富血小板纤维蛋白新生诱导骨的组织学观察

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.07.003

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (7): 933-939.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.07.003

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富血小板纤维蛋白新生诱导骨的组织学观察

付冬梅^1，2，肖琼³，杨琴秋⁴，董露⁵，陈红亮²，孙勇²

¹西南医科大学口腔医学院，四川省泸州市 646000；²解放军成都军区机关医院·成都军区口腔种植与修复临床医学专科中心，四川省成都市 610041；³重庆拜博口腔医院管理有限公司九龙坡口腔医院，重庆市 400000；⁴遂宁市第一人民医院口腔科，四川省遂宁市 629000；⁵凉山彝族自治州第一人民医院口腔科，四川省西昌市 615000

收稿日期:2015-11-30 出版日期:2016-02-12 发布日期:2016-02-12
通讯作者: 孙勇，主任医师，教授，硕士生导师，解放军成都军区机关医院?成都军区口腔种植与修复临床医学专科中心，四川省成都市 610041
作者简介:付冬梅，女，1988年生，四川省资阳市安岳县人，汉族，西南医科大学口腔医学院在读硕士，主要从事口腔种植义齿修复的基础与临床研究。
基金资助:
全军“十二五”科研面上课题(CWS11J024)

Histological observation on new bone induced by platelet-rich fibrin

Fu Dong-mei^{1, 2}, Xiao Qiong³, Yang Qin-qiu⁴, Dong Lu⁵, Chen Hong-liang², Sun Yong²

¹School of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; ²Chengdu Military Authorities Hospital of PLA, Oral Implant and Prosthodontics Center of Chengdo Military Region, Chengdu 610041, Sichuan Province, China; ³Jiulongpo Dental Hospital of Chongqing Bybo Dental Hospital Administrative Limited Company, Chongqing 400000, China; ⁴Department of Stomatology, the First People’s Hospital of Suining, Suining 629000, Sichuan Province, China; ⁵Department of Stomatology, the First People's Hospital of Liangshan Yi Autonomous Prefecture, Xichang 615000, Sichuan Province, China

Received:2015-11-30 Online:2016-02-12 Published:2016-02-12
Contact: Sun Yong, Chief physician, Master’s supervisor, Professor, Chengdu Military Authorities Hospital of PLA, Oral Implant and Prosthodontics Center of Chengdu Military Region, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
About author:Fu Dong-mei, Studying for master's degree, School of Stomatology, Sichuan Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
the Scientific Research Project of PLA during the Twelfth Five-Year Plan, No. CWS11J024

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

富血小板纤维蛋白：是一种采集自体血液，一次离心既可，无需对血液做任何生化处理所形成的三维网状结构，富含多种生长因子，能促进骨和软组织的形成的一种自体生物材料。

骨诱导：是指来自植床周边宿主结缔组织中的可诱导成骨前体细胞，在诱导因子的作用下可被诱导定向产生骨原细胞，经成骨细胞形成新骨(骨形态发生蛋白的参与)。

背景：作者在前期的实验中已证实富血小板纤维蛋白具有成骨性，并在微观结构和生物力学等方面进行了初步研究，但是对组织学上的研究较少。

目的：对比观察富血小板纤维蛋白、Bio-Oss、自体骨3种不同骨替代材料植入后的组织学变化，分析富血小板纤维蛋白修复骨缺损的特点和优势。

方法：12只beagle犬，参照文献方法建立犬双侧股骨髁左右各3个实验性临界性骨缺损动物模型。在3个骨缺损区随机分别填入自体富血小板纤维蛋白组，自体骨+胶原膜(自体骨组)，Bio-Oss+胶原膜组(Bio-Oss组) 。在植入后3，6，8和12个月分别处死3只实验犬，术区取材后进行组织学染色观察。另外1只实验动物按照上述方法制造临界性骨缺损模型后，不植入任何材料，标记为空白组。

