自体骨及重组人骨形态发生蛋白2复合骨在腰椎中融合的效果：与异体骨比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.03.002

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (3): 314-318.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.03.002

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自体骨及重组人骨形态发生蛋白2复合骨在腰椎中融合的效果：与异体骨比较

张轲，彭强

四川医科大学附属第一医院小儿外科，四川省泸州市 646000

收稿日期:2015-11-15 出版日期:2016-01-15 发布日期:2016-01-15
通讯作者: 彭强，博士，教授，四川医科大学附属第一医院小儿外科，四川省泸州市 646000
作者简介:张轲，男，1983年生，四川省宜宾市人，汉族，四川医科大学在读硕士，医师，主要从事小儿外科方面的工作，
基金资助:
四川省卫生厅项目(140049)；国家自然科学基金(81372110)

Autogenous bone, recombinant human bone morphogenetic protein 2 composite bone or allogeneic bone in rabbit lumbar spinal fusion

Zhang Ke, Peng Qiang

Department of Pediatric Surgery, First Affiliated Hospital of Sichuan Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Received:2015-11-15 Online:2016-01-15 Published:2016-01-15
Contact: Peng Qiang, M.D., Professor, Department of Pediatric Surgery, First Affiliated Hospital of Sichuan Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Zhang Ke, Studying for master’s degree, Physician, Department of Pediatric Surgery, First Affiliated Hospital of Sichuan Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
a grant from Sichuan Health Department, No. 140049; the National Natural Science Foundation of China, No. 81372110

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

腰椎融合：通过手术植骨的方法使病变椎间关节之间发生骨性结合，从而建立和维持腰椎稳定性。如何重建腰椎稳定性是恢复病变腰椎生理功能的关键环节。随着各种内固定技术的发展，尤其是经椎弓根固定技术的发明和完善，极大地推动了腰椎稳定性重建的发展，达到了腰椎三维坚强固定，实现了腰椎修复后即刻稳定。因而，植骨融合在重建腰椎稳定中发挥着关键的作用，融合成功与否也成为脊柱手术成功与否的重要标志之一。

脊柱融合与骨形态发生蛋白：研究证实骨形态发生蛋白可促进脊柱融合，目前已有基因重组骨形态发生蛋白应用于临床。但关于骨形态发生蛋白在脊柱融合方面的临床疗效评估，还需要在未来的大量随机化对比研究中得到更多的客观数据加以量化证实。

背景：重组人骨形态发生蛋白2能够有效促进新骨生成和骨折愈合，但其于腰椎融合的具体应用仍存在较多争论。

目的：观察植入自体骨、重组人骨形态发生蛋白2复合骨在兔腰椎融合中的效果差异。

方法：选取45只新西兰大白兔，构建腰椎后路横突间植骨融合兔模型，建模后随机分为3组，分别于兔L₅和L₆横突间位置植入自体髂骨、重组人骨形态发生蛋白2复合骨和异体髂骨。植入后正常喂养8周，麻醉后处死各组兔观察椎间融合情况。

结果与结论：①与植入异体髂骨相比，植入自体髂骨和重组人骨形态发生蛋白2复合骨模型兔的手法检测融合率、影像学检查融合率、L₅_-₆/L₄_-₅椎体的拉伸强度比值及新生骨组织所占百分比均显著升高(P < 0.05)，且后2组上述各指标变化差异比较无显著性意义。②结果证实：兔腰椎入自体骨、重组人骨形态发生蛋白2复合骨后的融合效果相当，均优于异体骨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

ORCID: 0000-0003-1583-3067(张轲)

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 重组人骨形态发生蛋白2复合骨, 自体骨, 异体髂骨, 兔, 腰椎融合, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Recombinant human bone morphogenetic protein 2 (rhBMP2) can effectively promote new
bone formation and fracture healing, but its specific application in the lumbar spinal fusion remains controversial.
OBJECTIVE: To study the effect of autogenous bone, rhBMP2 composite bone or allogeneic bone on the lumbar spinal fusion of rabbits.
METHODS: Forty-five New Zealand white rabbits were enrolled to make intertransverse lumbar interbody fusion models and then randomly subjected to autogenous iliac bone, rhBMP2 composite bone or allogeneic iliac bone via L5-L6 intertransverse process, respectively. Then, the rats were sacrificed under anesthesia at 8 weeks after operation to observe the lumbar fusion.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the allogeneic iliac bone group, the fusion rates, tensile strength ratio of L5-6/L4-5, and percentage of new bone tissues were increased more significantly in the other two groups (P < 0.05), and moreover, there was no difference between the autogenous iliac bone and rhBMP2 composite bone groups. These findings indicate that the autogenous iliac bone and rhBMP2 composite bone have similar fusion effects, both of which are superior to the allogeneic bone.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

张轲，彭强. 自体骨及重组人骨形态发生蛋白2复合骨在腰椎中融合的效果：与异体骨比较[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(3): 314-318.

