miR-25对P19细胞向心肌细胞分化的影响及机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.11.010

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

微小RNA：肿是内源性的非编码单链小RNA，它通过与靶基因mRNA 3’UTR区域结合，引起mRNA降解或阻止其翻译从而调控基因表达。一个miRNA可以调控众多基因的表达，几个miRNA也可以组合来精细调控某个基因的表达。据报道目前总共有16,772个miRNA，miRNAs几乎参与了每一个生物学过程。

心肌细胞：又称心肌纤维，有横纹，受植物性神经支配，属于有横纹的不随意肌，具有兴奋收缩的能力。呈短圆柱形，有分支，其细胞核位于细胞中央，一般只有一个。各心肌纤维分支的末端可相互连接构成肌纤维网。广义的心肌细胞包括组成窦房结、房内束、房室交界部、房室束(即希斯束)和浦肯野纤维等的特殊分化了的心肌细胞，以及一般的心房肌和心室肌工作细胞。

背景：既往研究发现，miR-25在向心肌分化的P19细胞中的表达水平显著低于其在未分化的P19细胞中的表达水平，但是其对心脏发育的影响及其机制尚不明确。

目的：探索miR-25对P19细胞向心肌细胞分化的影响及其机制。

方法：体外培养P19细胞并向心肌细胞诱导分化。通过实时反转录PCR检测miR-25在向心肌分化的和未分化的P19细胞中的表达水平。通过脂质体转染构建miR-25过表达的P19细胞，观察miR-25对P19细胞向心肌细胞分化的影响。通过miRNA靶基因预测数据库预测miR-25的靶基因，并利用荧光素酶报告基因实验检测miR-25对Pax3的靶向作用，沉默Pax3，观察Pax3对P19细胞向心肌细胞分化的影响。

结果与结论：miR-25在分化的P19细胞中表达水平较低。miR-25过表达能够促进P19细胞向心肌细胞分化。靶基因预测分析Pax3为miR-25潜在的靶基因，荧光素酶实验进一步证实Pax3是miR-25的直接靶点，Pax3沉默促进P19细胞向心肌细胞分化。提示miR-25通过靶向Pax3促进P19细胞向心肌细胞分化，为心脏发育以及先天性心脏病的防治提供新的线索和理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0002-7557-8873(李连冲)

关键词: 组织构建, 组织工程, 心肌细胞, miR-25, P19细胞, 分化, 先天性心脏病, Pax3

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have found that the expression level of miR-25 in differentiated P19 cells is significantly lower than that in undifferentiated P19 cells. However, the effect of miR-25 on cardiomyogenesis and the relevant mechanism remain unclear.
OBJECTIVE: To explore the effect and mechanism of miR-25 on the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes.
METHODS: P19 cells were cultured and differentiated into cardiomyocytes in vitro. The expression of miR-25 in differentiated and undifferentiated P19 cells was detected by real-time PCR. miR-25-overexpressing P19 cells were constructed by lipofection transfection, and were used to investigate the effect of miR-25 on the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes. MicroRNA target analysis tools were used to explore potential targets of miR-25, and dual luciferase reporter assay was used to identify whether the 3’UTR of Pax3 mRNA was a binding target of miR-25. In addition, we transfected P19 cells with Pax3 shRNAs to silence the expression of Pax3, and investigated the effect of Pax3 on the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes.
RESULTS AND CONCLUSION: Expression level of miR-25 in differentiated P19 cells was obviously down-regulated compared with that in undifferentiated P19 cells. miR-25 overexpression promoted the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes. By target prediction analysis, we confirmed that Pax3 was a potential target gene of miR-25. Luciferase assay further confirmed that miR-25 targeted Pax3 directly. Moreover, knockdown of Pax3 promoted the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes. Taken together, miR-25 promotes the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes by targeting Pax3. These findings offer new clues and theoretical basis for cardiomyogenesis and prevention and cure of congenital heart disease.