结果与结论：植入后3，6，8和12个月时，3种骨移植材料的新骨生成速度、生成量差异均有显著性意义。3种材料均能诱导成骨，但是成骨能力各不相同：富血小板纤维蛋白组在3个月和6个月时成骨效果更优，且形成的新骨更接近生理状态；自体骨在植入后3个月和6个月更多以骨坏死为主，8个月后成骨效果可，12个月后基本接近生理状态；Bio-Oss组成骨效果与富血小板纤维蛋白组类似，在12个月时仍可见Bio-Oss残留颗粒；空白组在术后3个月时未见明显新骨形成，说明该实验动物临界性骨缺损模型建立成功。实验结果显示富血小板纤维蛋白具有较好的诱导新骨形成的能力，且新骨形成所需时间更短，质量佳。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0002-9496-0787(付冬梅)

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 富血小板纤维蛋白, 自体骨, 异种骨, 骨缺损, 成骨, 骨&gamma, -羧基谷氨酸蛋白, 细胞核因子kB 受体活化因子配体

Abstract:

BACKGROUND: In previous experiments, we have confirmed that platelet rich fibrin has the ability of osteoinduction, and have conducted a preliminary study on its microstructure and biomechanics. However, little is reported on its histology research.
OBJECTIVE: To compare the histological changes after implanting platelet-rich fibrin, Bio-Oss and autologous bone and to analyze the pros and cons of platelet-rich fibrin implantation for repair of bone defects.
METHODS: As previously reported, animal models of critical bone defects were established respectively on the bilateral femoral condyles of 12 beagle dogs. Then, platelet-rich fibrin, Bio-Oss+collagen membrane (Bio-Oss group) and autologous bone (autologous bone group)+collagen membrane were respectively implanted. At 3, 6, 8 and 12 months, one experimental dog from each group was killed, respectively, and histological observation was performed. Another beagle dog as blank control was enrolled to establish the animal model of critical bone defects, with no implantation.
RESULTS AND CONCLUSION: At 3, 6, 8 and 12 months after implantation, there were significant differences in the new bone formation speed and amount between the platelet-rich fibrin group, Bio-Oss group and autologous bone group. These three kinds of bone grafts all had osteoinductive ability to different extents. In the platelet-rich fibrin group, the osteogenic effects were better at 3 and 6 months, and the new bone was similar to natural one; in the autologuos bone group, bone necrosis was noticeable at 3 and 6 months, but the osteogenic effects became better at 8 months, and the new bone was similar to natural one at 12 months; in the Bio-oss group, the osteogenic effects were similar to those in the platelet-rich fibrin group, but the residual of Bio-oss was visible at 12 months; in the blank control group, no bone formed at 3 months, indicating the animal model of critical bone defects was made successfully. In brief, the platelet-rich fibrin has good osteoinductive ability, with shorter time and better quality.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

付冬梅，肖琼，杨琴秋，董露，陈红亮，孙勇. 富血小板纤维蛋白新生诱导骨的组织学观察[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(7): 933-939.

Fu Dong-mei, Xiao Qiong, Yang Qin-qiu, Dong Lu, Chen Hong-liang, Sun Yong. Histological observation on new bone induced by platelet-rich fibrin[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(7): 933-939.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 13只Beagle犬在整个实验周期生长状况良好，能够耐受手术，无死亡现象，均进入结果分析。

2.2 建模术后动物的一般情况实验动物手术顺利，术后2-4 h麻醉苏醒。术后饮食、尿便可，动物站立行走。1周后术区愈合无异常，未见创口裂开和红肿。观察期内，实验动物均健康存活。

2.3 大体观察结果观察期内，各组愈合情况良好。不同点：3个月时，富血小板纤维蛋白组见少量富血小板纤维蛋白膜残留，Bio-Oss组见胶原残留，被结缔组织包裹，自体骨组见自体骨碎片和残留的部分胶原膜，空白组未见新骨形成，骨凹陷明显。6个月时均未见残留的移植材料，但是自体骨组骨凹陷较其余两组明显，边界不清；8个月和12个月时凹陷均变浅，仍以自体骨凹陷最明显，边界不清。

