微孔真空多聚糖止血微球体内降解与生物安全性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.52.015

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (52): 8444-8449.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.52.015

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微孔真空多聚糖止血微球体内降解与生物安全性

杜宝堂¹，史跃²，何远清³，殷文静³，王颖²

¹江苏奥科生物科技有限公司，江苏省镇江市 212003；²解放军第97医院介入放射科，江苏省徐州市 221004；³江苏大学实验动物中心，江苏省镇江市 212002

收稿日期:2015-11-09 出版日期:2015-12-17 发布日期:2015-12-17
通讯作者: 史跃，副主任医师，解放军第97医院介入放射科，江苏省徐州市 221004
作者简介:杜宝堂，男，1965年生，汉族，江苏省南京市人，1996年南京医科大学毕业，博士，教授，主要从事生物医药研究。
基金资助:
南京军区医学科技创新重点资助项目(2014ZD15)

In vivo degradation and biological safety of microporous vacuum polysaccharide hemostatic microspheres

Du Bao-tang¹, Shi Yue², He Yuan-qing³, Yin Wen-jing³, Wang Ying²

¹Jiangsu AOKE Biomedical Technology Co., Ltd., Zhenjiang 212003, Jiangsu Province, China; ²Department of Interventional Radiology, the 97^th Hospital of Chinese PLA, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China; ³Centre of Experimental Animal, Jiangsu University, Zhenjiang 212002, Jiangsu Province, China

Received:2015-11-09 Online:2015-12-17 Published:2015-12-17
Contact: Shi Yue, Associate chief physician, Department of Interventional Radiology, the 97th Hospital of Chinese PLA, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China
About author:Du Bao-tang, M.D., Professor, Jiangsu AOKE Biomedical Technology Co., Ltd., Zhenjiang 212003, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Medical and Science Technology Innovation Plan of Nanjing Military Region, No. 2014ZD15

摘要/Abstract

摘要：

背景：微孔真空多聚糖止血微球是一种具有自主知识产权的可吸收高分子止血材料，它来源于变性马铃薯植物淀粉，经特殊加工工艺制备而成。
目的：将微孔真空多聚糖止血微球埋植于大鼠体内，观察止血微球在体内降解情况，检测体液各项安全性指标。
方法：将0.1-0.2 g微孔真空多聚糖止血微球埋植于12只大鼠左侧脊柱皮下组织内，分别于植入后1，3，7，14 d，观察止血微球在组织内降解情况。实验另取15只大鼠，5只为对照组正常饲养，将另外10只麻醉，在脊柱两侧做2道切口，长约5 cm，深至肌层0.3 cm，在切口喷撤适量止血微球覆盖整个创面，缝合切口，正常饲养14 d，观察大鼠外观体征、行为活动、排泄、摄食情况，进行体液各项指标检测。最后解剖大鼠，观察主要器官的大体形态及颜色变化。
结果与结论：埋植大鼠体内的微孔真空多聚糖止血微球7 d完全降解吸收。切口喷撤适量止血微球后，大鼠生命体征正常；血液及尿液检查各项生化指标均正常；肝、脾、脑、肾等主要器官大体形态及颜色均未发现明显异常变化。结果证实，微孔真空多聚糖止血微球可被体内的淀粉酶酶解为单糖，在体内7 d完全降解吸收，对组织器官无任何毒副反应。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 微孔真空多聚糖, 高分子材料, 可吸收, 马铃薯淀粉, 降解, 大鼠

Abstract:

