巨噬细胞中脂多糖诱导微小RNA-155表达与地塞米松的抑制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.11.011

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

微小RNA：是长约22 nt的非编码RNA，广泛存在于从病毒到人类的各种生物中。这些小RNA能够与mRNA结合阻断蛋白编码基因的表达，防止它们翻译成为蛋白。科学家们发现，microRNA与结直肠癌等肠道疾病关系密切，而且能进入线粒体控制其基因表达。

脂多糖：是革兰阴性细菌细胞壁中的一种成分，对宿主有毒性，当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。其毒性成分主要为类脂质A，内毒素位于细胞壁的最外层、覆盖于细胞壁的黏肽上。各种细菌的内毒素的毒性作用较弱，大致相同，可引起发热及微循环障碍和内毒素休克并播散性血管内凝血等，内毒素耐热而稳定，抗原性弱。

背景：目前地塞米松对巨噬细胞中微小RNA-155表达的调控作用尚不明确。

目的：了解地塞米松是否调节巨噬细胞中微小RNA-155的表达。

方法：①脂多糖刺激小鼠巨噬细胞：体外培养小鼠巨噬细胞株Raw264.7细胞，予脂多糖刺激。分别在培养0，0.5，2，6 h收集细胞，检测miRNA-155的动态表达。②地塞米松对巨噬细胞的干预：实验分4组：对照组予磷酸盐缓冲液培养；脂多糖组予脂多糖刺激；地塞米松+脂多糖组予地塞米松和脂多糖共同作用；地塞米松组予地塞米松培养。6 h后收集培养上清用ELISA法检测培养液中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6等炎症因子表达，用实时荧光定量PCR法检测巨噬细胞中微小RNA-155的表达。

结果与结论：①脂多糖刺激Raw264.7巨噬细胞6 h后炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素6及微小RNA-155表达明显增加(P < 0.05)。②用地塞米松+脂多糖干预后炎症因子及微小RNA-155的表达轻度升高(P < 0.05)。③单独地塞米松处理组中炎症因子无明显变化(P > 0.05)，但微小RNA-155却明显减低(P < 0.05)。④结果说明地塞米松抑制脂多糖诱导的巨噬细胞中微小RNA-155的表达。

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ORCID: 0000-0003-0950-3571(王中华)

关键词: 组织构建, 组织工程, 微小RNA-155, 巨噬细胞, 地塞米松, 脂多糖, 炎症

Abstract:

BACKGROUND: It is unclear about dexamethasone effect on the regulation of microRNA-155 expression in macrophages.
OBJCTIVE: To explore whether dexamethasone can regulate the expression of microRNA-155 in macrophages.
METHODS: (1) Lipopolysaccharide stimulation of mouse macrophages: mouse macrophage cell lines, Raw264.7 cells, were cultured in vitro and stimulated by lipopolysaccharide. Cultured cells were collected at 0, 0.5, 2, 6 hours after culture to detect the dynamical expression of microRNA-155. (2) Dexamethasone intervention for macrophages: Macrophages were divided into four groups: control group treated with phosphate buffer; lipopolysaccharide group stimulated by lipopolysaccharide; combined group given intervention with dexamethasone and lipopolysaccharide; dexamethasone group cultured with dexamethasone. At 6 hours after culture, cell supernatant was collected to detect the expression of tumor necrosis factor α and interleukin-6 using ELISA method. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression of microRNA-155 in the Raw264.7 macrophages.
RESULTS AND CONCLUSION: Lipopolysaccharide significantly increased the expression of tumor necrosis factor α, interleukin-6 and microRNA-155 after 6 hours of culture (P < 0.05). Combined use of dexamethasone and lipopolysaccharide slightly increased the expression of tumor necrosis factor α, interleukin-6 and microRNA-155 (P < 0.05). Dexamethasone alone had no influence on the expression of tumor necrosis factor α and interleukin-6, but significantly decreased the expression of microRNA-155 (P < 0.05). These findings indicate that dexamethasone can inhibit the expression of microRNA-155 in the macrophages induced by lipopolysaccharide.

