FABP-5基因沉默对宫颈癌SiHa细胞生物学特性的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.15.013

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

基因沉寂：也可以被称为基因沉默，是真核生物细胞基因表达调节的一种重要手段。以前，基因沉寂被理解为是真核生物染色体形成异染色质的过程。最近的研究表明，基因沉寂与异染色质存在差异，尽管被沉寂的基因区段也呈高浓缩状态，但基因沉寂所形成的染色体构象并不完全等同于异染色质构象。除此之外，两者还存在着基因表达调控程度上的差异，一般认为处于基因沉寂的染色质区的基因表达被彻底关闭，而异染色质状态的基因可能依然进行低水平的表达。

FABP-5基因：FABP-5是一类同源性极高的小分子胞内蛋白，属于脂结合蛋白超家族成员，由126-134个氨基酸组成，对脂肪酸有高度的亲和力，在哺乳动物肝脏中可高表达，广泛存在于脊椎动物和非脊椎动物的脂肪、脑、肠、心、骨骼肌等细胞中。FABP的配体范围很广，包括长链脂肪酸、溶血磷脂酸、血红素、脂肪酰辅酶A等。FABP与多种肿瘤的发生相关联，其可进入肿瘤细胞核内发挥其可能的调控功能。

背景：研究发现肿瘤相关基因以及肿瘤基因通路的改变在肿瘤的形成与发展中起重要作用。

目的：探讨siRNA干扰技术沉默FABP-5基因表达对人宫颈癌SiHa细胞生物学特性的影响。

方法：以人宫颈癌SiHa细胞为研究对象，根据FABP-5 mRNA编码序列设计并合成干扰siRNA序列，瞬时转染SiHa细胞。用RT-PCR和Western blot法分别从mRNA水平和蛋白水平检测FABP-5基因的表达；流式细胞技术检测各组细胞周期的变化；CCK-8法测定细胞体外增殖能力；细胞侵袭小室法检测各组细胞的体外侵袭力；TUNEL染色检测各组细胞的凋亡情况。

结果与结论：与转染空病毒阴性对照组和未转染空白对照组比较，FABP-5 siRNA组FABP-5 mRNA和蛋白表达明显下降，细胞生长速度明显减慢，细胞周期阻滞在G₀/G₁期，S期细胞数减少，细胞侵袭力显著下降，细胞凋亡率明显升高。结果说明siRNA技术可以成功诱导FABP-5基因沉默，从而影响宫颈癌SiHa细胞的的生长、增殖和凋亡。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-5772-964X(陈逢振)

关键词: 组织构建, 组织工程, 宫颈癌, FABP-5, siRNA干扰, SiHa细胞, 细胞周期, 细胞增殖, 细胞侵袭, 细胞凋亡

Abstract:

BACKGROUND: Cancer related genes and pathways play a critical role in formation and development of cancer.

OBJECTIVE: To investigate the silencing epidermal fatty acid binding protein 5 (FABP-5) by siRNA interference on biological characteristics of the cervical carcinoma cell line SiHa.

METHODS: Design and synthesis of siRNA interference sequence used to transiently transfect SiHa cells was performed according to FABP-5 mRNA coding sequence. mRNA and protein expressions of FABP-5 were detected by RT-PCR and western blot assay, respectively. Meanwhile, cell cycle, proliferation, invasion and apoptosis were detected by flow cytometry, cell counting bit-8 assay, Boyden chamber assay, and TUNEL staining, respectively.

RESULTS AND CONCLUSION: FABP-5 mRNA and protein expressions, cell growth speed, cell number at S phase (cell cycle was arrested at the G₀/G₁ phase) and cell invasion were significantly decreased, while the cell apoptosis was significantly increased in FABP-5 siRNA group compared with the negative control and blank control groups. Our findings indicate that the specific silencing FABP-5 gene expression by siRNA interference can inhibit SiHa cervical cell growth and proliferation, but accelerate cell apoptosis.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: RNA, Small Interfering, Fatty Acid-Binding Proteins, Uterine Cervical Neoplasms, Cell Proliferation, Apoptosis

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图/表（结果） 8

2.1 siRNA下调SiHa细胞FABP-5 mRNA的表达水平 RT-PCR结果显示，FABP-5-siRNA组FABP-5 mRNA相对表达量(0.23±0.06)与阴性对照组(0.74±0.10)和空白对照组(0.68±0.12)相比明显减少(P < 0.05)，抑制率为(71.36±1.25)%；而阴性对照组与空白对照组间FABP-5 mRNA表达差异无显著性意义(图1)。说明实验设计合成的干扰序列能特异性抑制FABP-5基因的表达。