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图/表（结果） 4

2.1 miR-25在分化的P19细胞中低表达通过RT-PCR检测miR-25在P19细胞诱导分化0 d和第10天中的表达水平，结果显示miR-25在P19细胞分化第10天的表达水平显著低于其在0 d中的表达水平(P < 0.01；图1)，和Hu等^[32]报道的结果相一致。

2.2 miR-25过表达促进P19细胞向心肌细胞分化结果显示miR-25过表达的P19细胞相比于对照组有明显较高的cTnT、GATA4和ANP蛋白表达水平，这表明了miR-25能够促进P19细胞向心肌细胞的分化进程(图2)。

2.3 荧光素酶实验检测 miR-25对Pax3的靶向作用 Pax3 mRNA的3’UTR与miR-25的种子区存在理论上的互补配对序列，见图3A。发现共转染Pax3野生型的实验组的荧光素酶活性明显低于对照组的荧光素酶活性(P < 0.01)，而共转染Pax3突变型的实验组与对照组的荧光素酶活性无显著差异，这证实miR-25可以直接作用于Pax3(图3B)。

进一步实验，研究转染miR-25模拟物和miRNA模拟物对照对P19细胞中Pax3 mRNA和蛋白表达量的影响。结果显示转染miR-25模拟物明显降低了Pax3 mRNA和蛋白的表达水平(P < 0.01；图3C和D)。以上结果均表明在P19细胞中，miR-25能够直接靶向Pax3。

2.4 Pax3沉默促进P19细胞向心肌细胞分化通过脂质体转染沉默Pax3的表达，然后诱导其分化，在分化的第10天，采用免疫印迹检测心肌分化相关标志物cTnT、GATA4和ANP蛋白的表达。结果显示Pax3沉默组与对照组相比有明显较高的cTnT、GATA4和ANP蛋白表达水平，这表明了Pax3沉默促进P19细胞向心肌细胞分化(图4)。Pax3沉默与miR-25过表达对P19细胞分化的影响一致。

以上结果表明Pax3是miR-25的一个直接靶，miR-25对P19细胞向心肌细胞分化的影响依赖于Pax3。

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引言

先天性心脏病是最常见的先天畸形之一，在中国的发病率为0.7%-0.8%，中国每年新增加的先天性心脏病患儿大约15万^[1]。据报道先天性心脏病发病的主要原因是胚胎干细胞向心肌细胞分化的过程受损，而基因因素对该受损过程的发生起了重要作用^[2-3]。心脏是脊椎动物胚胎发育最早形成并发挥功能的重要器官，其形成是一个极其复杂而精密的过程，包括遗传调控程序在空间和时间上相互协调，许多相关基因的顺序表达以及多条信号通路(如Wnt信号通路、FGF信号通路、骨形态发生蛋白信号通路、Notch信号通路等)的激活和精确调控，其中任意基因的缺失或突变都可能会导致心脏发育畸形^[4]。因此，从基因和分子水平上来探索心脏的形成和发育机制为先天性心脏病的预防和治疗提供了新的方向。

微小RNA(miRNA)是由19-23个核苷酸组成的非编码的小RNA分子，它通过与靶基因mRNA 3’UTR区域结合，引起mRNA降解或阻止其翻译从而调控基因表达。生物信息学分析表明每个miRNA调控成百上千基因，而且miRbase数据库(www.mirbase.org)公布的数据显示目前共发现16 772个miRNAs，这也从侧面表明了miRNAs几乎参与了每一个生物学过程^[5-6]。已有研究证实miRNAs参与并调控时序发育、细胞增殖、分化、凋亡、衰老以及激素分泌等多种生理过程^[7-8]。很多研究也报道了miRNAs在人类各种疾病的发生、发展和预后中发挥着重要的作用^[9-20]。目前，它们在心肌细胞分化以及心脏发育过程中的重要作用受到了广泛关注。越来越多的研究证实miRNAs对心脏发育起着重要的调控作用^[21-25]。但是miRNAs致胚胎心脏发育畸形的精确机制尚未阐明，因此继续发掘新的与心脏发育相关的miRNAs，寻找其下游的靶分子，并探究其对心脏发育的分子调控机制依旧非常重要。