Zhang Ke, Peng Qiang. Autogenous bone, recombinant human bone morphogenetic protein 2 composite bone or allogeneic bone in rabbit lumbar spinal fusion[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(3): 314-318.

图/表（结果） 3

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引言

在骨外科临床中，腰椎融合常需要选取骨移植，并对患者植入大量骨材料^[1]。研究显示，最佳的植入骨材料应是自体骨，这是因为自体骨和植入宿主的骨组织间无排斥反应，使得植入后骨融合完美，恢复效果优异^[2]。但寻找适合骨移植手术的自体骨源难度较高，且骨源较少，使得多数患者不得不接受异体骨植入^[3]；即使患者接受植入骨的骨量较少时，也使得植骨和受骨间难以充分融合^[4]，针对此情况，术者需植入一定量的自体额骨以弥补，使得患者获得理想的植骨融合，但该方式可损伤正常骨组织，导致患者满意度较低^[5]。因此，越来越多研究者致力于突破植骨来源的局限性，以寻找骨移植新材料。

重组人骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein 2，rhBMP2)能够有效促进新骨生成和骨折愈合^[6]，但单纯予以重组人骨形态发生蛋白2植入无法获得较优的治疗效果，需要将其和某种载体复合以获得较优的成骨能力^[7]。鉴于异体骨来源广泛，并和天然骨结构相似、具有优秀的骨传导性^[8]，对异体骨清洗、脱脂、脱蛋白及表面脱钙处理，后选择低温冻干后，可明显抑制其抗原性。实验假设将其作为载体与人骨形态发生蛋白2混悬液负压复合^[9]，使得人骨形态发生蛋白2微粒均匀覆盖于腔隙壁表面，并和胶原蛋白相互结合^[10]，获得优秀的组织相容性、骨传导及骨诱导活性。为进一步验证实验假设和深入研究分析植入自体骨和重组人骨形态发生蛋白2在兔腰椎融合中疗效差异，实验选取45只新西兰大白兔建立动物模型，分别对模型兔进行自体骨及重组人骨形态发生蛋白2复合骨融合实验，现将实验结果总结如下。

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材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2012年3月至2014年7月在四川医科大学附属第一医院实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物新西兰大白兔45只，平均月龄3.32± 0.47，雌雄不限，体质量3.0-4.0 kg，购自四川医科大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK：2012-0009。动物喂养于安静、清洁、温度适中的环境中。实验通过四川医科大学动物实验研究伦理会批准。

1.3.2 移植骨

自体髂骨：均取自实验兔双侧髂骨：大小规格为20 mm×15 mm，后处理得到1 mm×1 mm×15 mm单面皮质骨条。

同种异体髂骨：均取自实验兔双侧髂骨，经处理得到相同大小规格的单面皮质骨条，对自体和异体骨条依次清洗及脱脂、蛋及钙处理，后将其置于冷冻条件下晾干，使用⁶⁰Co将其消毒备用。

重组人骨形态发生蛋白2复合骨：制备同种异体骨混悬液，放入自体冻干骨，滴入双蒸水20 mL及1.5 mg的重组人骨形态发生蛋白2(上海博升生物科技有限公司)混合制备混悬液，放入相同来源异体冻干骨，将其放于0.4 MPa负压环境下复合10-20 min，取出低温冻干后，消毒无菌干燥密封包装。

1.4 实验方法

1.4.1 腰椎后路横突间植骨融合模型兔的构建对实验兔行常规麻醉后，于其L₅棘突做为中心，并于后正中位置取切口，于其自体髂骨组充分暴露双侧髂骨后，在从切口进入取骨，取骨规格为15 mm×20 mm，并将双侧L₅_-₆横突充分暴露，在将背侧皮质切除分离，切除皮宽为20 mm，会对切口进行充分止血。