BACKGROUND: Microporous vacuum polysaccharide hemostatic microspheres are derived from degenerated potato plant starch and prepared through special processing. It is an ideal absorbable polymer styptic material with independent intellectual property rights. OBJECTIVE: To observe the degradation of microporous vacuum polysaccharide hemostatic microspheres and detect the safety indicators of body fluids by implanting microporous vacuum polysaccharide hemostatic microspheres in rats.
METHODS: 0.1-0.2 g microporous vacuum polysaccharide hemostatic microspheres were implanted subcutaneously on the left side of the spine in 12 rats. At the 1st, 3rd, 7th and 14th days after implantation,
the degradation of microporous vacuum polysaccharide hemostatic microspheres in the tissue was observed. Another 15 rats were selected, of which 5 rats were taken as the control group and fed normally, and 10 rats were subjected to anesthesia. Two incisions were made on both sides of the spine, about 5 cm, deep into the muscular layer of 0.3 cm. The right amount of hemostatic microspheres were sprayed on the incisions and covered the entire wound, then the incisions were sutured. The 10 rats were raised normally for 14 days. The various indicators of body fluids such as appearance features, activities, excretion, feeding were detected. Finally, the rats were dissected, and the gross morphology and color changes of main organs were observed.
RESULTS AND CONCLUSIONS: The microporous vacuum polysaccharide hemostatic microspheres buried in rats were completely degraded and absorbed within 7 days. After spraying the right amount of microporous vacuum polysaccharide hemostatic microspheres on the incision, the vital signs and biochemical indicators, such as blood and urine tests were all normal. The gross morphology and color of main organs such as liver, spleen, brain and kidney were not found significant anomalies. These results demonstrate that microporous vacuum polysaccharide hemostatic microspheres can be degraded into monosaccharide by amylase and can be completely degraded and absorbed within 7 days, without any side effects to tissues and organs.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

中图分类号:

R318

杜宝堂，史跃，何远清，殷文静，王颖. 微孔真空多聚糖止血微球体内降解与生物安全性[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(52): 8444-8449.

Du Bao-tang, Shi Yue, He Yuan-qing, Yin Wen-jing, Wang Ying. In vivo degradation and biological safety of microporous vacuum polysaccharide hemostatic microspheres[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(52): 8444-8449.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析纳入SD大鼠均进入结果分析，实验过程中无脱失，无死亡和感染。
2.2 微孔真空多聚糖止血粉体内降解情况实验1组术后1 d，大部分微孔真空多聚糖止血微球被吸收，仅有少量未吸收微孔真空多聚糖止血微球在碘溶液的显色下呈浅紫色(图1A)；术后3 d，只有极少量微孔真空多聚糖止血微球未被吸收，显色明显变淡(图1B)；术后7，14 d未见碘溶液显色，两侧碘液颜色基本一致，肉眼未见不可溶解吸收的微孔真空多聚糖止血微球(图1C、D)。

2.3 大鼠埋植微孔真空多聚糖止血微球后肌组织变化高倍镜下观察，实验1组术后1 d肌组织轻度水肿、小血管扩张、间质内可见少数散在中性粒细胞浸润(图2A)；术后 3 d肌组织表面呈急、慢性炎症表现，组织轻度水肿、小血管扩张、间质内可见少数散在中性粒细胞浸润(图2B)；术后7 d炎症消退、肌组织表面轻度纤维化，接近正常对照组，肌细胞未见明显变化(图2C)，与对照组(图2D)无明显差异。

2.4 术后SD大鼠生命体征变化实验2组术后14 d内观察对照组和实验组SD大鼠生命体征，术前3 d实验组SD大鼠精神状态欠佳、活动少，3 d后状态良好，行动迅速、活跃，被毛光滑，饮水、采食及排泄与对照组相比较均无异常。
2.5 安全性指标分析结果分别于术后1，3，7，14 d，采集血液、尿液进行检验。实验组与对照组的血常规、血生化和尿常规数据如表1，2所示。表1数据除了术后3 d实验组的白细胞和淋巴细胞数量与对照组相比差异有显著性意义外(P < 0.05)，在各时间点下实验组的红细胞、白细胞、淋巴细胞、血红蛋白和血小板计数与对照组相比均差异无显著性意义(P > 0.05)。表2中血液生化检测表明：术后7 d实验2组的总胆红素、7 d时实验组的谷丙转氨酶含量与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，术后3 d时实验2组的肌酐含量与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.01)；在其他各时间点下，实验2组的总胆红素、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮和肌酐水平与对照组相比，均差异无显著性意义(P < 0.05)。尿常规检测表明：无论是实验组还是对照组，尿样中的红细胞、白细胞、尿蛋白和尿胆红素含量均为0，尿胆原均正常。

2.6 埋植微孔真空多聚糖止血微球后大鼠主要脏器一般形态于术后14 d麻醉处死实验2组SD大鼠，并进行解剖，观察肝、脾、脑、肾等主要器官，组织器官的形态、大小及颜色均未发现明显异常变化，大体观察与对照组一致(图3)。