2.4 组织学观察结果见图2。

富血小板纤维蛋白组：3个月骨缺损区与移植物交界处可见大量致密结缔组织、透明软骨、类骨质和骨质成分，并可见少量复合物降解残留物，新生骨生长数量较多。6个月类骨质和骨质均逐渐增多，并可见密质骨，骨小梁和骨髓腔等结构，富血小板纤维蛋白膜未见残留，新生骨形成，骨髓腔内骨小梁明显多于自体组。8个月骨缺损以多点方式直接成骨，密质骨可见较清楚的数层外环骨板，表面可见成骨细胞排列，在内外环骨板间明显可见含血管的哈氏管及环绕呈同心圆状的哈氏板，骨细胞均达到成熟阶段，骨细胞和骨胶纤维规则排列，骨小梁粗细不等，且较6个月时增多，骨小梁较自体骨组量多且粗大，不成熟骨质较少，哈氏骨板形成。12个月骨细胞和骨胶纤维均规则分布，未见不成熟骨质，哈氏骨板形成并增多，骨缺损处骨基本形成。

自体骨组：3个月骨缺损区与移植物交界处可见致密结缔组织、透明软骨、类骨质和骨质，并见较多的自体骨支架降解残留物。6个月骨缺损部位则多为致密纤维结缔组织，骨形成明显较少，残存载体复合物增多，类骨质和少量骨质呈犬牙交错状连接。8个月密质骨初步形成，但骨小梁较少且细小，不成熟骨质较多，未见哈氏骨板，骨细胞不规则，仍然可见少量自体骨降解残存物。12个月类骨质和骨质均逐渐增多，并可见密质骨、骨小梁和骨髓腔等结构。

Bio-Oss组的苏木精-伊红染色结果基本与富血小板纤维蛋白组类似。不同之处在于直到术后12个月时仍可见少量Bio-Oss残留颗粒(见图2) 。

2.5 空骨陷凹率和骨小梁宽度的分析见表1。不同材料在同一时间节点的横向比较中得出在3个月和12个月时，富血小板纤维蛋白组在空骨陷凹率和骨小梁宽度上较Bio-oss和自体骨组差异有显著性意义，而Bio-oss和自体骨仅在空骨陷凹率上差异有显著性意义。6个月和8个月时，富血小板纤维蛋白组在骨小梁宽度上与其余两组差异有显著性意义。8个月时各组间差异无显著性意义。不同材料的纵向比较中可见自体骨组随着时间的延长，空骨陷凹率有统计学意义，富血小板纤维蛋白组仅在3个月时有统计学意义，其余各时间点各组差异无显著性意义。

2.6 RANKL和骨钙素的统计学分析见表2。RANKL和骨钙素主要表达在细胞浆、细胞膜或间质等部位，阳性颜色为浅黄色或棕黄色，阴性表达为蓝色，底色为白色。3种不同植骨材料在不同时间点的横向比较中发现，3个月时富血小板纤维蛋白组的RANKL和护骨素的表达较其余两组差异有显著性意义，6个月时富血小板纤维蛋白组与自体骨组有意义，其余各组各时间点差异无显著性意义。在同一材料的不同时间点的研究中发现，RANKL的表达在富血小板纤维蛋白组3个月和6个月差异有显著性意义，而骨钙素则在3，6和8个月时差异均有显著性意义，Bio-Oss组各时间点差异无显著性意义，自体骨组在各时间点上差异均有显著性意义。

