性意义(P > 0.05)；空白组与实验组、对照组各个时间段椎间隙高度比较：空白组术前及术后椎间隙高度无明显改变；同一时间点与实验组、对照组组间随术后时间推移比较，差异有显著性意义(P < 0.01；表2)。

不同时间点椎间盘T2WI改变：空白组椎间盘信号强度较术前差异无显著性意义(P > 0.05)，术后2周起实验组、对照组椎间盘信号强度随着时间进展不断降低，但椎间盘退变分级逐渐增大，相较术前及术后1周差异有显著性意义(P < 0.05)；术后4，8，12周椎间盘信号强度及评级变化均不显著(P > 0.05)。实验组与对照组组间术后同一时间点椎间盘信号强度和评级比较均差异无显著性意义(P > 0.05；图5，表3)。

2.3 病理组织学评估结果

苏木精-伊红染色：正常椎间盘中央髓核组织及外周纤维环层状排列，结构完整，外周纤维环细胞呈梭形，细胞体积较小；中央髓核细胞体积较大，呈类圆形，胞浆丰富(图6A1，A2)。术后1，2周实验组椎间盘结构明显破坏，中央可见髓核细胞数量较多，体积明显增大，水样变性，散在肉芽组织；外层纤维环层状结构破坏、紊乱，断裂，缺损处可见散落的软骨样细胞，还有少量纤维细胞，纤维环缺损处表面有生物补片严密覆盖，补片外层为大量成纤维细胞增生物。对照组椎间盘纤维环结构类似实验组表现(见图6 B1，B2，C1，C2)。术后4，8，12周实验组髓核细胞较少，体积明显缩小，纤维细胞散落其中，缝合的补片与纤维环贴合的紧密，肉芽组织(主要成分是纤维细胞和软骨样细胞)构成的组织团块覆盖在补片周围；对照组椎间盘纤维环缺损处由纤维细胞、软骨细胞构成的帽状结构覆盖；随时间推移髓核细胞逐渐减少，纤维细胞、肉芽组织、钙化斑逐渐增多(图6 D1，D2，E1，E2，F1，F2)。

组椎间盘形态学分级评分结果见图7，实验组和对照组术后同一时间分级评分对比差异无显著性意义(P > 0.05)；实验组术后1，2周苏木精-伊红染色评分比较差异无显著性意义(P >0.05)；术后2周与术后4周比较差异有显著性意义(P < 0.05)；术后4周与术后8，12周苏木精-伊红染色评分比较差异有显著性意义(P > 0.05)。

Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：正常椎间盘(空白组)髓核组织Ⅱ型胶原呈阳性黄染，细胞外基质分布均匀，由髓核至外层纤维环，黄染程度逐渐降低，外层纤维环为阴性(图8A)；实验组和对照组术后1 周Ⅱ型胶原含量减少，细胞外基质分布不均匀(图8B，C)。术后12周髓核组织细胞外基质基本无黄染呈阴性(图8D，E)。
2.4 不良反应评价所有实验用兔中全麻过量致死1只，分析原因兔具有较强的耐药性或个体差异、全麻药物存放时间过长药效减低、推药速度过快，剂量过大；术后肠道感染、脱水致死1只，分析原因吞食不洁饲料或饮不洁水、术后免疫力下降，厌食和兔笼环境温度较低等。

参考文献

[1] Sun W, Zhang K, Liu G, et al. Sox9 gene transfer enhanced regenerative effect of bone marrow mesenchymal stem cells on the degenerated intervertebral disc in a rabbit model. PLoS One. 2014; 9(4):e93570.

[2] March L, Smith EU, Hoy DG, et al. Burden of disability due to musculoskeletal (MSK) disorders. Best Practice Res Clin Rheumatol. 2014;28(3):353-366.

[3] Weinstein JN, Lurie JD, Tosteson TD, et al. Surgical versus nonoperative treatment for lumbar disc herniation: four-year results for the Spine Patient Outcomes Research Trial (SPORT). Spine (Phila Pa 1976). 2008;33(25):2789-2800.

[4] Depalma MJ, Ketchum JM, Saullo TR, et al. Is the history of a surgical discectomy related to the source of chronic low back pain? Pain Physician. 2012; 15(1): E53-E58.

[5] Guterl CC, See EY, Blanquer SB, et al. Challenges and strategies in the repair of ruptured annulus fibrosus. Eur Cell Mater. 2013;25:1-21.

