亚砷酸钠对人永生化角质形成细胞株恶性转化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.11.009

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

人永生化角质形成细胞株：HaCaT细胞来源于正常成人皮肤角质形成细胞,通过体外在低钠离子浓度和室温条件下长期培养而自发永生化建立的角质细胞系。目前对于HaCaT细胞自发永生化的确切机制尚不了解，但已有的研究表明这是一个逐渐发生的多步骤基因改变的过程，主要是细胞沉默基因的失活和永生化基因的激活。

亚砷酸钠颗粒：砷以不同晶格结构的类金属形式存在于自然界，但更容易发现的形式是砷化物与砷酸盐化合物。砷与其化合物被运用在农药、除草剂、杀虫剂与许多种的合金中，可通过饮水、食物和空气等进入人体。大量流行病学调查表明，长期摄入砷化物可引起多种癌症，其中最常见的是皮肤癌、肺癌和膀肮癌，因此，砷化物已被国际癌症协会确认为人类确定致癌物。

背景：有研究发现亚砷酸钠可以引起HaCaT细胞的恶性转化，并具有致瘤性，但关于低浓度亚砷酸钠是否引起HaCaT细胞发生恶性转化的研究不多。

目的：分析亚砷酸钠对HaCaT细胞恶性转化的影响。

方法：将HaCaT细胞加入不同浓度的亚砷酸钠进行培养，MTT测定亚硫酸钠对HaCaT细胞形态和增殖能力的影响，流式细胞术测定亚硫酸钠对HaCaT细胞周期的影响，软琼脂集落形成实验测定亚硫酸钠对HaCaT细胞克隆形成能力的影响。

结果与结论：①5 mol/L亚砷酸钠对HaCaT细胞生长没有影响，但10和50 mol/L亚砷酸钠抑制HaCaT细胞生长。②HaCaT细胞经0.1 mol/L亚砷酸钠处理后，传代培养至第20代时，HaCaT细胞的形态没有明显改变，第25代时，细胞体积增大，有多个核仁，有不断增殖趋势。③与原代细胞相比，经0.1 mol/L亚砷酸钠处理后传至第15及25代HaCaT细胞S期细胞和G₂/M期细胞所占比例增加，增殖能力增强，克隆形成率增加，且第25代HaCaT细胞的增殖能力和克隆形成率高于第15代。④实验结果说明，高浓度亚砷酸钠降低HaCaT细胞的活力，低浓度亚硫酸钠对HaCaT人永生化皮肤角质形成细胞的细胞形态、细胞周期、增殖能力以及克隆形成能力均有一定的影响，随着传代的增加，人永生角质形成细胞增殖能力和克隆形成能力不断增强。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0002-1962-373X(李艳玲)

关键词: 组织构建, 组织工程, 亚砷酸钠, 人永生化角质形成细胞, 恶性转化, 细胞形态, 细胞周期, 增殖, 克隆

Abstract:

BACKGROUND: Studies have found that sodium arsenite can cause the malignant transformation and tumorigenicity of HaCaT cells, but whether low concentrations of sodium arsenite can cause the malignant transformation is rarely reported.
OBJECTIVE: To study the effect of sodium arsenite on the malignant transformation of human immortalized keratinocyte cell lines.
METHODS: HaCaT cells were treated with different concentrations of sodium arsenite. MTT assay was used to determine the effect of sodium arsenite on HaCaT cell morphology and proliferation, flow cytometry used to detect the effect of sodium arsenite on HaCaT cell cycle, and soft agar colony formation experiments assay used to determine the effect of sodium arsenite on HaCaT cell colony formation capacity.
RESULTS AND CONCLUSION: HaCaT cells grew well when the concentration of sodium arsenite was 5 mol/L, but the cell growth was inhibited under intervention with 10 and 50 mol/L sodium arsenite. HaCaT cells treated with 0.1 mol/L sodium arsenite were passaged to the 20th generation, and cell morphology had no notable changes; cells at passage 25 exhibited enlarged size and multiple nucleoli, which had a continued proliferation trend. Compared with the primarily cultured cells, 0.1 mol/L sodium arsenite-treated HaCaT cells at passages 15 and 25 had an increased proportion at S phase and G2/M phase, with strengthened proliferation ability and increased colony-forming efficiency, and moreover, the proliferation ability and colony-forming efficiency of passage 25 cells were higher than those of passage 15 cells. These experimental data show that high concentrations of sodium arsenite reduce HaCaT cell viability, and low concentrations of sodium sulfite have a certain influence on the morphology, cell cycle, proliferation ability and colony-forming efficiency of HaCaT cells, and moreover, the proliferation ability and colony-forming efficiency of human immortalized keratinocytes will be strengthened with the increase of passage.