2.2 shRNA下调SiHa细胞FABP-5蛋白的表达水平 Western blot检测结果表明，FABP-5-shRNA组FABP-5蛋白相对表达量(0.43±0.05)与阴性对照组(1.73±0.15)和空白对照组(1.68±0.19)相比明显减少(P < 0.05)，经软件Image J分析条带灰度值并计算抑制率为(72.68± 0.86)%；而阴性对照组与空白对照组间FABP-5 蛋白表达量无明显变化(图2)。说明实验设计合成的干扰序列能特异性抑制FABP-5蛋白的表达。

2.3 流式细胞术检测细胞宫颈癌SiHa细胞周期变化与阴性对照组和空白对照组相比，FABP-5-siRNA组G₁期细胞相比例降低(P < 0.05)，S期细胞比例升高(P < 0.05)，G₂/M期细胞比例升高(P < 0.05)。阴性对照组和空白对照组各细胞周期比例，差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1和图3。

2.4 CCK-8法检测宫颈癌SiHa细胞的增殖能力 CCK-8法检测结果表明，与阴性对照组和空白对照组相比，FABP-5-siRNA组细胞490 nm处的吸光度值在转染后24，48，72，96，120 h时均较低，差异有显著性意义(P < 0.05)，表明FABP-5-siRNA组细胞增殖明显受到抑制，见表2，图4。

2.5 Transwell小室侵袭实验检测宫颈癌SiHa细胞的体外侵袭力与阴性对照组(60.54±6.38)和空白对照组(58.33±6.43)穿过滤膜的细胞数量相比，FABP-5-siRNA组细胞穿膜细胞数明显减少(24.67±5.32)，差异均有显著性意义(P < 0.05)。实验结果证实特异性干扰FABP-5基因表达能够有效降低SiHa细胞的侵袭能力，见图5。

2.6 TUNEL染色观察宫颈癌SiHa细胞凋亡 TUNEL染色结果显示，与阴性对照组和空白对照组相比，FABP-5-siRNA组的细胞核被染成棕黄色的凋亡细胞数明显增多，其凋亡指数分别为(5.86±1.23)%，(6.26± 1.75)%和(38.64±6.84)%，与阴性对照组和空白对照组相比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图6。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点实验于2014年1月至2015年7月在天津医科大学动物实验中心完成。

1.3 材料人宫颈癌细胞系(SiHa)购自上海拜力生物科技有限公司；siRNA靶点设计、同时带有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein， GFP)和嘌呤霉素抗性筛选标记的3种FABP-5基因沉默重组慢病毒颗粒LV-shRNA-FABP-5(1，2，3)及对照空载体慢病毒颗粒(LV-shRNA-NC)均由上海吉凯基因技术有限公司提供；TRIzol购自Invitrogen公司；DMEM、PBS、胎牛血清均购自Hyclone公司；反转录试剂盒购自美国Fermentas公司；荧光定量PCR试剂盒购自大连宝生物工程(大连)有限公司；Western blot及IP细胞裂解液、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride， PMSF)、20×TBS缓冲液、BCA蛋白浓度测试试剂盒(增强型)、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)等均购于杭州碧云天生物科技公司；DNA Marker购自广州东盛生物科技有限公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；流式细胞仪购自德国Merck公司；碘化丙啶和RNase酶购自美国GIBCO公司；细胞侵袭实验采用Cell Invasion Assay Kit (Chemicon International Cat. No. ECM550)；FABP-5和GAPDH基因的引物由上海吉玛制药公司合成并通过测序验证；荧光显微镜购自奥林帕斯公司；凋亡试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗人FABP-5单克隆抗体购自美国Beckman Coulter公司；鼠抗人GAPDH单克隆抗体购自北京博奥森公司。

1.4 实验方法

1.4.1 宫颈癌SiHa细胞的培养和转染宫颈癌细胞株SiHa细胞培养于含体积分数为10%小牛血清、100 U/mL左氧氟沙星的DMEM培养基中，于37 ℃，体积分数为5%CO₂密闭式孵箱内培养、传代。随机选取处于对数生长期的宫颈癌SiHa细胞分为3组：FABP-5-siRNA组加入Lv-siRNA-FABP-5，阴性对照组加入LV-siRNA-NC，空白对照组常规培养。转染前12 h应用胰酶消化对数生长期的人宫颈癌细胞株SiHa细胞，所制得的细胞悬液接种于6孔板(细胞数约为5×10⁴)，于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱培养待细胞融合度达到20%-30%时进行转染，每孔均加以同等量聚凝胺(polybrene)及感染增强液，设定转染的感染复数(multiplicity of infection， MOI)为10，每组均设3个重复孔，LV-siRNA-FABP-5靶点序列5’-TGG GAA GGA AAG CAC AAT A-3’，阴性对照(Negative Control，NC)靶点序列5'-TTC TCC GAA CGT GTC ACG T-3'，最后在荧光倒置显微镜下观察结果，转染96 h后荧光最强，转染后四五天收获细胞。空白对照组以等量培养基代替转染体系，继续放入37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和湿度培养箱中培养。