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王中华，王首红，吴岩，李宙，廖小龙，覃铁和. 巨噬细胞中脂多糖诱导微小RNA-155表达与地塞米松的抑制[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(11): 1591-1596.

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图/表（结果） 3

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引言

微小RNA(microRNA)是一组非编码RNA，其通过与靶基因3’端非编码区结合，从而调节靶基因的表达，在组织细胞的生长、分化、凋亡过程中发挥着重要作用，参与机体多种病理生理过程^[1]。微小RNA的生物学活性来源于成熟的微小RNA，它是由初级微小RNA经过一系列剪切和修饰后转变而来。首先，微小RNA基因在RNA聚合酶Ⅱ作用下编码出初级微小RNA，再通过剪切修饰后形成前体微小RNA，后进入细胞浆在Dicer酶作用下转变为长20-24个核苷酸的成熟微小RNA，它再与相应的酶及因子一起形成RNA诱导沉默复合物(RISC)。最后，该复合物以碱基互补配对的方式识别靶基因mRNA 3’端非编码区，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解或阻遏靶mRNA的翻译，从而实现转录后调控。

目前已明确在哺乳动物体内有近千种微小RNA存在，且微小RNA在机体内的分布存在器官特异性，每种微小RNA在不同器官组织中的表达不尽相同，在同一组织器官中不同疾病状态下表达也不同。不同微小RNA 作用于不同的靶基因发挥着不同的作用，同一微小RNA 也可以作用于不同的靶基因发挥效应^[2]。微小RNA通过对靶基因表达的影响参与肿瘤、心血管疾病、自身免疫性疾病及感染性疾病的调节，尤其在肿瘤的发生发展及侵袭中发挥重要作用。

近年对微小RNA-155(miRNA-155)研究较多，其作为多功能微小RNA参与了免疫、炎症及肿瘤等方面的调节^[3]。虽然对miRNA-155的研究更多集中在肿瘤方面，但也有不少研究提示miRNA-155在脓毒症的病理生理机制中发挥重要作用，其参与了脓毒症过度炎症反应和免疫抑制的病理过程，对miRNA-155的干预有望成为脓毒症治疗的新靶点。随着对脓毒症治疗研究的深入，类固醇激素在严重脓毒症治疗中的应用得到广泛认同。那么，作为免疫和炎症重要调节剂的地塞米松是合成类固醇激素中的经典药物，其是否对脓毒症中重要调控因子miRNA-155有调节作用目前还不清楚。此次研究通过检测脂多糖诱导下巨噬细胞中miRNA-155的表达情况，以及地塞米松干预作用后miRNA-155表达的变化，观察地塞米松对miRNA-155表达的影响，探索地塞米松抗炎及免疫调节可能存在的新机制。

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材料方法

1.1 设计单一样本观察。

1.2 时间及地点实验于2013年6月至2014年1月在中山大学中山医学院寄生虫学教研室完成。

1.3 材料小鼠巨噬细胞株Raw264.7购于中山大学细胞库。

1.4 实验方法

1.4.1 脂多糖刺激小鼠巨噬细胞将RAW264.7细胞接种于25 cm²培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5% CO₂培养箱中。对照组予磷酸盐缓冲液培养；实验组予脂多糖(100 μg/L)刺激。分别在培养0，0.5，2，6 h收集细胞提取RNA，检测miRNA-155的动态表达。

1.4.2 地塞米松对巨噬细胞的干预实验分4组：对照组予磷酸盐缓冲液培养；脂多糖组予脂多糖(100 μg/L)刺激；地塞米松+脂多糖组予地塞米松(0.5 mg/L)和脂多糖(100 μg/L)共同作用；地塞米松组予地塞米松 (0.5 mg/L)培养。6 h后收集培养上清检测肿瘤坏死因子α、白细胞介素6等炎症因子表达，收集细胞提取RNA。

1.4.3 ELISA检测细胞因子分泌收集刺激后6 h的培养上清。按ELISA试剂盒说明操作，向96孔板中加入细胞培养上清100 μL，室温孵育0.5 h后洗板3次，加入亲和素标记辣根过氧化物酶100 μL，室温孵育1 h后洗板3次，加入底物液100 μL，室温避光15 min后加入2 mol/L H₂SO₄ 终止，450 nm波长检测吸光度A值。

