Sema7A干预钛微粒诱导鼠MC3T3-E1成骨细胞的凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.02.001

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (2): 155-161.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.02.001

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Sema7A干预钛微粒诱导鼠MC3T3-E1成骨细胞的凋亡

丛宇，茹江英，赵云龙，俞磊，包倪荣，许斌，赵建宁

解放军南京军区南京总医院(解放军第二军医大学南京临床学院)骨科，江苏省南京市 210002

收稿日期:2015-10-17 出版日期:2016-01-08 发布日期:2016-01-08
通讯作者: 赵建宁，教授，博士生导师，解放军第二军医大学南京临床学院(解放军南京军区南京总医院骨科)，江苏省南京市 210002
作者简介:丛宇，男，1978年生，江苏省如东市人，汉族，解放军第二军医大学在读博士，主治医师，主要从事关节骨科、脊柱骨科的研究。
基金资助:
南京军区医药卫生科研基金面上项目(14MS112)；江苏省临床医学科技专项资助(BL2012002)

Semaphorin7A intervention for titanium particles-induced apoptosis in mouse MC3T3-E1 osteoblasts

Cong Yu, Ru Jiang-ying, Zhao Yun-long, Yu Lei, Bao Ni-rong, Xu Bin, Zhao Jian-ning

Department of Orthopedics, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Region of Chinese PLA (Nanjing Clinical Medical School Affiliated to the Second Military University of Chinese PLA), Nanjing 210002, Jiangsu Province, China

Received:2015-10-17 Online:2016-01-08 Published:2016-01-08
Contact: Zhao Jian-ning, Professor, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Region of Chinese PLA (Nanjing Clinical Medical School Affiliated to the Second Military University of Chinese PLA), Nanjing 210002, Jiangsu Province, China
About author:Cong Yu, Studying for doctorate, Attending physician, Department of Orthopedics, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Region of Chinese PLA (Nanjing Clinical Medical School Affiliated to the Second Military University of Chinese PLA), Nanjing 210002, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Medical and Health Research Foundation of Nanjing Military Area Command, No. 14MS112; the Clinical Medical Science and Technology Foundation of Jiangsu Province, No. BL2012002.

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

Sema7A：也称为CD108，它通过整合素1在轴突导向分子和巨噬单核细胞方面以及不依赖于Plexin-C1的MAPK信号传导通路起着重要作用，在成骨细胞和破骨细胞分化全过程中都有Sema7A表达，Sema7A通过整合素1增加了成骨细胞谱系的迁移。

成骨细胞：是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。破骨与成骨过程的平衡是维持正常骨量的关键。

背景：Sema7A是一种细胞表面蛋白，它可以促进破骨细胞的融合同时促进成骨细胞的迁移，从而影响骨的动态平衡。推测，Sema7A siRNA可能减弱钛微粒成骨细胞分化。
目的：分析信号素7A(Sema7A)对钛颗粒抑制鼠MC3T3-E1前成骨细胞活性过程的影响。
方法：取第六七代生长状态良好的小鼠颅骨前成骨细胞(MC3T3-E1)，分为4组培养。其中空白对照组为单独培养的细胞；标准对照组加入了钛微粒共培养；实验1组加入Sema7A 过表达质粒，实验2组加入Sema7AsiRNA进行干扰。采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况；Q-PCR检测骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白的mRNA表达情况；Western-blot检测骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白的蛋白表达情况；茜素红钙结节染色检测成骨细胞的矿化程度。
结果与结论：结果提示标准对照组、实验1组检测到骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白表达明显减少而实验2组骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白则比标准对照组表达增加(P < 0.05)。流式细胞仪结果提示实验1组成骨细胞凋亡率明显高于其他组(P < 0.05)，而实验2组则比标准对照组凋亡率降低(P < 0.05)。茜素红染色检测结果显示实验1组未见明显的矿化结节，实验2组有矿化结节形成。结果表明通过基因干扰技术抑制Sema7A 活性可以对钛颗粒抑制鼠MC3T3-E1成骨细胞分化的过程进行干扰，进而为临床上用生物技术治疗磨损微粒诱导的骨溶解问题提供了一条可行的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0003-2187-6645(赵建宁)

关键词: 组织构建, 成骨细胞, Sema7A, MC3T3-E1, 骨涎蛋白, 骨钙素, Ⅰ型胶原蛋白, 人工关节, 无菌性松动, 骨溶解

Abstract:

BACKGROUND: Semaphorin7A (Sema7A) is a kind of cell surface protein, which can promote the fusion of osteoclasts and the migration of osteoblasts at the same time, affecting the dynamic balance of the bone. It is speculated that Sema7A siRNA may inhibit osteoblast apoptosis induced by titanium particles.