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图/表（结果） 5

2.1 不同浓度亚砷酸钠对HaCaT细胞活力的影响正常(0 mol/L)HaCaT细胞贴壁生长良好，5 mol/L亚砷酸钠干预的HaCaT细胞贴壁生长也比较好，10mol/L亚砷酸钠干预的HaCaT细胞贴壁减少，50 mol/L亚砷酸钠干预的HaCaT细胞全部死亡。可见亚砷酸钠浓度在10 mol/L以下时对HaCaT细胞的活力没有太大影响，亚砷酸钠浓度大于10 mol/L时HaCaT细胞的活力下降(图1)。

2.2 低浓度亚砷酸钠对HaCaT细胞形态的影响 HaCaT细胞经0.1 mol/L亚砷酸钠处理后，传代培养至第20代时，HaCaT细胞的形态没有明显改变，传代培养至第25代时，HaCaT细胞一部分细胞体积增大，有多个核仁，出现重叠生长现象，有不断增殖趋势。HaCaT细胞经0 mol/L亚砷酸钠处理后(对照组)，细胞形态均一，呈梭形或椭圆形，细胞核为一个核仁(图2)。

2.3 低浓度亚砷酸钠对HaCaT细胞周期的影响细胞仪检测结果显示，HaCaT细胞经0.1 mol/L亚砷酸钠处理后，传代至第15-25代时HaCaT细胞中处于S期和G₂/M期的细胞比例高于经0 mol/L亚砷酸钠处理的细胞(原代组)(表1)。

2.4 低浓度亚砷酸钠对人永生角质形成细胞增殖能力的影响 MTT结果显示，HaCaT细胞经0.1 mol/L亚砷酸钠处理后，传至15-25代时增殖能力高于原代组(P < 0.05)，传代至第25代时HaCaT细胞的增殖能力高于第15代(P < 0.05)，表明经低浓度亚砷酸钠处理后，HaCaT细胞的增殖能力增强，随着传代的增加，HaCaT细胞增殖能力有不断增强趋势(表2)。

2.5 低浓度亚砷酸钠对人永生角质形成细胞集落形成的影响软琼脂集落形成实验结果显示，HaCaT细胞经0.1 mol/L亚砷酸钠处理后，第15及25代时HaCaT细胞的克隆形成率明显高于原代和第5代(P< 0.05)，第5代时HaCaT细胞的克隆形成率和对照组接近(P > 0.05)，第25代时HaCaT细胞的克隆形成率高于第15代(P < 0.05)，表明经低浓度亚砷酸钠处理后，HaCaT细胞的克隆形成能力增强，随着传代的增加，HaCaT细胞克隆形成能力有不断增强趋势(表3)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照细胞学实验。

1.2 时间及地点实验在2014年5月至2015年7月在河北医科大学第二医院实验室完成。

1.3 材料人永生化皮肤角质形成细胞株HaCaT由上海细胞生物所提供。

亚砷酸钠购自美国Sigma公司，以蒸馏水45 mL溶解11.7 g亚砷酸钠，滤膜过滤，保存备用。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养与传代将HaCaT细胞培养于DMEM培养基(美国Sigma公司)中，每2 d换液1次，待细胞生长至90%以上融合时，进行传代培养，胰蛋白酶(美国Gibco公司)进行消化，加入DMEM培养液终止消化，吹打细胞制成HaCaT单细胞悬液。