1.4.4 总RNA提取和实时荧光定量PCR 按Trizol法提取RNA试剂盒说明书进行，向经刺激的巨噬细胞约1×10⁶中加入1 mL Trizol，并用带1 mL无菌枪头的移液器反复吹打至细胞完全溶解；然后加入氯仿0.2 mL，混匀，室温静置15 min后低温(4 ℃)，12 000 r/min，离心15 min；小心移取上清到另一无菌的新eppendof管中，加入异丙醇0.5 mL，摇匀；室温静置沉淀RNA，10 min 后4 ℃，12 000 r/min，离心10 min。小心移去上清，沉淀用体积分数75%乙醇洗2遍后4 ℃，8 000 r/min，离心5 min后小心弃上清，留沉淀室温晾干5-10 min，再用RNAase水溶解RNA。

MiRNA-155的反转录和实时荧光定量PCR引物：茎环引物，5’-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA CCC CT- 3’，正意义链F：5’-GCC CGC TTA ATG CTA ATT GTG AT-3’，反意义链R：5’- GTG CAG GGT CCG AGG T-3’，由北京鼎国生物科技有限公司合成。

MiRNA-155的反转录反应：反应体系总体积取 20 μL，包括反转录5×缓冲液4 μL、dNTP 2 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，miRNA-155茎环结构反转录引物 2 μL(60 nmol/L)、AMV反转录酶10 U、总RNA样品2 μg， DEPC水加至20 μL。反转录反应条件：室温10 min， 42 ℃ 60 min，之后冰上2 min。行实时荧光定量PCR：反应体系总体积取20 μL，包括SY BR Green MIX 9 μL、miRNA特异引物(5 μmol/L) 2 μL、miRNA反转录产物2 μL、DEPC水加至20 μL；以细胞内有小核RNA U6为内参，扩增条件如下：95 ℃预变性10 min， 95 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸60 s，40个循环。结果以相对表达倍数表示。

1.5 主要观察指标 ①脂多糖诱导巨噬细胞中miRNA-155的表达。②炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素6表达情况。③地塞米松对巨噬细胞miRNA-155表达的影响。

1.6 统计学分析实验数据采用SPSS 19.0软件处理。各组间测定结果以x(_)±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

脓毒症作为感染引起的全身炎症反应综合征其主要机制是机体失控性炎症反应和免疫功能障碍，造成机体组织结构和功能改变从而最终导致多器官功能障碍综合征，是危重病领域所面临的一个棘手问题，其导致的脓毒症休克和多器官功能障碍综合征已经成为危重病人的主要死亡原因，死亡率高达50%-90%，是当今危重症领域研究的重点和难点^[4]。其机制复杂涉及细胞内多条信号转导通路的活化，包括基因、非编码RNA、蛋白质和代谢小分子等多个调控元件构成的复杂网络调控系统，是一个极为复杂的过程。近年来，随着对非编码RNA中微小RNA病理生理作用认识的深入，其在脓毒症发病过程中的作用也日益受到重视。尤其是miRNA-155、miRNA-125、miRNA-146等在脓毒症发病过程的调节作用倍受关注。

其中，miRNA-155作为微小RNA家族成员之一，最先在淋巴瘤中被发现，并被证实能促进淋巴瘤的发生和发展^[5]。研究发现，miRNA-155不仅参与血液系统肿瘤的调节，而且还在肺癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、宫颈癌等实体瘤的发生、发展和侵袭过程中发挥重要作用^[6-10]。同样miRNA-155也参与了炎症、免疫等病理生理过程的调节^[11]。有研究证实，miRNA-155不仅促进树突状细胞的分化成熟，还影响其功能的发挥，因为miRNA-155基因缺失的树突状细胞的抗原呈递功能明显减弱，从而影响机体的免疫应答^[12]。另有学者发现，敲除miRNA-155基因后，小鼠B细胞的成熟发生障碍、淋巴滤泡生发中心减少、高亲和力的IgG1抗体产生减低^[12-13]。作者先前的研究显示，不同类型巨噬细胞中miRNA-155表达存在差异从而影响其免疫功能的发挥^[14]。当体内miRNA-155过度表达，往往导致免疫功能紊乱疾病的发生，譬如在硬皮病、系统性红斑狼疮，克罗恩病等自身免疫性疾病中表达异常增高。总之，miRNA-155在免疫系统相关组织和细胞的发育成熟以及其功能的发挥中起着重要调节作用。