P19细胞从C3H/He雄性小鼠的畸胎瘤中分离获得，是一种能够在体外培养的多能干细胞，具有自我复制和分化的潜能。在低浓度的二甲亚砜诱导下，P19细胞可分化为心肌样细胞，这一过程被用于模拟心脏发育，目前已经作为心肌细胞模型广泛应用于心脏发育的分子机制研究中^[26]。因此在本研究选择P19细胞作为研究对象。

miR-25是近期受到广泛研究的miRNA，其在多种疾病中发挥重大的作用，尤其是在癌症中。已有研究报道miR-25促进胆管癌、卵巢癌、胃癌、食管鳞癌、宫颈癌、胶质瘤等恶性肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移^[27-31]。此外，也有研究报道miR-25在已分化的P19细胞的表达水平明显低于其在未分化的P19细胞中的表达水平，但是其对心脏发育的影响及其机制尚未有报道^[32]。实验首先检测miR-25在未分化的和诱导分化第10天的P19细胞中的表达水平，接下来脂质体转染构建过表达的miR-25 P19细胞，诱导分化，通过检测心肌分化相关标志物cTnT、GATA4和ANP的表达，鉴定其对P19细胞分化的作用，随后通过靶基因预测，荧光素酶实验等初步探讨其可能的作用机制。

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材料方法

1.1 设计细胞分子生物学体外实验。

1.2 时间及地点实验于2014年1月至12月在郑州颐和医院病理科完成。

1.3 材料 P19细胞购自美国菌种保藏中心。

实验试剂及仪器：α-MEM培养基胎牛血清(美国Gibco公司)；二甲亚砜 (美国Sigma公司)；0.25%胰蛋白酶(德国Miltenyi Biotec公司)；U6和GAPDH(上海诺伦生物医药技术有限公司)；Lipofectamine 2000转染试剂盒，One Step PrimeScript^® miRNA cDNA Synthesis Kit和GeneTailorTMSite-Directed Mutagenesis System 试剂盒(美国GeneCopoeia公司)；cTnT抗体、GATA4抗体、ANP抗体、GAPDH抗体和辣根过氧化物酶标记二抗(英国Abcam公司)；miRNA模拟物对照，miR-25模拟物，Pax3 shRNA和shRNA对照(西安沃尔森生物技术有限公司)；SYBR^® Premix Ex Taq^TMⅡ，RNAiso Plus和RNAiso for small RNA(宝生物工程(大连)有限公司)；Chromo4^TM实时定量PCR仪(上海智中实验室设备有限公司)；硝酸纤维素膜(北京索莱宝科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 P19细胞培养及向心肌细胞的诱导分化基础培养基为α-MEM完全培养基，其中包含体积分数10%胎牛血清、100 mg/L链霉素和100 U/mL青霉素，将P19细胞置于该培养液中于37 ℃、体积分数5%CO₂孵箱中培养，每隔2 d换一次培养液，待细胞汇合度达到约90%时，用0.25%胰蛋白酶进行消化，并依据细胞的生长情况按一定比例传代培养。基础培养基中添加1% 二甲亚砜即为诱导培养基。将消化后的单个P19细胞进行计数，按3.7×10⁵细胞密度接种于直径为60 mm含有诱导培养基的细胞培养皿内，于37 ℃、体积分数5%CO₂孵箱中培养，每隔2 d换1次培养液。诱导当天记为第0天。诱导6 d后去除二甲亚砜，继续培养，每隔2 d换1次培养液^[33]。