1.4.2 分组及干预将45只兔采用随机数字表法分为自体骨、重组人骨形态发生蛋白2复合骨组、异体骨组，每组15只。自体骨组于L₅和L₆横突间位置植入0.5 g自体髂骨，异体骨组植入0.5 g异体骨条，重组人骨形态发生蛋白2复合骨组植入0.5 g重组人骨形态发生蛋白2复合骨。植入结束后，消毒、缝合切口及包扎。3组实验兔置于相同环境及条件下喂养2个月后麻醉断颈处死，分别观察其相应指标。

1.5 主要观察指标检测并比较3组植入后12周椎体融合率差异，分别采用手法检测和影像学检测方法^[5]，手法检测的方法为2位医师在盲法的情况下采用手法检测椎体间活动情况，如果都评价为固定即为融合，任何一位评价为非固定均判断为不融合^[11]；影像学判断方法：X射线椎体骨融合的标准为：融合椎体为椎体的前方、侧方形成连续性骨桥或骨小梁^[12]；未融合为：椎体间段间出现透亮区域，植入体下沉移位，终板或植骨面出现间隙和假关节形成。

测试各组实验动物椎体的生物力学强度并进行比较^[13]。于植入后12周在苏木精-伊红染色情况下对各组融合情况进行组织切片定量分析，采用Pixera Bood显微摄像机、专业图像分析软件系统Leica Qwin V2.3系统(北京海纳维盛科技有限公司)进行分析，计算视野下新生骨组织及软骨组织所占面积百分比。

植入后12周后，进行X射线检查：X射线对实验兔前后位进行拍摄，观察3组兔骨移植材料融合、吸收和成骨程度，观察指标主要为骨痂面积及骨小梁形成面积^[14]。

植入后12周后进行组织形态学检查：每组兔均取4例标本、8例融合块做组织学检查，选取位置应靠近横突位，对标本行常规处理、染色后用显微镜观察。新生骨的定量分析：选择200倍显微镜观察成骨区，并使用数码显微相机拍摄成像，利用图像分析软件对摄片做定量分析，观察染色新生骨组织面积，计算其百分比=新生骨组织/总面积×100%^[15]。

植入后12周后进行生物力学检测：3组实验兔选择6例骨骼标本，其中包括L₄_-₅和L₅_-₆，使用电子拉力机测试，电子显示并记录牵拉强度^[16]。

1.6 统计学分析数据分析及统计采用专业软件SAS 9.0软件，计量资料采用x(_)±s表示，计数资料用百分率表示，3组间生物力学测试结果、组织学观察结果比较采用单因素方差分析，组间数据差异两两比较采用SNK-q 检验；组间融合率比较采用卡方检验；P < 0.05表示差异具有显著性意义。

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讨论

3.1 后路腰椎融合植植入骨研究现状在骨外科临床中，后路腰椎融合已经成为常见的一种脊椎疾病治疗方式，但该术式实施过程中需使用不同类型的植入骨材料^[17]。目前，较为常用的移植骨材料为患者自体骨，但其取骨来源及取骨量均较少，使得该类植入骨的临床应用范围有限，故诸多研究者正在积极寻找合适骨移植新材料^[18]，以弥补自体骨获取难度较高所造成的治疗难题。针对部分需要大段骨移植患者，手术医师采取植入异体骨，但该类骨质生理特点和宿主骨折差距较大^[19]，导致植入后患者身体出现严重的排斥反应，造成植骨长时间难以和被植入处周围骨组织融合，也显著提高感染的发生率^[20]，同时骨延长还可致严重植入后并发症，甚至威胁患者的生命安全。针对此情况，研究者分别发明以合金、生物力学陶瓷或高分子材料等制作而成的人工植骨^[21]，但它们具有的生物相容性、活性及可降解性均较差，且和宿主患者骨结构及力学性的匹配度很低，因此，利用各类促骨生成因子制作高生物特性植骨已成为医学研究的热点之一。