同样，miRNA-155在炎症过程中的调控作用也很明显，其通过以脓毒症相关信号通路中的关键分子为靶点，影响其下游信号因子的表达，从而调节炎症因子的释放。Tili等^[15]发现，对脂多糖介导的感染性休克，miRNA-155高表达的转基因小鼠更敏感，原因是miRNA-155对Fas死亡结构域相关蛋白抗原(FADD)、IκB激酶家族(IKKε)等的作用使炎症因子的表达增加。此外，miRNA-155以白细胞介素13受体α为靶点，减少其表达影响保护性抗炎递质白细胞介素13功能的发挥，以至加重机体的炎症损伤^[16]。一方面miRNA-155影响炎症因子表达，另一方面炎症因子反过来也可以调节miRNA-155的表达，比如白细胞介素10作为抗炎因子能通过对Toll样受体4(toll-like receptor4 TLR4)信号途径的阻断，抑制miRNA-155的表达^[17]；然而肿瘤坏死因子α、干扰素-γ等促炎因子能明显增加巨噬细胞中miRNA-155的表达^[18]，这与它们能使促炎转录因子核因子κB 和 AP-1表达增加，促进含有初级miRNA155基因的BIC基因表达有关^[19]。可见，部分炎症因子和miRNA-155的表达在炎症过程中相互促进，从而启动炎症信号的“瀑布”效应以至出现脓毒症炎症反应的失控状态。本研究显示，脂多糖在增加巨噬细胞中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6表达的同时也促进了miRNA-155的表达，这可能与脂多糖激活TLR4有关，因为有研究表明TLR4的激活能明显增加miRNA-155的表达^[20]。另外miRNA-155可以通过调节Bach1， SHIP1，C/ebpβ 和SOCS1等靶基因的表达，参与炎症过程的调控^[21-24]。因此，miRNA-155在炎症和免疫调理过程中发挥着重要作用，参与了脓毒症发生发展的病理过程。对miRNA-155进行干预，将有望成为脓毒症治疗的新切入点。

地塞米松是合成肾上腺皮质激素，可通过与细胞核受体结合抑制炎症因子基因的表达，具有较强的抗炎、抗过敏、抗休克效应，在抑制炎症和调节免疫反应中发挥着重要的作用^[25]。地塞米松对炎症免疫重要调节因子miRNA-155表达的调控研究较少。此次研究显示，地塞米松能明显减少脂多糖诱导的巨噬细胞炎症因子的表达，与既往的研究类似，这可能与地塞米松调节NF-kB、PI3K/Akt 及 MAPK等信号通路有关^[26-28]。另外，本研究还发现，地塞米松同样使巨噬细胞中脂多糖诱导的miRNA-155表达明显减低，作者推测其机制可能是地塞米松通过减少炎症因子表达，从而使miRNA- 155表达下降。不仅如此，研究结果还表明地塞米松在不减少巨噬细胞炎症因子基础表达的同时能使miRNA-155表达明显低于基础表达量。这提示地塞米松对miRNA-155表达的抑制不仅仅是通过对炎症因子表达的影响来实现，还可能直接通过对miRNA-155基因表达的抑制来发挥作用。由此可见，地塞米松可通过影响miRNA-155表达实现对机体炎症和免疫过程的调节。

此次研究率先证实了地塞米松能抑制巨噬细胞中miRNA-155的表达。这可能是地塞米松调节免疫和炎症反应的一个新的机制，为地塞米松在炎症及免疫性疾病中的应用提供了新的理论支持。至于地塞米松对miRNA-155表达抑制的具体途径还需进一步研究。

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