1.4.2 细胞转染选取对数期生长状态良好的P19细胞，以3×10⁵/孔的密度接种到6孔培养板中，孔中均加有不含抗生素的培养液，置于37 ℃、体积分数5%CO₂孵箱中培养。待细胞融合度达到约50%，严格按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书进行转染，将miR-25模拟物对照(miR-control)、miR-25模拟物(miR-25 mimics)、Pax3 shRNA(shPax3)和对照(sh-control)转染至P19细胞内，转染24 h后更换新鲜的培养液。

1.4.3 实时反转录PCR(RT-PCR) 取检测的细胞，分别加入RNAiso Plus或RNAiso for small RNA提取总RNA或总miRNA，用琼脂糖凝胶电泳测其质量，紫外分光光度计测其浓度和纯度，用无RNA酶水稀释为1 g/L。然后依照One Step PrimeScript^® miRNA cDNA Synthesis Kit说明书进行反转录得到cDNA，将其稀释4倍，然后加入SYBR^® Premix Ex Taq^TMⅡ，miR-25以U6作为内参基因，Pax3 mRNA以GAPDH作为内参基因，在Chromo4^TM实时定量PCR仪上进行定量，结果采用Opticon-3软件进行分析^[34]。

1.4.4 免疫印迹通过脂质体转染构建miR-25过表达的细胞和对照细胞，然后诱导其分化，在分化的第10天，采用免疫印迹检测两组细胞中心肌分化相关标志物cTnT、GATA4和ANP蛋白的表达。

提取细胞样本的总蛋白，定量，取等量的蛋白用10%的分离胶进行电泳。电泳结束之后，在冰浴下100 V转至硝酸纤维素膜上，转膜2 h。然后使用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入相对应的一抗4 ℃孵育过夜，使用TBST洗涤3次，每次15 min。接着加入二抗，37 ℃孵育 1 h，使用TBST洗涤3次，每次20 min，于暗室中进行压片，然后显影、定影。

1.4.5 miR-25靶基因预测采用TargetScan、DIANA 和miRanda 3个miRNA靶基因预测数据库对miR-25的靶基因进行预测。

1.4.6 荧光素酶实验将预测结果进行比对之后，选取被3个数据库都预测到的靶基因作为备选，进而选得Pax3为靶基因。将Pax3 3’UTR的PCR扩增产物连接到pGL3质粒Xbal I酶切位点，构建野生型pGL3-WT-Pax3

报告基因质粒。采用GeneTailor^TMSite-Directed Mutagenesis System 试剂盒，突变Pax3 3’UTR序列内的结合位点，构建突变型pGL3-MUT- Pax3真核表达载体。取P19细胞分别转染为以下4组：①Pax3野生型质粒：对照组(转染野生型Pax3质粒和miRNA模拟物对照)、实验组(转染野生型Pax3质粒和miR-25模

拟物)。②Pax3突变型质粒：对照组(转染突变型Pax3质粒与miRNA模拟物对照)、实验组(转染突变

型Pax3质粒与miR-25模拟物)。细胞转染24 h后，按照Dual-Luciferase Reporter System说明检测的荧光素酶活性。

1.5 主要观察指标 ① miR-25对P19细胞向心肌细胞分化的影响。②荧光素酶实验检测miR-25对Pax3的靶向作用。③Pax3沉默对P19细胞心肌分化相关标志物cTnT、GATA4和ANP蛋白表达的影响。

1.6 统计学分析应用GraphPad Prism 5统计软件处理数据，结果以x(_)±s表示，组间比较采用 t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