[6] Jankowitz BT, Atteberry DS, Gerszten PC, et al. Effect of fibrin glue on the prevention of persistent cerebral spinal fluid leakage after incidental durotomy during lumbar spinal surgery. Eur Spine J. 2009;18(8): 1169-1174.

[7] Long RG, Burki A, Zysset P, et al. Mechanical restoration and failure analyses of a hydrogel and scaffold composite strategy for annulus fibrosus repair. Acta Biomater. 2016;30:116-125.

[8] 陈靖,石松生,张国良,等.生物型人工硬脑膜修补硬脑膜缺损[J].中国组织工程研究,2013,17(51):8914-8919.

[9] Gui K, Ren W, Yu Y, et al. Inhibitory effects of platelet-rich plasma on intervertebral disc degeneration: a preclinical study in a rabbit model. Med Sci Monitor. 2015;21:1368-1375.

[10] 周葳,徐义春,王其友,等.两种手术入路消融术建立兔椎间盘退变模型的比较研究[J].中华实验外科杂志, 2014, 31(3):669-671.

[11] 刘海飞,张晗,乔光曦,等.应用纤维结合素建立新型兔腰椎间盘退变模型[J].中华外科杂志, 2013,51(4):362- 366.

[12] 王彦强,吕鹏飞,张光武,等.人脐带间充质干细胞移植修复兔退变椎间盘的初步研究[J].中国骨与关节外科, 2014, (6):523-526.

[13] Masuda K, Imai Y, Okuma M, et al. Osteogenic protein-1 injection into a degenerated disc induces the restoration of disc height and structural changes in the rabbit anular puncture model. Spine (Phila Pa 1976). 2006;31(7):742-754.

[14] 白亦光,韩小伟,张旭乾,等.纤维环穿刺抽吸法和纤维环切开法建立兔椎间盘退变模型的比较[J].中国矫形外科杂志,2013,(7):690-694.

[15] Pfirrmann CW, Metzdorf A, Zanetti M, et al. Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration. Spine. 2001;26(17): 1873-1878.

[16] Urrutia J, Besa P, Campos M, et al. The Pfirrmann classification of lumbar intervertebral disc degeneration: an independent inter-and intra-observer agreement assessment. Eur Spine J. 2016.

[17] 贺庆,李兵,卓祥龙,等.经皮纤维环穿刺与经肌间隙纤维环刀刺建立兔椎间盘退变模型[J].中国组织工程研究, 2014, 18(13):2059-2064.

[18] Keorochana G, Johnson JS, Taghavi CE, et al. The effect of needle size inducing degeneration in the rat caudal disc: evaluation using radiograph, magnetic resonance imaging, histology, and immunohistochemistry. Spine J. 2010;10(11):1014-1023.

[19] 崔运能,李绍林,周荣平,等.CT引导下经皮纤维环穿刺建立兔腰椎间盘退变模型[J].中国脊柱脊髓杂志, 2014, 4(3):234-243.

[20] Huang B, Zhuang Y, Li CQ, et al. Regeneration of the intervertebral disc with nucleus pulposus cell-seeded collagen II/hyaluronan/chondroitin-6-sulfate tri-copolymer constructs in a rabbit disc degeneration model. Spine (Phila Pa 1976).2011;36(26):2252-2259.

[21] 王海莹,张旭,丁文元,等.椎间盘退变动物模型的研究进展[J].中国脊柱脊髓杂志,2015,25(3):279-282.

[22] 顾韬,张超,何勍,等.不同类型椎间盘退变动物模型的评价与比较[J].脊柱外科杂志,2015,(2):115-120.

[23] 陈靖,石松生,张国良,等.生物型人工硬脑膜修补硬脑膜缺损[J].中国组织工程研究,2013,17(51):8914-8919.

[24] Long R G, Burki A, Zysset P, et al. Mechanical restoration and failure analyses of a hydrogel and scaffold composite strategy for annulus fibrosus repair. Acta Biomater. 2016;30:116-125.

[25] Pirvu T, Blanquer SB, Benneker LM, et al. A combined biomaterial and cellular approach for annulus fibrosus rupture repair. Biomaterials. 2015;42:11-19.