OBJECTIVE: To study the effect of Sema7A on the preosteoblast activity inhibited by titanium particles.

METHODS:Mouse MC3T3-E1 preosteoblasts at passages 6 and 7 were divided into four groups: in blank control group, MC3T3-E1 cells were cultured alone; in standard control group, cell were cultured with titanium particles; in experimental groups 1 and 2, the cells were cultured with titanium particles+Sema7A overexpression plasmids and titanium particles+Sema7A siRNA, respectively. Apoptotic rate of MC3T3-E1 cells was detected by flow cytometry; the mRNA expression of bone sialoprotein, osteocalcin and type I collagen was detected by Q-PCR; western blot assay was adopted to detect the protein expression of bone sialoprotein, osteocalcin and type I collagen; alizarin red calcium nodule staining was taken to detect the degree of osteoblast mineralization.

RESULTS AND CONCLUSION: The expressions of bone sialoprotein, osteocalcin and type I collagen were decreased in the standard control group and experimental group 1, but these expression were significantly increased in the experimental group 2 compared with the standard control group (P < 0.05). Flow cytometry results suggested that the apoptotic rate of osteoblasts in the experimental group 1 was significantly higher than that in the other groups (P < 0.05), and the apoptotic rate in the experimental group 2 was lower than that in the standard control group (P < 0.05). Alizarin red staining showed that there were no obvious mineralized nodules in the experimental group 1, but mineralized nodules formed in the experimental group 2. In brief, the genetic interference technique that inhibits the activity of Sema7A can interfere the process of mouse MC3T3-E1 preosteoblast differentiation inhibited by titanium particles, and thus provide a feasible way for the clinical treatment of wear particles-induced osteolysis using biotechnology.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

丛宇，茹江英，赵云龙，俞磊，包倪荣，许斌，赵建宁. Sema7A干预钛微粒诱导鼠MC3T3-E1成骨细胞的凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(2): 155-161.

Cong Yu, Ru Jiang-ying, Zhao Yun-long, Yu Lei, Bao Ni-rong, Xu Bin, Zhao Jian-ning . Semaphorin7A intervention for titanium particles-induced apoptosis in mouse MC3T3-E1 osteoblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(2): 155-161.

图/表（结果） 7

2.1 Q-PCR检测骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白的mRNA表达情况结果提示4组均可检测到骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白的mRNA表达，空白对照组最多，标准对照组比空白对照组减少，实验1组比标准对照组减少(P < 0.05)，实验2组比标准对照组增加。见图1。

2.2 Western-blot检测骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白的蛋白表达情况结果提示4组均可检测到骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白的蛋白表达，空白对照组表达最多，标准对照组蛋白表达水平比空白对照组减少，实验1组蛋白表达水平比标准对照组减少，实验2组则比标准对照组增加。见图2。

2.3 流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况由下述结果得知，实验1组的凋亡率明显高于其他组，空白对照组的凋亡率明显低于其他组，其次为实验2组凋亡率高于空白对照组，但低于标准对照组。见图3。

2.4 免疫组织化学SP法检测骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白表达阳性细胞百分数光镜下观察骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白阳性细胞的胞浆内有不同程度染色的颗粒。与空白对照组相比，标准对照组骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白染色阳性的细胞百分数明显减少(P < 0.05)；与标准对照组相比，实验1组骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白染色阳性的细胞百分数明显减少(P < 0.05)；与标准对照组相比，实验2组骨涎蛋白、骨钙素、I型胶原蛋白染色阳性的细胞百分数明显增加(P < 0.05)。
2.4.1 骨涎蛋白表达变化见图4。