1.4.2 细胞冻存与复苏细胞铺满培养瓶时，吸去培养液，PBS(美国Hyclone公司)洗涤，胰酶进行消化，加入DMEM培养液终止消化，吹打制成HaCaT单细胞悬液，离心后弃去上清液，加入用DMEM∶胎牛血清∶DMSO=7∶2∶1配成的冻存液冻存液，置入冻存管中，-80 ℃保存。复苏时，将冻存管置于水浴箱中解冻，将细胞移至离心管中，离心，弃去上清液，接种于DMEM培养液中培养。

1.4.3 MTT测定亚硫酸钠对HaCaT细胞数量的影响将HaCaT人永生化皮肤角质形成细胞株接种到96孔板中，待细胞生长至90%以上融合时，加入浓度为0.1 mol/L(对照组)、5，10和50 mol/L的亚砷酸钠进行培养，24 h后加入MTT(美国Hyclone公司)继续培养 4 h，加入二甲基亚砜震荡，测定490 nm处的吸光值。取亚砷酸钠0.1 mol/L的剂量对HaCaT人永生化皮肤角质形成细胞株进行毒染培养，培养2 d后换液，4 d后开始传代培养，传代过程中亚砷酸钠(0.1 mol/L)始终在培养液中，显微镜(日本Olympus公司)下观察细胞形态的变化。

1.4.4 流式细胞术测定亚硫酸钠对HaCaT细胞周期的影响取对照组、用0.1 mol/L亚砷酸钠处理后的第15代及25代HaCaT细胞进行细胞周期的测定。取生长良好的对数生长期各组细胞，胰酶进行消化，PBS洗涤，乙醇(成都市科龙化工试剂厂)过夜固定，离心，PBS洗涤，加入RNA酶培养，离心，PBS洗涤，离心，加入PI染料染色，用流式细胞仪(美国BeetonDiekson公司)检测细胞周期。

1.4.5 MTT测定亚硫酸钠对HaCaT细胞增殖能力的影响取0 mol/L无亚砷酸钠处理(对照组)和0.1 mol/L亚砷酸钠处理的生长良好的HaCaT细胞接种于96孔板中，待细胞融合达90%以上时，加入MTT液，培养4 h，加入二甲基亚砜震荡，测定490 nm处吸光度值。

1.4.6 软琼脂集落形成实验测定亚硫酸钠对第15代HaCaT细胞克隆形成能力的影响将24孔板铺好下层琼脂(上海Gene tech有限公司)，HaCaT细胞悬液加入24孔板中，放入培养箱(德国 Heraeus 公司)中进行培养，3周内观察并拍照记录细胞的生长情况。

1.5 主要观察指标细胞活力、细胞形态、细胞周期、增殖能力。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0软件进行处理，计量资料用x(_)±s表示，两组间比较采用t 检验，P < 0.05为显著有显著性意义。