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引言

创伤出血是战场及各类事故现场的最常见伤情之一，出血失控是导致伤员现场死亡的首要原因^[1-4]。多数出血严重的伤员即使被送至医院抢救，院前大量失血仍会造成较高的死亡率和严重的并发症，因此在现场和院前对出血伤员进行有效止血意义重大^[5]。长期以来，传统的院前急救方法以止血带止血为主，止血带是能控制出血的救生器材，但对于人体很多部位，如胸、腹、头、颈等，止血带是无法使用或无效的。此外，传统止血材料(如棉纱和绷带)对于不规则创面，特别是深、窄、动脉破裂等现场常见创伤的止血效果很不理想。因此，开发针对现场和院前急救使用的，快速、安全、有效的新型止血材料成为医学和生物材料科学领域中的一项重要课题^[5-6]。

随着医学、生物工程学及材料学在21世纪的发展，各种新型止血材料不断问世^[7]。逐渐由不可吸收向可吸收方向转化，由动物源向植物源方向转化，由蛋白类逐渐向糖类的转化。可吸收止血材料产品种类繁多，目前上市产品主要有微纤维胶原、医用止血明胶、氰基丙烯酸类组织胶、蛋白类止血材料以及多糖类止血材料等，其在临床及日常生活中的应用极为广泛^[8]。纤维蛋白胶、医用止血明胶、微纤维胶原以及胶原纤维网等止血材料具有动物源性，可诱发患者发生过敏反应，存在较高的潜在使用风险^[9]。氰基丙烯酸类组织胶类止血材料在降解过程中释放出氰和甲醛等有毒物质，会引起炎症反应或伤口愈合延迟，存在较大的安全隐患，限制了其在战、创伤及日常生活中的广泛应用^[10]。多糖类可吸收止血材料是自然界中大量存在的天然高分子材料，具有来源丰富、价格低廉、生物相容性好、在人体内易被降解吸收、不良反应少等诸多优势，成为当前止血材料的研究热点^[11-12]。

微孔真空多聚糖止血微球(microporous vacuum polysaccharide hemispheres，MVPH)，亦称微孔真空多聚糖止血粉，是一种自主研发的新型高分子材料，它来源于马铃薯植物淀粉，经糊化、酶解、交联、乳化等工艺制备而成，目前国内尚无同类具有自主知识产权的产品面市。实验旨在通过建立SD大鼠出血模型，观察微孔真空多聚糖止血微球在局部组织内的降解状况、检测其对血常规、肝功能、尿常规等安全性指标，以及对主要脏器组织大体情况的影响，为临床应用奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料学动物实验。

1.2 时间及地点于2013年11月25日至2014年1月15日在江苏大学实验动物中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物清洁级健康SD大鼠27只，体质量180-200 g，14只雄性，13只雌性；随机分为3组，实验1组取12只，雌雄各6只；实验2组取10只，雌雄各5只；对照组5只，雄性3只，雌性2只。由江苏大学实验动物中心提供，动物饲养合格证号为：SYXK(苏)2008-0024。实验过程动物处置符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》中的标准^[13]。动物实验、组织内降解和安全性检测以及观察大鼠主要脏器组织变化。

参照：①GBT16886.6-2003医疗器械生物学评价，第16部分：降解产物和可溶出物的毒代动力学研究设计；②GBT 16886.6-1997医疗器械生物学评价，第6部分：植入后局部反应试验。

SD大鼠饲养在屏障动物房内，专人饲养。动物房室温控制在(20±2) ℃，湿度40%-70%，12 h照明，12 h黑暗。用标准基础鼠饲料进行喂食，定时向饲料盒内添加足量饲料，由SD大鼠自由采食。用饮水瓶提供足量的消毒饮用水，由SD大鼠自由饮水，定时更换饮水瓶及饮用水。

1.3.2 止血材料微孔真空多聚糖止血微球(商品名：奥速凝，MVPH)由江苏奥科生物科技有限公司提供(生产许可证：苏食药监械生产许2012-0092号)，规格1 g/支，白色粉末状。

1.4 方法

1.4.1 体内降解情况观察取12只SD大鼠设为实验1组，腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠，背部剃毛，在脊柱两侧做两道2 cm×0.3 cm切口，切口相距1 cm，向切口外侧分离皮下组织2 cm，将0.1-0.2 g止血粉埋植于左侧脊柱皮下组织内，右侧为对照侧，缝合切口，正常饲养SD大鼠。分别于植入后1，3，7，14 d，各处死3只大鼠，分别切开脊柱两侧原切口部位，于原埋植微孔真空多聚糖止血微球位置滴加碘溶液，观察止血粉在组织内降解情况。用苏木经-伊红染色法光学显微镜下观察植入后1，3，7，14 d大鼠肌组织变化。