[26] Ledet EH, Jeshuran W, Glennon JC, et al. Small intestinal submucosa for anular defect closure: long-term response in an in vivo sheep model. Spine. 2009;34(14):1457-1463.

[27] Jin L, Feng G, Reames DL, et al. The effects of simulated microgravity on intervertebral disc degeneration. Spine J. 2013;13(3):235-242.

[28] Marinelli NL, Haughton VM, Munoz A, et al. T2 relaxation times of intervertebral disc tissue correlated with water content and proteoglycan content. Spine. 2009;34(5):520-524.

[29] Mwale F, Ciobanu I, Giannitsios D, et al. Effect of oxygen levels on proteoglycan synthesis by intervertebral disc cells. Spine. 2011;36(2):E131-E138.

[30] Roughley PJ. Biology of intervertebral disc aging and degeneration: involvement of the extracellular matrix. Spine. 2004;29(23):2691-2699.

[31] Samartzis D, Borthakur A, Belfer I, et al. Novel diagnostic and prognostic methods for disc degeneration and low back pain. Spine J. 2015;15(9): 1919-1932.

[32] Sharifi S, Bulstra SK, Grijpma DW, et al. Treatment of the degenerated intervertebral disc; closure, repair and regeneration of the annulus fibrosus. J Tissue Eng Regen Med. 2015;9(10):1120-1132.

引言

材料方法

1.1 设计随机区组设计动物实验。

1.2 时间及地点于2015年3至10月在新疆医科大学实验动物科学研究部及新疆医科大学第六附属医院病理科完成。

1.3 材料

实验动物：健康4-6月龄新西兰大白兔32只，体质量2.2-2.6 kg，性别不限，由新疆医科大学实验动物科学研究部提供，动物许可证号：SYXK(新)2010-0001，分笼饲养。

生物补片材料：实验采用的生物补片由北京佰仁思(BalMedic)医疗科技有限公司提供，生产许可证号：京药监械生产许可20050101号，产品标准号：YZB/国0035-2012，规格：长(宽)：(6.0±0.5)-(8.0±0.5) cm，厚：0.2-0.5 mm，取自于黄牛心包组织，经过筛选和特定的化学改性处理，使其具有张力强、较好的生物相容性、较少相关并发症等优势，长期以来被广泛应用于神经外科硬脑(脊)膜等软组织修复。

1.4 实验方法

1.4.1 分组采用随机数字表法选取每只实验用兔的L_3-4，L_4-5，L_5-6椎间盘，分别设为实验组、对照组和空白组。实验组行椎间盘纤维环切开造模及外科生物补片修补；对照组行椎间盘纤维环切开(椎间盘退变造模)；空白组仅显露相应椎间盘。随机选取6只兔分别于术前、术后1，2，4，8，12周行X射线及MRI检查；术前选取1只兔、术后1，2，4，8，12周每周选取3只兔子安乐死后，获取相应的椎间盘组织行病理组织切片染色(苏木精-伊红染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色)观察。

1.4.2 构建兔腰椎间盘退变模型及外科生物补片修补取32只实验用新西兰大白兔，术前禁食、禁水、备皮、称质量记录兔体质量、拍腰椎侧位X射线片(X射线成像仪，德国西门子公司)及腰椎MRI(1.5 T磁共振扫描机，德国西门子公司)，排除腰椎、脊髓先天性疾病及畸形；术前半h肌肉注射硫酸庆大霉素注射液(湖北宜昌人福药业有限公司)8万单位。以体积分数1%戊巴比妥钠(德国默克Merck有限公司)3 mL/kg由耳缘静脉全麻，全麻后取右侧卧位，绷带固定四肢，常规消毒铺巾。由左侧背最长肌外缘上自第12肋骨下至左髂嵴上缘切开皮肤，切口长约8 cm，仔细止血，切开并显露皮下组织及筋膜(常规手术器械2套-上海医疗器械有限公司)，见腹外斜肌延续至背最长肌部分呈乳白色腱膜，沿此腱膜切开，在腰背肌之间钝性分离，腰方肌前内侧可触及横突，沿横突仔细分离附着其上的肌肉，显露相应椎间盘及邻近椎体^[9-10]。