2.4.2 骨钙素表达变化见图5。

2.4.3 Ⅰ型胶原蛋白表达变化见图6。

2.5 茜素红染色检测各组MC3T3-E1成骨细胞的矿化程度茜素红染色检测结果显示，在倒置显微镜下观察(×400)见空白对照组有较大的矿化结节且染色较深，呈红褐色；标准对照组、实验1组未见明显的矿化结节；实验2组有矿化结节形成，但与空白对照组比较染色较浅，且矿化结节较小，较稀疏。见图7。

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞学随机对照实验。

1.2 时间及地点实验于2014年1月至2015年10月在解放军第二军医大学南京临床学院(南京军区总医院)骨科研究所中完成。

1.3 材料小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14(中科院上海细胞研究院细胞资源中心)；(MC3T3-E1 Subclone 14)细胞株，内毒素检测试剂盒(厦门市鲎试剂有限公司)；Trizol提取液(美国invotrigen公司)；细胞凋亡试剂盒(美国BIOVISION公司)；PCR扩增的上下游引物合成、茜素红S (上海圆创生物科技有限公司)；RT-PCR反转录试剂盒，Taq DNA聚合酶(立陶宛MBI公司(Fermentas))； DNA marke、二甲基亚砜(Gibco公司)；钛合金微粒(南京工业大学材料科学与工程学院)；牛血清蛋白、DAB染色(北京中杉金桥生物技术有限公司)；骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原酶抗体(Abcam公司)；多聚甲醛(上海联试化工试剂有限公司)；Triton X-100(上海生工生物工程股份有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组

1.4.2 钛合金微粒内毒素处理采用Kise-2008激光粒度分析仪复检钛合金微粒，结果显示所选微粒直径范围在1.5-2.0 μm，将微粒用体积分数70%乙醇浸泡48 h后去除乙醇，再用无水乙醇浸泡，沉淀48 h后去除乙醇，干燥后用电子天平每20 mg分装，将微粒悬浮于250 ℃恒温箱中 3 h。处理后根据商业检测试剂盒检测，微粒内毒素小于0.25 EU/mL。

将20 mg钛合金微粒加100 mL含体积分数20%小牛血清的1640培养液中配置好，4 ℃冰箱保存备用。

1.4.3 细胞培养及药物干预 MC3T3-E1细胞置于 37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度的细胞培养箱中常规培养，培养基为含体积分数10%胎牛血清的a-MEM，每24 h换液1次，每四五天传代1次。消化采用含有0.02%EDTA的0.25%胰酶进行消化。将第六七代生长状态良好的MC3T3细胞，以1.5×10⁵/孔接种于6孔细胞培养板。将细胞分3组培养，进行以下实验：标准对照组将配制的钛颗粒悬液，在低频超声振荡下充分混匀后，加入与细胞共同培养。

1.4.4 Sema7A过表达质粒和Sema7A siRNA的制备

过表达载体构建：以MC3T3-E1的cDNA为模板，进行Sema7A的PCR扩增，扩增产物通过限制性内切酶BamH I/ Hind III双酶切回收片段后，用ligation high(Toyobo)连接到pcDNA3.1(Invitrogen)中，HA标签放置在Sema7A的C末端。所有的表达载体均通过DNA测序验证正确。用Endofree Plasmid Maxi kit (Qiagen，Hilden，Germany)试剂盒按照说明书抽提质粒。用JetPEI (Polyplus，Illkirch)按说明书转染细胞。

Sema 7A siRNA：靶向Sema 7A基因的siRNA由上海吉玛公司合成。Sema 7A的siRNA序列：5’-GCU AGA ACU UAU ACG AUG UUU-3’；对照siRNA序列：5’ -UUC UCC GAA CGU GUC ACG U-3’。siRNA用INTERFERin (Illkirch，France)转染试剂按照说明书转染到OCP中。转染36-48 h后Western blot检测干扰效率。