1.4.2 安全性评估取15只SD大鼠随机分为实验2组10只和对照组5只，同前进行麻醉，背部剃毛，在脊柱双侧做2道切口(长约5 cm，深至肌层0.3 cm)，同上向切口外侧分离皮下组织2 cm，在肌肉伤口喷洒适量止血粉覆盖整个伤口，缝合切口，正常饲养14 d。观察SD大鼠外观体征、行为活动、排泄、摄食，进行体液各项指标检测。最后将实验动物全部解剖，对比观察主要脏器的大体形态变化。

1.4.3 不良反应评估标准分别于喷洒微孔真空多聚糖止血微球缝合切口后，于15 min，1 h，1 d，2 d，3 d观察SD大鼠有无精神状态欠佳、活动少等，以及局部皮肤有无红斑、水肿等不良反应现象。

1.5 主要观察指标分别于术后1，3，7，14 d，观察局部碘溶液颜色的变化，未被吸收的微孔真空多聚糖止血微球遇到碘溶液变为紫蓝色。分别于术后1，3，7，14 d，采集血液和尿样进行以下检测，①血常规：红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血细胞分类、血红蛋白(Hb)、血小板计数(PLT)；②肝功能：总胆红素(TB)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)；③尿常规：红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、尿蛋白(PRO)、酮体(KET)、尿胆原(URO)、尿胆红素(BIL)。

1.6 统计学分析实验数据由第二作者采用SPSS 18.0统计学软件进行统计学处理，计量资料以x(_)±s表示，计数资料采用百分率表示，组间数据差异的比较采用χ²分析和t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