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讨论

砷在自然界中主要以化合物的形式存在，比较常见的有亚砷酸钠、氧化砷等，在自然界中的矿物质以及地下水等均有存在。中国是砷污染比较严重的国家，在一些地区现饮用水砷中毒^[16]。砷通过皮肤、呼吸道以及消化道进入人体后，主要和血红蛋白结合，分布到全身各组织器官中^[17]。长期接触砷化物有发生癌变的风险，常见的有皮肤癌、肺癌等，也可引起膀胱癌、肝癌等癌症的发生。长期砷接触与心血管疾病、糖尿病等均有一定关系^[18]。砷是目前公认的一种致癌物质，其致癌机制可能有以下几个方面^{[6, 19-23]}：①氧化应激作用：砷作用于细胞后可以产生活性氧，活性氧对细胞膜有间接或者直接损伤的作用，同时也对蛋白质和DNA也有损伤作用，在皮肤癌患者中的活性氧含量比正常人中的含量高^[24]，表明砷作用于人体产生的活性氧在皮肤癌的发生中发挥重要作用。②改变细胞的增殖能力：常用的细胞增殖的检测指标是鸟氨酸脱羧酶，砷暴露的人群中，鸟氨酸脱羧酶的活性增加^[25]。③染色体异常：二甲基砷酸是砷在体内的代谢产物，能够引起染色体断裂，并可以诱发遗传毒性^[26]。④生长因子的改变：砷能够使肿瘤坏死因子、转化生长因子以及粒细胞巨噬细胞刺激因子等细胞因子的分泌增加，而这些细胞因子的改变促进皮肤癌的发生^[27]。⑤DNA修复的改变：长期砷暴露能够改变DNA的修复作用，三价砷能够和硫基结构，抑制DNA修复，加快细胞增殖^[28]。⑥改变细胞信号转导通路：砷暴露能够激活Wnt、p53、ATM等多条信号通路^[29-32]，影响细胞的损伤修复，以及细胞的生长周期和细胞凋亡^[33-36]。⑦抑制p53基因：p53是一种抑癌基因，对细胞的生长以及细胞的增殖中发挥重要作用，在DNA的转录中也发挥重要作用，砷能够抑制p53的功能，降低p53水平，终止细胞周期阻滞^[37]。砷中毒能够引起多个组织器官的肿瘤发生，皮肤癌是常见的一种受累的癌症^[38]。

HaCaT人永生化皮肤角质形成细胞来自于正常皮肤角质形成细胞，在一定条件下能够自发永生化^[39-42]，自发永生化是多步骤基因变化的过程，主要是激活永生化基因，失活沉默基因^[43-46]。HaCaT人永生化皮肤角质形成细胞常被用于恶性细胞转化的研究，亚砷酸钠慢处理有引起HaCaT人永生化皮肤角质形成细胞恶性转化的作用，并且具有致瘤性^[47-50]，但关于低浓度亚砷酸钠是否引起HaCaT人永生化皮肤角质形成细胞发生恶性转化的研究不多。

本实验通过对人永生化皮肤角质形成细胞HaCaT细胞进行培养，并经过亚砷酸钠的处理，观察不同浓度亚砷酸钠对人永生角质形成细胞活力的影响，低浓度亚硫酸钠对HaCaT人永生化皮肤角质形成细胞的细胞形态、细胞周期、增殖能力以及可能形成能力的影响，结果发现0 mol/L和5 mol/L亚砷酸钠干预的细胞生长良好，10 mol/L亚砷酸钠干预的细胞贴壁减少，50 mol/L亚砷酸钠干预的细胞全部死亡。人永生角质形成细胞经0.1 mol/L亚砷酸钠处理后，传代培养至第20代时，人永生角质形成细胞的形态没有明显改变，传代培养至25代时，人永生角质形成细胞一部分细胞体积增大，有多个核仁，出现重叠生长现象，有不断增殖趋势。人永生角质形成细胞经0 mol/L亚砷酸钠处理后，细胞形态均一，呈梭形或椭圆形，细胞核为一个核仁。人永生角质形成细胞经0.1 mol/L亚砷酸钠处理后，传至15-25代时S期细胞和G₂/M期细胞多占比例高于经无亚砷酸钠处理组。人永生角质形成细胞经0.1 mol/L亚砷酸钠处理后，传代至第15-25代时，人永生角质形成细胞的增殖能力高于对照组，且第25代人永生角质形成细胞的增殖能力高于第15代细胞。用0.1 mol/L亚砷酸钠干预的细胞传至15-25代时克隆形成率明显高于对照组和第5代细胞，第5代时人永生角质形成细胞的克隆形成率和对照组接近，第25代细胞的克隆形成率高于第15代。

综上，高浓度亚砷酸钠降低HaCaT人永生角质形成细胞的活力，低浓度亚硫酸钠对HaCaT人永生化皮肤角质形成细胞的细胞形态、细胞周期、增殖能力以及克隆形成能力均有一定的影响，随着传代的增加，人永生角质形成细胞增殖能力和克隆形成能力不断增强。

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