1.4.5 Q-PCR检测成骨细胞标志骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白的mRNA表达情况共培养22 d后，采用Trizol法提取各组培养细胞中的总RNA，根据RT-PCR反转录试剂盒的使用说明，RNA被反转录为cRNA后进行PCR扩增。采用如下50 μL反应体系：三蒸水36 μL，PCR缓冲液5 μL，dNTP 4 μL，MgCl₂ 1.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，cDNA 1 μL(100 ng)和Taq聚合酶0.5 μL。扩增程序为： 94 ℃预变性2 min及变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸50 s(共30个循环)和4 ℃保持。取10 μL RT-PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。

采用Image ProPlus软件软件测定电泳条带的平均吸光度值，计算各组条带的平均吸光度值与GAP平均吸光度值的比值后进行组间比较。

1.4.6 Western-blot检测成骨细胞标志骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白的蛋白表达情况共培养22 d后，收集培养细胞，在预冷的PBS中洗1次后，加入含有蛋白酶抑制剂Cocktail(1∶300，Calbiochem，Germany)的细胞裂解液(Cell Signaling Technology)进行重悬，4 ℃震荡混匀裂解30 min，接着12 000 r/min，4 ℃离心10 min后收集上清置于新EP管中。采用BCA法(Pierce)对蛋白样品进行定量。将蛋白样品用5×上样缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L DTT，4%SDS，0.2%溴酚蓝，20%甘油，pH 6.8)混匀，在沸水中煮5 min，接着进行10%SDS-PAGE电泳。电泳程序采用100 V，20 min浓缩；200 V，70 min分离。随后用恒流300 mA，70 min于冰浴状态下将聚丙烯酰胺中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，丽春红染色并标记大小及方向。随后将膜置于封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST溶液或5%的BSA)室温孵育1 h，将膜在TBST溶液中漂洗1min，接着用滤纸吸干膜上残留水分，加上含有适当浓度的一抗溶液(稀释于含有5%脱脂奶粉或5%BSA的TBST中)，置于层析柜内摇床上4 ℃过夜。将膜放入TBST中洗3次， 10 min/次，然后与稀释于TBST中的HRP标记的二抗，室温置于摇床上孵育1 h，TBST中洗3次，10 min/次。加化学发光底物进行显影检测。

1.4.7 流式细胞仪检测细胞凋亡情况共培养22 d后，收集细胞，用PBS重悬细胞并计数。

取(5-10)×10⁴细胞，1 000 r/min离心5 min后，弃上清，加入195 μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入 5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀。室温避光孵育10 min。1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入190 μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入10 μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

1.4.8 免疫组织化学SP法检测骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白表达阳性细胞百分数移去培养基，用预冷的PBS清洗细胞2次，每次5 min；移去PBS，用预冷的40 g/L多聚甲醛在冰上固定15 min；移去多聚甲醛，用预冷的PBS清洗细胞3次，每次5 min；0.3% Triton X-100室温透化 15 min；移弃Triton X-100溶液，用PBS清洗细胞3次，每次5 min；2%BSA封闭37 ℃，30 min；一抗孵育，4 ℃，过夜；回收一抗，PBS清洗细胞3次，每次5 min；二抗孵育：室温，1 h；DAB染色：1 mL的DAB底物液中，加入一滴DAB浓缩液，混合均匀，即配成DAB工作液。室温染色5 min，镜下观察显色情况，待信号出现及时用PBS清洗2次，每次5 min；镜下拍照并做统计分析。

1.4.9 茜素红钙结节染色检测成骨细胞的矿化程度取第六七代生长状态良好的MC3T3-E1细胞，以5×10⁹ L^-1细胞浓度接种于6孔细胞培养板，经DMEM完全培养基培养72 h后，更换无血清DMEM再培养24 h，按实验分组共培养22 d后，吸弃孔中的培养液，用PBS洗涤3次；加2 mL体积分数95%乙醇固定细胞15 min；吸弃体积分数95%乙醇，用dd H₂O清洗细胞3次；加2 mL 0.1%茜素红- Tris-HCl(pH 4.2)染液染色30 min；用ddH₂O清洗细胞3次；置于倒置显微镜下观察被茜素红染色为桔红色的矿化结节，拍照。