1.4.2 RT-PCR检测FABP-5 mRNA表达细胞转染48 h后，以Trizol试剂盒提取宫颈癌SiHa细胞(4×10⁵细胞)的总RNA，进行定量，并按反转录试剂盒说明书步骤合成cDNA。Primer Primer 5.0软件设计引物，FABP-5上游引物：5’-TGA AGG AGC TAG GAG TGG GAA-3’，下游引物：5’-TGC ACC ATC TGT AAA GTT GCA G-3’，扩增片段212 bp；内参GAPDH上游引物: 5’-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3’，下游引物：5’-CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA-3’，扩增片段121 bp。每组细胞设计3个重复孔，每次实验重复3次，RT-PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，累计40个循环。所得PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪下观察，UVI 凝胶成像系统摄像，Image-Pro Plus 7.0软件分析条带灰度值，用FABP-5/GAPDH比值代表FABP-5 mRNA的相对表达量．

1.4.3 Western blot检测FABP-5蛋白表达细胞转染48 h后，人宫颈癌SiHa细胞弃去上清，加入1 μL PMSF裂解液，摇匀置于冰上裂解30 min，PBS冲洗细胞3次，提取总蛋白，应用BCA法测定蛋白浓度。吸取50 μg总蛋白，去离子水补至20 μL，入等体积2×上样缓冲液，99 ℃变性10 min。5%浓缩胶40 V衡压1 h，10%分离胶恒压60 V 3.5 h，湿转14 V恒压14 h，37 ℃摇床封闭2 h，分别加入1∶1 000稀释的FABP-5 一抗4 ℃过夜，次日用TBS-T(三乙醇胺缓冲盐水溶液)洗膜3次，每次10 min，洗膜后加入1∶5 000 HRP标记的二抗及GAPDH，37 ℃摇床孵育60 min。TBST洗膜5 min×4次，二甲基联苯胺显色，实验重复3次，用超敏ECL检测法观测。于暗室下曝光X射线片并冲洗胶片，UVI 凝胶成像系统摄像，Image-Pro Plus 7.0 软件分析所得图像并分析其条带灰度值。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.4.4 流式细胞术检测宫颈癌SiHa细胞周期分布将以上3组宫颈癌SiHa细胞培养在6孔板内，按4×10⁸L^-1的细胞浓度接种细胞，培养至细胞汇合，经胰酶消化后，用PBS洗涤3次，加入1 mL预冷的体积分数为70%乙醇，于4 ℃下固定过夜；再用PBS洗涤2次，调整细胞悬液浓度为1.0×10⁸ L^-1，接种于试管中，以细胞悬液∶碘化丙啶=1∶1加入适量碘化丙啶液，4 ℃室温下避光孵育30 min；加入缓冲液400 μL，用300目筛网过滤细胞悬液去除粘连的细胞；流式细胞仪分析DNA含量，软件分析G₀/G₁、S、G₂/M各期细胞数及所占比例。

1.4.5 CCK-8法检测宫颈癌SiHa细胞的增殖能力收集上述各组宫颈癌SiHa细胞，按4 000个/孔的细胞密度将宫颈癌SiHa细胞接种于96孔培养板上，加入含体积分数为10%胎牛血清DMEM培养基200 μL，每组设5个复孔，另设空白孔作为对照。在37 ℃，体积分数为5%CO₂饱和湿度培养箱中培养24 h后，每孔加入CCK-8 20 μL孵育4 h，酶标仪检测490 nm处的吸光度值，取5个复孔的平均数，绘制生长曲线。

1.4.6 Transwell小室侵袭实验检测宫颈癌SiHa细胞的侵袭能力加入体积分数为10%胎牛血清于聚合好的小室下做为条件培养液，于聚碳酸酯微孔滤膜上铺Matrigel 50 μg/孔，将上述3组细胞浓度为3×10⁵ L^-1的宫颈癌SiHa细胞悬液100 μL加入上室，放置于培养箱中，24 h后取出，以棉签仔细刮除滤膜上室中未穿过的宫颈癌SiHa细胞，40 g/L多聚甲醛固定10 min，用PBS轻轻漂洗3遍，苏木精染色10 min，PBS冲洗小室，待自然凉干，用手术刀片沿边缘小心取下上室的聚碳酸酯滤膜，以膜内面朝上用树脂胶固定于玻片上，封固；干燥后光镜下计数膜下表面的细胞。每张膜随机取5个视野计数穿膜细胞数，取其平均数。各组平行设3个小室，重复做3次，细胞侵袭率(%)=(穿膜细胞数/上室中接种的细胞总数)×100%。