目前，国内外疗市场上应用于临床的止血材料种类很多，归纳起来主要有生物制品类、硅铝酸盐类以及多聚糖3大类止血材料^[14-16]，产品主要以止血纱、止血海绵、止血贴、止血胶等贴剂和胶剂为主，粉剂较少。医疗市场上应用最为广泛和有效可吸收的生物类止血产品是纤维蛋白胶，纤维蛋白胶产品种类繁多，大部分产品主要由纤维蛋白原、凝血酶、凝血因子VIII和抑酶肽四个部分组成^[17-19]。生物蛋白类止血材料多数来源血制品，以动物源性为主，容易导致病源感染和免疫反应^[20-21]。美国Z-Medica公司开发的商品名为Quikclot新型粉末状止血材料以及中国人民解放军研发的“血盾”圆形小颗粒状速效止血粉^[22]，为硅铝酸盐类的代表产品，广泛应用于局部战场和训练中，其在阿富汗被特种部队成功用于战伤止血，美军曾批量装备于伊拉克战争中的海军陆战队^[23]。
Quikclot及“血盾”止血粉的主要成分为沸石，粒度为0.2-0.1 mm，化学本质为改型的高交换度Ca-A型分子筛。沸石是自然界中一种矿物质，晶体内部存在大量排列有序的、大小均匀的、彼此贯通并与外界相连的孔穴和孔道，这种特殊的结构使沸石具有分子筛、吸附、离子交换性能和催化等功能；它的特点是直接作用伤口时具有选择性吸收血液中的水分子，而不吸收血液中其他有形成分，使血小板和凝血因子的浓缩；同时在吸水后产生的热量能增强血小板的凝聚速度和凝聚能力，显著提高大面积、严重创伤的生存率等^[22]。可吸收多聚糖类止血材料代表产品主要包括壳聚糖和微孔多聚糖止血微球，中国医疗市场应用壳聚糖可吸收止血敷料类材料较多，在临床使用中发现壳聚糖止血敷料止血时间较长、易于伤口黏连、不利于伤口愈合。因此，国内学者将其制备成壳聚糖止血粉，扩大了壳聚糖的应用范围^[24]。由于壳聚糖是来源于海洋的天然高分子化合物，广泛存在于甲壳类动物以及虾、蟹的甲壳、昆虫的甲壳、真菌和植物的细胞壁中，存在着潜在的致敏原；同时对于广泛出血的创面，壳聚糖的止血效果有限，因此常采用复合其他止血剂的方法来弥补壳聚糖止血的局限性^[10]。微孔真空多聚糖止血微球由解放军第九七医院联合江苏奥科生物科技有限公司共同研发，于2013年获国家发明专利，具有自主知识产权^[25-26]，是以马铃薯植物淀粉为原料提取的一种新型的多糖类可吸收止血材料。降解实验研究显示，实验1组的大鼠皮下软组织埋植微孔真空多聚糖止血微球止血粉后，术后7，14 d均未见碘溶液显色，两侧碘液颜色基本一致，肉眼未见不可溶解吸收的止血粉，组织学观察与对照组基本一致，表明止血粉在组织内7 d时已经完全代谢。实验2组于术后14 d内观察SD大鼠，前3 d实验组SD大鼠精神状态欠佳、活动少，3 d后状态良好，行动迅速、活跃，被毛光滑，与对照组相比较无异常。饮水、采食显示差异不显著，两组排泄均正常，SD大鼠饲养14 d无死亡；SD大鼠血常规检测术后7 d后差异不显著、血液生化检测术后14 d差异不显著、尿常规检测两组差异不显著；术后14 d处死SD大鼠，进行大体解剖，肉眼观察肝、脾、脑、肾等主要组织器官均未发现明显异常变化。实验1组结果显示，术后1 d大部分微孔真空多聚糖止血微球被吸收，仅有少量未吸收微孔真空多聚糖止血微球在碘溶液的显色下呈浅紫色；术后3 d，只有极少量微孔真空多聚糖止血微球未被吸收，显色明显变淡；术后7，14 d未见碘溶液显色，表明微孔真空多聚糖止血微球在体内7d完全代谢。实验2组结果显示，术后1，3，7，14 d，采集血液、尿液进行检验，在各时间点下实验组的红细胞、白细胞、淋巴细胞、血红蛋白、血小板计数与对照组相比均无明显差异；总胆红素、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐含量与对照组相比，均无显著性差异；尿常规检测表明，无论是实验组还是对照组，尿样中的红细胞、白细胞、尿蛋白、尿胆红素含量均为0，尿胆原均正常。以上实验研究表明，微孔真空多聚糖止血微球止血粉应用于软组织出血创面后，在体内可以快速降解、吸收、不残留，对局部组织及肝、脾、脑、肾等主要组织器官无不良影响。为下一步的临床应用提供了可靠依据。
来源于马铃薯植物淀粉可吸收性多聚糖止血微球，已广泛应用于外科临床手术止血及各种创面止血。近年来，中国使用的同类产品为微孔多聚糖止血微球(Microporous polysaccharide hemispheres，MPH)有AristaTM和PerClotTM两种，均为美国进口产品。AristaTM和PerClotTM分别由美国Medafor Inc和Starch Medical Inc公司生产，2006年通过美国FDA认证，被广泛应用于急救和临床手术中^[27]。牛雯等[28]报道应用PerClotTM可吸收止血粉溶液分别于大鼠颅内、腹腔注射，进行颅内以及腹腔内的降解实验，注射后30，60和120 min结果显示脑组织内PerClotTM残留率分别为38.62%，6.48%和0.85%，腹腔残留率分别为64.08%，33.36%和1.78%。表明MPH可在短时间内被组织降解吸收，具有良好的组织相容性，同时不影响组织器官的功能，是一种安全的术中止血材料。而其他可吸收止血材料，如氧化纤维素的降解时间为2-6周^[29]；国产可吸收止血材料-泰绫，成分为天然植物中提取的再生纤维，降解吸收时间为7-10 d^[30]；医用生物吻合胶α-氰基丙烯酸酯，在人体内降解时间为三四周^[31]；微纤维胶原艾薇停降解时间为8周[32]；临床上应用较多的壳聚糖止血材料，降解时间为4周至6个月^[33-35]。因此，来源于马铃薯植物淀粉的MPH在体内降解吸收明显优于其他止血材料。
实验提供的微孔真空多聚糖止血微球止血粉，可被体内的淀粉酶完全酶解为单糖，在体内7 d降解吸收完全，并被组织细胞作为能量利用，最终产物为CO2和H2O，不影响组织创面愈合，同时减少了感染概率的发生，是一种较理想的国产化可吸收止血材料，目前已基本完成动物实验研究进入临床应用试验研究阶段，前景广阔。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

微孔真空多聚糖止血微球体内降解与生物安全性

In vivo degradation and biological safety of microporous vacuum polysaccharide hemostatic microspheres

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