1.5 主要观察指标各组MC3T3-E1细胞活性、分化、凋亡情况，细胞内骨涎蛋白、骨钙素及Ⅰ型胶原mRNA的表达水平，细胞被茜素红染色的矿化结节计数。

1.6 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计分析，组间TRAP阳性破骨细胞数量在ANOVA分析后进行配对t 检验(双侧)，多组间比较采用多因素方差分析，两组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

全髋关节置换是一种安全有效的用于治疗严重退化、创伤后及其它髋关节终末期疾病的方法。然而，随着全髋关节置换术向更年轻更普遍的人群中扩展，翻修手术也因此增多。美国全髋关节置换翻修手术的概率1990到2002年从万分之0.95增至万分之1.52，预计至2030年将更高^[1]。全髋关节置换失败的主要原因是伴有骨溶解的无菌性松动，假体周围骨溶解指的是起初伴随着良好反应的全髋关节置换术后不知不觉进行性的骨吸收。

William Harris提出“微粒病”的概念^[2]，强调假体产生磨损微粒诱导宿主反应的重要性。其具体指非常小的假体磨损微粒刺激假体周围的各种细胞表达促炎性/促破骨性细胞因子和其他物质来增加破骨细胞的活性，并抑制成骨细胞的成骨活性。结果在假体周围的骨吸收过程超过骨生成过程，打破了骨的动态平衡，导致骨溶解的发生进而引起假体松动。不少研究结果表明磨损微粒具有双重作用，即下调与骨形成有关的因子和受体，如成纤维细胞生长因子、TIMP-1和ILGF和整联蛋白Ⅰ(一种对细胞锚定作用很重要的成骨细胞黏附分子)的表达^[7]，减弱碱性磷酸酶的功能促进成骨细胞的凋亡来抑制假体周围骨形成，同时通过诱导白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等炎症因子分泌促进破骨细胞介导的骨吸收^[4-8]。

成骨细胞参与骨骼形成并且来源于间充质细胞，它们合成及分泌用于骨细胞外基质形成的蛋白^[9]。成骨细胞的主要功能是分泌碱性磷酸酶，促进合成Ⅰ型胶原、骨钙素及其他细胞外基质，并最终矿化为骨组织。成骨细胞分化的标志是Ⅰ型胶原蛋白的表达，Ⅰ型胶原蛋白是骨基质的主要有机成分之一，是整合素β1的配体，高度表达于成骨细胞，介导细胞黏附和迁移。而骨钙素是一种可调控基质钙化的骨基质蛋白，被认为是成熟成骨细胞的标志。此外，成骨细胞分化晚期逐步分化成熟并形成矿化结节，它是成骨细胞成骨功能的一个金指标。成骨细胞可以吞噬磨损微粒，并抑制Ⅰ型胶原蛋白的基因表达，Takei等^[10]研究发现磨损微粒对两种人成骨细胞MG-63、SaOS-2的细胞增殖和碱性磷酸酶活性的抑制具有协同作用。磨损微粒对体外培养的成骨细胞的代谢活动有潜在的负性调节，它可以通过自噬引起成骨细胞的凋亡^[11]。对于磨损微粒中的钛微粒来说，1.5-5.0 μm的钛微粒对成骨细胞增殖和活性具有更明显的影响^[12-13]。