1.4.7 TUNEL染色检测宫颈癌SiHa细胞的凋亡情况做SiHa细胞爬片，取对数生长期细胞分别转染脂质体、 pSi-scrambled和pSi-sur 72 h后吸弃培养液，自然晾干；40 g/L多聚甲醛溶液固定10 min，新鲜配制体积分数为3%H₂O₂室温处理，0.1%TritonX-100进行打孔，并按TUNEL试剂盒操作说明，DAB显色，苏木精轻度复染后应用梯度乙醇脱水，再以二甲苯进行2次透明，中性树胶封固后在显微镜下观测。每张切片随机取3个视野，每个视野内连续计数300个细胞，凋亡指数(%)=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%。

1.5 主要观察指标 ①RT-PCR、Western blot检测FABP-5 mRNA与蛋白表达。②流式细胞术检测宫颈癌SiHa细胞周期变化。③CCK-8法检测宫颈癌SiHa细胞的增殖能力。④Transwell小室侵袭实验检测宫颈癌SiHa细胞的侵袭能力。⑤TUNEL染色法检测宫颈癌SiHa细胞的凋亡情况。

1.6 统计学分析应用SPSS 16.0软件行统计学分析，所有数值以x(_)±s表示，两组间比较用t 检验(Student’s t test)，多组间连续变量间比较应用F 检验，双侧检验水准采用α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

研究发现肿瘤相关基因以及肿瘤基因通路的改变在肿瘤的形成与发展中起着重要作用。目前关于宫颈癌的治疗，研究最为热点的是生物治疗和基因治疗^[16-22]。RNA干扰是1998年Fire首先发现并命名的转录后水平的基因沉默机制。RNA干扰是指与靶基因序列同源的双链RNA诱发的序列特异性基因转录后的高效特异性降解沉默的现象^[23-26]。利用RNA干扰可导致靶基因mRNA降解和基因沉默，是存在于真核细胞内的一种自我保护现象^[27-31]。研究发现siRNA是双链RNA发挥RNA干扰作用的中心环节和效应分子^[32-35]。根据这一生理机制，依照靶基因mRNA所设计的序列特异性siRNA，可使特异性基因表达起到封闭的作用^[36-39]。实验借用RNA干扰技术的这一作用，诱导沉默FABP-5基因，观察FABP-5沉默后对肿瘤细胞的影响^[40-41]。

FABP-5是一类同源性极高的小分子胞内蛋白，属于脂结合蛋白超家族成员，由126-134个氨基酸组成，对脂肪酸有高度的亲和力，在哺乳动物肝脏中可高表达，广泛存在于脊椎动物和非脊椎动物的脂肪、脑、肠、心、骨骼肌等细胞中^[42-44]。FABP的配体范围很广，包括长链脂肪酸、溶血磷脂酸、血红素、脂肪酰辅酶A等^[45-46]。FABP与多种肿瘤的发生相关联，其可进入肿瘤细胞核内发挥其可能的调控功能。实验将siRNA干扰沉默后的FABP-5基因导入人宫颈癌SiHa细胞中，以观察其对宫颈癌SiHa细胞的抑制情况。

实验探讨了经siRNA干扰技术沉默FABP-5基因后对人宫颈癌SiHa细胞生物学特性的影响。通过RT-PCR和Western blot检测法观察到FABP-5- siRNA组FABP-5 mRNA和蛋白表达都明显下降。流式细胞术检测显示，FABP-5-siRNA组细胞的生长速度明显减慢，细胞周期阻滞在G₀/G₁期，S期细胞数减少，细胞增殖、侵袭能力显著下降，细胞凋亡率明显升高，提示FABP-5基因可能直接或间接参与宫颈癌细胞周期的调控。

综上所述，抑制宫颈癌细胞的增殖、侵袭，并促进其凋亡是治疗宫颈癌的重要步骤。特异性沉默FABP-5基因表达后显著降低了宫颈癌SiHa细胞的侵袭能力及增殖能力，使宫颈癌SiHa细胞凋亡显著增加。此结果可为体外人宫颈癌SiHa细胞导入靶向FABP-5基因的RNA干扰技术提供实验依据。对于FABP-5基因影响宫颈癌SiHa细胞的具体机制尚未明确，还需要进一步探讨研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程