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引言

在口腔种植领域，骨三维空间不足制约着种植的发展以及种植的远期效果，种植位点的骨重建和骨再生一直是科研热点之一^[1-2]。如何更简便有效地实现种植位点的三维骨再生，同时避免免疫原性危险和疾病传播风险，又符合伦理原则是众多学者努力的目标。富血小板纤维蛋白具备以上条件^[4]，受到业界的广泛关注。作者在前期的实验中已证实富血小板纤维蛋白具有成骨性^[5]，并在微观结构和生物力学等方面进行了初步研究，但是对组织学上的研究较少。目前大多数组织学研究短期报道较多，而长期的组织学研究报道缺乏^[6]。

随着口腔种植技术的发展，从骨的再生机制寻求突破，促进内源性骨再生成为研究热点。种子细胞、生长因子、纤维支架为构建组织工程骨的要素^[7]。生长因子是一种存在于机体内的细胞外信号分子，其在相应的靶细胞表面受体的介导作用下，参与和引导机体损伤修复^[8-9]。RANKL和骨钙素在骨骼吸收与重塑中起到很重要的作用^[10]。近年来常用的骨移植材料都有其优缺点，其中自体骨被认为是最有效的骨移植替代材料^[11]，而Bio-oss在临床上成骨效果肯定，富血小板纤维蛋白因含有多种生长因子也在口腔领域获得广泛应用，但是缺少同时将3种材料做较长期的对比分析。因此实验通过比较富血小板纤维蛋白、自体骨Bio-oss所诱导新生骨的空骨陷凹率和骨小梁宽度，同时比较不同时期各移植材料的RANKL和骨钙素的表达情况，探讨富血小板纤维蛋白修复骨缺损的特点和优势，为富血小板纤维蛋白在诱导骨再生及颌骨重建的临床应用提供新的实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2014年7月至2015年8月在四川大学华西医院动物实验中心和四川省医学科学院•四川省人民医院药物安全评价中心病理室完成。

1.3 材料

实验动物：健康成年雄性beagle犬13只，犬龄为12-14个月，体质量10-12 kg，由四川大学华西医院动物中心提供。实验动物设施使用许可证号：SYXK(川) 2013-119。自然昼夜光照条件下，单笼、全价颗粒饲料喂养。术前预养1周，确认动物体健。实验过程中对实验动物的各项处置符合动物伦理学要求。

仪器和设备：Bio-Oss骨替代品(盖氏公司，瑞士)；海奥口腔修复膜(正海生物技术有限公司，中国烟台)；苏木精-伊红染色及免疫组织化学染色相关试剂及仪器(由四川省医学科学院•四川省人民医院药物安全评价中心病理室提供)；种植机(Surgic XT Plus，NSK，日本)；Φ5.5/5.9 mm环形中空取骨钻(青岛日和口腔医疗器械有限公司，中国山东)；富血小板纤维蛋白工具盒(Process，Nice，法国)。

1.4 实验方法

1.4.1 犬临界性骨缺损模型的建立及分组干预参照杨晓峰^[3]的建模方式制造beagle犬双侧股骨髁左右各3个实验性临界性骨缺损动物模型。

术前左前下肢肘部采血8 mL/试管，即刻离心，速度为3 000 r/min，时间为10 min^[12]，静置5 min后，用富血小板纤维蛋白专用工具盒制备富血小板纤维蛋白膜^[13]。将制备好的富血小板纤维蛋白膜填入一个骨缺损区(见图1)，并稍高出骨面，用牙周探针探试，富血小板纤维蛋白膜无移位及脱出。另2个骨缺损处分别填入术中收集的自体骨和BIo-Oss骨粉，缺损区表面均覆盖胶原膜，且超出骨缺损区边缘约2 mm，然后分层对位缝合术区。余下的1只实验动物仅制造动物骨缺损模型，但不填入任何材料，作为空白对照组，其余操作同前。术后当日和术后连续3 d注射青霉素钠(80×10⁴ U/次，1次/d) 预防感染。