Semaphorin家族最早是作为轴突导向分子而被发现^[14]，在病毒、线虫、果蝇、脊椎动物中普遍存在。目前发现Semaphorin家族至少含有20个成员，不同种类的semaphorin蛋白又被分为8类^[15]，前两类是无脊椎动物Semaphorin分子，包括Sema1A、Sema1B和Sema2A，3-7类是脊椎动物Semaphorin分子，包括Sema3A-F，Sema4A-C，Sema5A-B，Sema6A-C和Sema7A；另一类是病毒属Sema8分子。Semaphorin分布广泛，功能复杂，在许多不同组织里面表达，并且调节很多非神经系统的生理过程，Semaphorin7A(Sema7A)又称为CDw108^[12]，是一个通过GPI连接来关联的细胞表面蛋白，其基因位于人类染色体15(25 kb)和小鼠染色体9b(22 kb)上。老鼠和人类Sema7A蛋白质由664和666个氨基酸组成，显示89.5%的序列一致性。PlexinC1和β1-Integrin是Sema7A的2个受体^[16]，研究表明Sema7A及其受体促进破骨细胞活化并促进成骨细胞迁移，在骨的动态平衡中发挥了重要作用。Sema7A存在于成骨细胞分化和成熟的所有阶段：分化期(第2天)、增殖期(第3天)、融合期(第8天)、早期结节形成期(第13和15天)、和结节矿化期(第22天)，Sema7A通过激活FAK和MAPK通路来增加成骨细胞迁移、抑制成骨细胞分化^[17]。在MC3T3细胞系中，Sema7A mRNA有双峰表达，在分化增殖期高表达，即在MC3T3细胞系细胞的第2，3天。在结节早期阶段(第8-15天)，Sema-7AmRNA的表达在MC3T3细胞株中第8-15天显著减少。后期高表达在矿化骨结节形成期(第22天)。

在本实验中Q-PCR检测结果提示4个实验组均可检测到骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白的mRNA表达，空白对照组最多，标准对照组比空白对照组减少，实验1组比标准对照组减少，实验2组比标准对照组增加，Western-blot检测结果和Q-PCR结果相仿，这从基因和蛋白水平都说明Sema7A可以抑制成骨细胞的活性和增殖。流式细胞仪检测结果提示实验1组的凋亡率明显高于其他组，空白对照组的凋亡率明显低于其他组，其次为实验2组凋亡率高于空白对照组，但低于标准对照组，结果提示Sema7A可以促进成骨细胞的凋亡。免疫组织化学SP法检测光镜下观察骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白阳性细胞的胞浆内有不同程度染色的颗粒，与空白对照组相比，标准对照组骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白染色阳性的细胞百分数明显减少；与标准对照组相比，实验1组骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白染色阳性的细胞百分数明显减少；与标准对照组相比，实验2组骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白染色阳性的细胞百分数明显增加。茜素红染色检测结果显示空白对照组空白对照组有较大的矿化结节且染色较深，呈红褐色；标准对照组、实验1组未见明显的矿化结节；实验2组有矿化结节形成，但与空白对照组比较染色较浅，且矿化结节较小，较稀疏。以上各结果均说明在直径为1.5-2.0 μm的钛微粒刺激下成骨细胞凋亡的程度加剧，而Sema7A过表达后，钛微粒诱导的成骨细胞凋亡程度更进一步加深。相反，Sma7A siRNA干扰后，钛微粒诱导的成骨细胞凋亡程度得到很大缓解。引起假体无菌性松动的生物学机制现在仍不十分清楚，既往的研究都把焦点集中在磨损微粒诱导炎症反应继而导致的骨吸收上，因此相应解决人工假体无菌性松动的方法都是针对破骨细胞的信号通路，比如肿瘤坏死因子拮抗剂、环氧化酶抑制剂、RANKL抑制剂、双膦酸盐类的药物治疗等。但现在越来越多的研究认为导致假体松动的骨溶解是破骨细胞介导的骨吸收与成骨细胞介导的骨形成两者维持的平衡被打破，是两方面共同作用的结果，所以治疗方案也应从骨代谢平衡的两方面着手，通过基因干扰技术抑制Sema7A 活性可以对钛颗粒诱导鼠MC3T3-E1成骨细胞凋亡的过程进行干扰，即减弱了磨损微粒诱导成骨细胞的凋亡。另一方面实验发现Sema7A siRNA可以抑制钛微粒诱导的破骨细胞活化过程。利用Sema7AsiRNA可以对骨动态平衡的两方面都起到作用，既干扰了成骨细胞的凋亡同时又抑制了破骨细胞的活化，从细胞实验层面证实其阻断了钛微粒诱导骨溶解过程的发生，进而为临床上用生物技术靶向治疗磨损微粒诱导的骨溶解问题提供了一条可行的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Sema7A干预钛微粒诱导鼠MC3T3-E1成骨细胞的凋亡

Semaphorin7A intervention for titanium particles-induced apoptosis in mouse MC3T3-E1 osteoblasts

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