据实验设计，随机选取兔L_3-4，L_4-5，L_5-6作为研究对象。实验组采用成角15°眼科手术尖刀(眼科显微器械包：持针器、镊子、线剪、专用手术刀2套，上海臻美医疗用品有限公司)全层切开椎间盘(尺寸：2 mm×2 mm)行椎间盘纤维环切开术，立即采用修剪规整的外科生物补片、专用眼科持针器、齿镊、线剪及8-0针线(尼龙8-0带线缝合针-宁波医用缝针有限公司)在外科显微镜(北京普瑞赛司Precise仪器有限公司)下对切开的纤维环进行严密缝合修补，在缺损的纤维环周围间距均等的缝合五或六针；对照组做椎间盘纤维环全层切开(椎间盘退变模型)；空白组仅显露椎间盘(图1)。确切止血，生理盐水充分冲洗切口，然后逐层关闭缝合肌肉、筋膜、皮肤，乙醇消毒，无菌敷料覆盖，绷带固定，自然麻醉苏醒。

1.4.3 术后处理肌肉注射硫酸庆大霉素注射液8万单位，待兔麻醉苏醒，放回兔笼自由喂养，术后继续禁食、水6 h，连续3 d肌肉注射硫酸庆大霉素注射液8万单位。同时严密观察进食水、四肢活动情况，尿便是否正常，有无切口感染等状况，术后10-12 d拆线。

1.4.4 影像学检测

腰椎X射线检测：于修补术后1，2，4，8，12周麻醉(同上方法，严格控制麻醉深度)。行右侧卧位腰椎侧位片检查，采用全数字化X射线成像系统(德国西门子公司)行X射线摄片(参数：68 kV，10 mA，100 cmdistance)获得影像资料，应用专业图像分析软件(CorelDRAW X4 SP2，USA)测量椎间盘前后缘高度AC、BD及下位椎体前后缘高度CE、DF，根据国内外学者采用的方法计算椎间盘高度指数百分数(Disc height index，DHI%)^[11-13](图2)。所有影像资料由2位中级及以上职称影像科医师盲法测量(测量医师对实验目的、实验分组均不知情)评估，取平均值。

腰椎MRI检测：于修补术后1，2，4，8，12周同上法充分麻醉兔，严格控制麻醉深度，取专用于膝关节扫描线圈牢靠固定兔于俯卧位，采用1.5 T西门子磁共振扫描机(德国西门子公司)行腰椎正中矢状位核磁T₂加权像扫描，MRI扫描的主要参数：序列重复时间(TR)3 400 ms，回波时间(TE)130 ms，层厚3 mm，层间距1 mm扫描^[14]。

影像资料参照腰椎间盘退变Pfirrmann分级法^[15](表1)，由2位中级及以上影像科医师对椎间盘退变程度进行单盲评估，共分为5级，取平均值。影像医师对实验设计、目的及分组信息均不知情。观察纤维环修补后T2WI的信号变化。依次记录每个椎间盘退变程度及所对应的椎间盘个数，进行统计分析。为确保医师观察数据的可靠性^[16]，医师采用前后间隔1个月重复2次检测的方法。

1.4.5 病理组织学检测

苏木精-伊红染色：于修补术后1，2，4，8，12周检测完腰椎X射线、MRI后静脉注射过量戊巴比妥钠安乐法处死兔，获取完整3个组兔的椎间盘组织，生理盐水冲洗后放入体积分数4%中性甲醛溶液(北京赛驰生物科技有限公司提供)中固定48 h，常规脱钙(脱钙液：南昌雨露实验器材有限公司)、脱水3 d，石蜡包埋，常规切片(石蜡组织切片机-德国莱卡Leica公司)，片厚4 μm，行苏木精-伊红染色^[17](新疆医科大学第一附属医院病理教研室)，光学显微镜下观察椎间盘组织形态，按照Keorochana等^[18]采用的方法进行病理组织学评分，总评分数越低说明椎间盘退变程度越轻，反之亦然。

Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：上述石蜡切片的椎间盘组织经二甲苯脱蜡、逐级乙醇水化；加热枸橼酸钠缓冲溶液(pH 6.0)至95 ℃进行抗原修复(EDTA抗原修复液-北京中杉金桥生物科技有限公司)，滴加比例为1∶500的兔Ⅱ型胶原一抗(Ⅱ型胶原免疫组化兔抗原试剂盒0.1 mL-北京博奥森生物技术有限公司)；4 ℃孵育过夜，过夜后放置在37 ℃环境中45 min复温；滴加辣根过氧化物酶-生物素标记的二抗(北京博奥森生物技术有限公司)37 ℃环境孵育1 h；DAB 显色(DAB-HRP显色试剂盒-北京中杉金桥生物科技有限公司)。