1.4.2 取材在术后3，6，8和12个月分别各处死3只实验动物，空白组动物则在术后3个月时处死，将新生骨及周围1 mm正常骨组织一并取下，进行不同标本的制备。

1.5 主要观察指标

1.5.1 大体观察实验动物术后一般生命体征的情况。观察术后3，6，8和12个月时术区的瘢痕、炎症、植入材料的残留、术区愈合等情况。

1.5.2 组织学观察

苏木精-伊红染色：在术后3，6，8和12个月分别处死实验犬后将术区常规制作病理标本，苏木精-伊红染色后，在光镜下观察空骨陷凹和骨小梁宽度情况。利用Image-Pro Plus 6.0计算机图象分析系统镜下采集图像，每张切片随机采集6个不重叠视野图像，分别计算每一视野中骨陷窝和空骨陷窝的数量，取平均值进行统计分析。空骨陷窝率按照公式：空骨陷凹率=空骨陷凹/(骨陷凹+空骨陷凹)×100%进行计算。骨小梁宽度分析：每张切片随机选择3处骨小梁宽度和形态接近处测量骨小梁宽度后取平均值。

免疫组织化学染色：在术后3，6，8月和12个月各处死动物后制作术区病理切片并进行免疫组织化学染色，统计分析RANKL和骨钙素的表达情况。采用数码三目摄像显微摄像系统对切片进行图像采集，每张切片先于100倍下观察全部组织，再根据组织大小及表达情况分别选取1个区域400倍采集图像。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测定所采集全部图像的平均吸光度值，若同一切片采集多张图像，则取平均值。

1.6 统计学分析采用 SPSS 17.0 统计软件行单因素方差分析，实验资料以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

在口腔种植应用中，引起骨丧失的因素很多，如拔牙、外伤、感染和肿瘤等，也可能是发育、病理性压迫等因素导致的种植体植入骨量不足，甚至种植外科手术本身亦可以导致骨量不足^[14]。骨三维结构的质量决定种植的成功率，尤其是远期成功率。从各种骨替代材料以及各种复合材料移植，再到目前的生物活性材料，骨组织工程、基因工程治疗，由于自身材料本性性能的差异和骨缺损区局部反应的复杂性常引起较重的免疫排斥，最终导致成骨效果不良，而不能彻底进行骨缺损修复^[15]。因此寻找一种能从骨的修复和生长机制出发，来弥补各种材料的不足，并综合其成骨优势，才能更好的完善骨缺损的修复，缩短治疗时间，提高种植修复的远期疗效^[16]。

富血小板纤维蛋白是由Choukroun等在2000年成功制取^[17]，其通过采集自体血液，以2 700 r/min，12 min或者3 000 r/min，10 min一次离心得到血液制品，中间层为半透明淡黄色凝胶状结构即为富血小板纤维蛋白。电镜下观察为富含白细胞，红细胞，血小板的三维网状结构^[18]，而这种三维网状结构因未对血液做任何生化处理，使其更加接近生理状态。制备过程中相关因子随着立体网状结构的改建^[19]，缓慢释放，在纤维蛋白的作用下可缓慢释放持续28 d左右^[20]，从而实现软硬组织的再生修复。Bio-Oss骨替代材料，它是去除了所有有机质的牛无机骨基质，其多孔状结构为新骨的长入提供了支架，从而促进成骨，是目前应用较广泛的异种骨材料^[21]，而自体骨是骨移植的金标准^[22]。沈敏华，郭蕊欣等^[23-24]学者指出骨是一种由多种细胞和基质组成的特殊的结缔组织，它的修复改建是由多种细胞共同参与完成的^[25]，其中破骨细胞和成骨细胞的作用最为关键^[26]，它是骨吸收与骨形成的执行体，受循环激素及细胞因子的调控^[27]。RANKL是目前发现的惟一具有诱导破骨细胞分化、发育、发挥功能的因子^[28]，它呈剂量依赖性地激活成熟破骨细胞，启动骨吸收过程。RANKL-RANK-护骨素调节轴是骨重塑中骨吸收与骨形成保持动态平衡的关键^[29]，由表3，4可见富血小板纤维蛋白组，自体骨组和Bio-Oss组植入均能有效表达RANKL，诱导破骨细胞分化、发育，调控破骨细胞骨吸收。骨钙素是由成骨细胞特异合成和分泌的一种非胶原蛋白，是反映成骨细胞活性的敏感指标^[30]。它随着骨矿化和成骨细胞分化的进展而增加^[31]，骨更新率越快，骨钙素值越高。李增健等^[32]指出观察骨钙素在骨界面的表达规律，有助于识别不同替代材料的理化性质对细胞外非胶原蛋白基因表达和蛋白合成的影响，预示界面区骨形成的情况。在此次实验中，骨缺损区植入不同的骨移植材料后均能不断促进成熟骨细胞产生骨钙素，有效激发成骨细胞活性，促进新骨生成。