先天性心脏病是一种心脏及其大血管先天畸形的疾病，在活产婴儿中发生率约为8‰，是婴幼儿死亡最主要的原因之一^[35]。多年来，先天性心脏病已经引起了科学家的高度重视，并一直致力于研究其发生的潜在病因。但是每年围产期死亡中仍有约40％是由先天性心脏病导致的，其中有1/5死于出生后的第1个月^[36]。因此，从基因和分子水平上探究先天性心脏病的病因以寻找有效的预防和治疗措施成为了新的突破点。
近几年来，miRNAs凭借其性质稳定、含量丰富、易于发现以及疾病特异性等特点，成为了分子生物学研究的热点^{[37- 38]}。目前越来越多的研究证实miRNAs对心脏发育起着重要的调控作用。Wagh等^[22]报道了，在人胚胎干细胞向心肌前体细胞分化过程中，miRNA-363通过调节心脏和神经嵴衍生基因HANDl的表达从而影响心肌细胞的特化。Li等[21]发现降低miR-1的表达能够缓解对细胞骨架调节蛋白twinfilin-1的抑制作用，促进心肌肥厚的发生，而将miR-1-2敲除，小鼠易发生大面积室间隔缺损，导致出生后很快死亡。Ventura等^[23]发现miR-17-02基因簇功能缺失可导致新生小鼠体积较小而且很快死亡，这可能是因为缺乏miR-17-02基因簇的小鼠存在室间隔缺损及肺发育不全。Chen等[24]报道了miR133过表达导致爪蟾的胚胎心脏在发育过程中不能正常的环化形成心腔。Morton等[25]发现miR-138的敲除导致了斑马鱼的心肌细胞发育异常以及心室功能障碍。虽然越来越多的miRNAs被发现与心脏发育畸形相关，但是具体的致畸机制并不完全清楚。
miR-25是近期受到广泛研究的miRNA，其在多种疾病中发挥重大的作用。近期有研究报道miR-25在已分化的P19细胞的表达水平显著低于其在未分化的P19细胞中的表达水平^[32]。推测可能对胚胎心脏发育具有一定的作用，但是其对心脏发育的影响及其机制尚未有报道。因此此次研究首先检测miR-25在诱导分化0 d和第10 天的P19细胞中的表达水平，证实miR-25在诱导分化第10 天P19细胞的表达水平确实明显低于其在分化0 d的表达水平，接下来脂质体转染构建过表达的miR-25 P19细胞，诱导分化，通过检测心肌分化相关标志物cTnT、GATA4和ANP的表达，发现miR-25能够促进P19细胞向心肌细胞分化，随后又进一步探索其可能的作用机制。
通过3个靶基因预测数据库预测得到Pax3为miR-25潜在的靶基因，Pax3 mRNA的3’UTR与miR-25的种子区存在理论上的互补配对序列。Pax基因是一个进化上高度保守的基因家族，普遍存在于各种生物体中，其表达的蛋白是重要的转录调控因子。研究报道Pax3是胚胎发育时期的重要转录调控因子，调控人胚胎早期胃组织、小肠肌层、小肠黏膜、脊髓等的生长发育[39-41]。Li等[42]报道了诱导Pax3表达能够阻碍心肌分化。以上发现是作者选取Pax3进行继续研究的原因。
此次研究通过荧光素酶实验证实了Pax3的确是miR-25的一个直接靶基因。此外，还检测了miR-25模拟物与miRNA模拟物对照转染的P19细胞中的Pax3的表达量，发现转染miR-25模拟物明显降低了Pax3 mRNA和蛋白的表达水平，进一步证实了miR-25对Pax3具有直接的作用。又进一步执行实验探究miR-25促进P19细胞向心肌细胞分化是否通过靶向Pax3起作用。利用脂质体转染沉默Pax3的表达，然后诱导其分化，发现Pax3沉默促进P19细胞向心肌细胞分化，这与miR-25过表达对P19细胞分化的影响一致。因此，得出结论，miR-25通过靶向Pax3促进P19细胞向心肌细胞分化。
先天性心脏病的发生是一个复杂的过程。通过对P19细胞向心肌细胞分化进行研究，以期在细胞层面上获得miR-25在P19细胞向心肌细胞分化中的作用及其机制，为心脏发育以及先天性心脏病的防治提供新的线索和理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程