苏木精复染细胞核并中性树胶固封，在光学显微镜下观察髓核及纤维环组织的染色状况^[19]，纤维环细胞或髓核细胞周围基质染色呈棕黄色即为阳性，无染色者为阴性。

1.5 主要观察指标 ①椎间盘高度指数百分数(DHI%)；②椎间盘MRI T2WI图像Pfirrman分级；③椎间盘病理组织学评分；④椎间盘Ⅱ型胶原免疫组织化学染色。

1.6 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计量资料以x(_)±s表示，组间数据差异的比较采用随机区组方差分析法；术后椎间盘退变Pfirrmann评分和苏木精-伊红染色评分的等级资料采用Mann-Whitney U秩和检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

椎间盘退变动物模型的建立对于进一步阐明椎间盘退变发病机制具有重要的意义。目前建立该模型比较常用小型实验动物是鼠和兔^[20]，价格低廉、容易获取、喂养和护理方便是它们的优势。王海莹等^[21]将模型建立的方法分为：诱发性和自发性椎间盘退变模型，诱发性退变模型又分为：力学模型、损伤模型和生物学模型。椎间盘纤维环切开法是常用的造模方法之一。但顾韬等^[22]报道：这种方法造模优点在于周期较短(兔只需1个月)，明显缩短了造模时间，加快了实验进程，同时该法造模具有可重复性、可操作性较好，其可靠性一般。但该法造模的不足之处：①纤维环切开造成了椎间盘生理结构直接的破坏，可控性较差。②损伤后缺损处髓核的功能细胞通过纤维环缺口大量流失模拟椎间盘自然退变的过程较差。实验采用了纤维环切开法造模，X射线检测显示术后4周对照组椎间隙变窄，椎体前后缘有骨赘形成，软骨终板有钙化，术后8，12周椎间隙持续变窄，骨赘及软骨终板的钙化程度持续加重；据椎间盘MRI Pfirrmann 分级法显示：自术后2周起实验组和对照组椎间盘MRI T2WI分级明显升高，术后4，8，12周分级未见明显改变，但同一时间段实验组与对照组未见显著差异；同时椎间盘苏木精-伊红染色分级结果显示术后2周后至术后4周评分显著升高，这些指标说明纤维环切开法早期能够诱发椎间盘退变。

外科生物补片是一类临床常应用于修复组织缺损的人工生物膜，对于保持组织解剖学完整性及重要脏器的保护有十分重要的作用。而异种生物材料则是目前临床研究的热点。实验采用的外科生物补片取自于黄牛心包组织^[23]，经过筛选和特定的化学改性处理，使其具有非常好的生物相容性。实验创新性的使用生物补片显微镜下修复椎间盘纤维环的缺损，填补纤维环缺口，阻止髓核进一步流失和椎间盘外组织嵌入椎间盘。实验的病理组织学检测显示，术后2周实验组椎间盘表面缝合的补片贴合良好，未见髓核进一步渗出，周围肉芽组织、纤维细胞包裹严密。国外学者采用复合生物补片对缺损的纤维环进行缝合修补联合生物支架接种种子细胞共同修复纤维环的策略对阻止髓核组织的再突出、稳定椎间盘高度均有积极作用^[24-25]。实验仅使用外科生物补片缝合修复纤维环存在一定缺陷，需要后期完善实验内容。Ledet等^[26]采用肠黏膜下层组织修复山羊椎间盘退变模型的缺损纤维环，虽没有维持椎间盘MRI的高信号与原有纤维环半层盘状组织结构，但起到了良好的环行封闭作用。

椎间盘退变的显著变化是椎间盘髓核组织内蛋白多糖、水分的减少以及胶原蛋白成分的改变。蛋白多糖的减少直接导致髓核内水分的丢失，蛋白多糖免疫荧光测定和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色能显示蛋白多糖和Ⅱ型胶原在髓核组织内含量，这是检测两者常用的病理组织学方法。