实验还看到在术后3个月时空白组的缺损区成骨不明显，说明成功制造了实验动物的临界性骨缺损模型，为后续研究提供支持。植入骨移植材料的各组均能成骨，且随着时间的延长，成骨效果较好，推测可能的成骨机制为富血小板纤维蛋白在离心过程中血小板被激活，在损伤区域聚合和启动凝血机制，帮助止血。同时在脱颗粒作用下，参与炎症调节的细胞因子被释放，促进血管化过程^[6]。目前经过大量学者的基础研究，富血小板纤维蛋白的特征已较清楚，但其对调节炎症反应的具体过程需要进一步探讨和研究。

富血小板纤维蛋白组、Bio-Oss组和自体骨组表面均有不同程度的凹陷，说明3种移植物均不能阻止位点丢失，这与Fickl等^[33]和Vignoletti等^[34]报道的结果相符。由于本模型所制备的骨缺损位于股骨髁中央处，周围骨壁较厚，因此不适用于研究位点保存中骨宽度的变化。3组见软组织愈合无明显差异，表明富血小板纤维蛋白对软组织的愈合无抑制作用，但是在3个月时见少量富血小板纤维蛋白膜残留，这与Sam等^[35]通过比较富血小板纤维蛋白膜、牛胶原蛋白膜、鱼胶原蛋白膜的弹性模量(0.35、2.74、1.92 GPa)、硬度(10.67、110.7、90.5 MPa)及1周内的降解速率(36%、3%、8%)得出：富血小板纤维蛋白因其较低的硬度和较快的降解速率限制了其在引导组织再生方面的应用不一致，需要再次实验验证。但是富血小板纤维蛋白在6个月时新骨形成，8个月时可见哈氏骨板形成，说明在临床上富血小板纤维蛋白行位点保存术时，6个月为可选择种植修复的时机。

Bio-oss组3月时可见部分未降解胶原膜，6个月时未见残留的生物膜，与文献报道的海奥生物膜在体内存留及代谢的周期为12-16周一致^[36]，说明3个月时该膜与骨组织修复时间相当，且其成骨与富血小板纤维蛋白类似，但是在12个月时仍有残留的Bio-oss颗粒，远期降解仍需观察。自体骨组在6个月时在苏木精-伊红切片上仍可见少量的坏死的骨小梁，新生骨小梁细小，8个月时骨小梁增粗，12个月新骨形成，说明自体骨以骨坏死为主，后期以骨再生为主。

实验的不足之处在于，由于实验条件限制，空白组的时间节点只依据临床缺牙后固定修复的时间3个月设定。虽然实验中未发现空白组在3个月时成骨，说明该骨缺损模型确实已超出机体自身骨修复的能力。但是缺少6，8，12个月的相应对照。

综上所述，3种骨移植材料均能成骨，富血小板纤维蛋白具有较好的诱导新骨形成的能力，能更短时间地诱导形成新骨且新骨质量较佳，因此富血小板纤维蛋白具有较好的临床应用前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

富血小板纤维蛋白新生诱导骨的组织学观察

Histological observation on new bone induced by platelet-rich fibrin

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