3.2 重组人骨形态发生蛋白2在骨融合中的应用随着医学研究的发展，优秀的骨移植物需具有和宿主自体骨特点近乎相同的生物力学及生物活性特点，同时植骨材料还应对骨组织生成和生长具备良好诱导及传导功能，并能够和宿主骨骼间能够成功相容^[22]。文献指出，为促进新骨的生成，应保证抑制骨具有良好、优质的成骨细胞及骨传导基质，且还要求其有良好的生物力学环境，并能有效刺激、诱导骨组织生长，而重组人骨形态发生蛋白2均能满足以上要求^[23]。重组人骨形态发生蛋白2属于一种高效的促骨生长因子，能够有效诱导骨组织及软骨生成、生长，因此其已经被逐渐应用于各类骨折、骨缺损的骨移植及修复治疗中，实现植入骨宿主患者骨折快速愈合及缺损骨组织良好修复。虽然重组人骨形态发生蛋白2因为其具有良好促骨生成及生长特性，但单纯将其植入骨折患者后，其易出现降解及扩散，不能给骨组织生成提供持续性、长久的诱导作用^[24-25]。

3.3 实验的研究重点重组人骨形态发生蛋白2能够和特定结构载体相结合、重组后再植入宿主患者，增强其作用效果及持续时间，加快骨骼生成、骨折愈合速度。同种异体骨的骨源相比于自体骨更多，采取生物化学手段对其进行脱脂、蛋白和表面脱钙等处理后，能够显著降低其抗原性^[26]，并可能够保证其骨骼支持强度^[27]，导致其可承受较大压力及重力。同时，异体骨具有自然形成的立体空间结构，其骨质组织孔隙率和孔径和宿主患者骨组织相似度可达70%-80%^[28]，故具有优良的骨传导性。

实验创新性的将生物处理后异体骨作为载体和重组人骨形态发生蛋白2负压结合，从而获得优秀植入复合骨。重组人骨形态发生蛋白2蛋白颗粒在该复合骨的骨质结构内的腔隙壁面上分布连续均匀，并和胶原蛋白相互结合，显著增强促骨生长蛋白的附着性^[29]。当该复合骨被植入宿主机头后，重组人骨形态发生蛋白2蛋白可沿着融合时间轴线的前进攀附在异体骨载体上被受体吸收并均匀释放于骨组织内，诱导和传导骨骼生长，同时还可和植入处周围骨骼良好相容后融合。

实验发现，自体骨组和重组人骨形态发生蛋白2复合骨组的椎体融合率显著高于异体骨组，这说明自体骨移植依然是最好的腰椎融合植骨材料，而重组人骨形态发生蛋白2复合骨效果略差，但效果仍然较优，相比之下，异体骨由于其和宿主骨组织生物相容性较差，导致其融合效果最差，因此，在腰椎融合中，若无法找到合适的自体骨源或自体骨量不足的条件下，可选择重组人骨形态发生蛋白2复合骨进行骨移植。

在拉伸强度比较重，自体骨组和重组人骨形态发生蛋白2复合骨组的L₅_-₆/L₄_-₅椎体的拉伸强度比值均显著的高于异体骨组。实验认为该结果的原因可能是因为重组人骨形态发生蛋白2能够和载体同种异体骨有效复合，当该复合骨进入兔体内时，重组人骨形态发生蛋白2具有生物活性诱导宿主骨组织对移植骨相对快速地吸收^[30]，加快局部成骨效率及效果，促进新骨生成及骨生长。通过形态学染色检测，自体骨组和重组人骨形态发生蛋白2复合骨组新生骨组织所占百分比均显著高于异体骨组，这说明自体骨和重组人骨形态发生蛋白2复合骨均能显著促进新生骨骼生成及生长速度，使得受体骨生成大量骨组织和植入骨融合、愈合，提高椎体融合率。

为进一步完善实验，实验对3组兔植入后并发症进行观察，可得手术并发症主要表现为：异体骨组表现为营养不良、人骨形态发生蛋白2复合骨组表现下肢瘫痪，而自体骨组未见其他手术并发症情况发生，实验认为异体骨及复合骨移植产生的疾病传播和排斥反应仍需加强重视，而在排斥反应中发现复合骨可造成下肢瘫痪，这是既往研究中所未发现的，但具体产生机制尚未探查清楚，需要进行深入研究。

综上所述，腰椎体融合中，采取重组人骨形态发生蛋白2复合骨作为移植骨的融合效果和自体骨相当，因此，实验可将重组人骨形态发生蛋白2替代自体骨作为骨移植材料，有效解决自体骨源不足的难题，为各类骨移植治疗提供新的参考依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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