MRI能够清晰的反映椎间盘内水含量的多少^[28]，同时核磁T₂加权像可清晰的显示椎间盘信号强度下降，退变晚期可有椎间隙狭窄，椎体前后缘骨赘形成。Ⅰ，Ⅱ型胶原含量占所有椎间盘中胶原总量的80%，并且Ⅰ，Ⅱ型胶原的比例是衡量椎间盘退变的指标^[29-30]。Ⅰ型胶原蛋白的增加及Ⅱ型胶原蛋白的减少使椎间盘伸缩性能和承载能力减弱。退变椎间盘发生过程中发生多种基因表达的改变，基因改变可通过聚合酶链式反应进行检测和验证^[31]。

目前对椎间盘纤维环多主张采用细胞工程、组织工程支架复合材料等联合的方式进行修复^[32]，多处在动物实验阶段。实验在外科显微镜下精细缝合纤维环，对纤维环结构的完整性提供宝贵的生物学基础。在临床上具有阻止了髓核的突出，对椎间盘生物力学的稳定性维持的积极意义，同时也能改善患者慢性腰痛的不适症状。

实验的局限之处：新西兰大白兔兔与人椎间盘具有不同的解剖、生理、生化特点，因此需要进一步了解兔与人之间椎间盘的差异，达到更精确的研究目的；其次实验没有进行其他酶学、生物化学(如基因表达)等的测定，因此无法更精确的判断修补后对纤维环退变的生物学影响；实验动物样本数较少，可能对实验结果产生一定偏倚，这些均为未来实验需改进之处。

综上所述，实验采用纤维环切开法造成椎间盘的剧烈退变，引起椎间盘髓核内水分和细胞外基质成分的大量流失，这在MRI、病理组织染色的检测中得以证实。实验利用外科生物补片显微镜下修复纤维环缺损，阻止了髓核组织的进一步丢失，结果表明这种方法虽不能阻止椎间盘的持续退变，但也显示外科生物补片与外层纤维环的紧密结合良好的封堵作用，阻止椎间盘的再突出，为临床上进一步修复椎间盘纤维环奠定了一定的实验基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

外科生物补片修复退变椎间盘纤维环

Surgical biomaterials to repair the ruptured annulus fibrosus due to intervertebral disc degeneration

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[1]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[2]	江丽红, 吴晓锋, 欧阳林, 罗爱芳, 黄丽. 基于代谢组学腰椎间盘退变的计算机辅助诊断[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(24): 3796-3803.
[3]	刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.
[4]	周安琪, 唐渝菲, 吴秉峰, 向琳. 骨膜组织工程设计：共性与个性的结合[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3551-3557.
[5]	郎丽敏, 何生, 姜增誉, 胡奕奕, 张智星, 梁敏茜. 导电复合材料在心肌梗死组织工程治疗领域的应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3584-3590.
[6]	解健, 苏俭生. 静电纺丝取向纳米纤维作为组织工程生物支架的优势与特征[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2575-2581.
[7]	纪琦, 喻正文, 张剑. 3D打印金属基生物材料工艺和临床应用的问题与趋势[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2597-2604.
[8]	宋涯含, 吴云霞, 范道洋. 基于VOSviewer生物医学领域3D打印的知识图谱分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(15): 2385-2393.
[9]	钱楠楠, 张潜, 杨睿, 敖俊, 章涛. 间充质干细胞治疗脊髓损伤：细胞治疗及联合新药和生物材料[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2114-2120.
[10]	刘志刚, 郭庆功, 陈景涛. 刺山柑总生物碱干预椎间盘退变模型大鼠髓核细胞的增殖与凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1699-1704.
[11]	罗雅馨, 毕浩然, 陈晓旭, 杨琨. 细胞外基质与组织的再生与修复[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1785-1790.
[12]	贾巍, 张满栋, 陈维毅, 王晨艳, 郭媛. 股骨假体材料对人工膝关节置换性能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1477-1481.
[13]	王倩, 李璐, 舒静媛, 董志恒, 靳友士, 王青山. 氧化锆基纳米羟基磷灰石功能梯度生物材料的微观形貌和物相分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1517-1521.
[14]	杨亚楠, 李峻峰, 王立, 刘恒全, 赖雪飞. 柠檬酸钙：一种有趣的有机钙生物医用材料[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1609-1615.
[15]	陈铁柱, 王宁科, 李晓声. 腰痹舒干预腰椎间盘退变模型兔髓核组织水通道蛋白1、水通道蛋白3的表达[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1168-1173.