Nrf2介导姜黄素对软骨细胞氧化应激损伤的保护作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.51.004

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (51): 8218-8222.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.51.004

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Nrf2介导姜黄素对软骨细胞氧化应激损伤的保护作用

宋永周¹，关健²，李明¹，马维¹，袁鹤¹，王斌¹，童九辉¹

¹河北医科大学第二医院骨科，河北省石家庄市 050000；²石家庄市第三医院关节外科，河北省石家庄市 050011

收稿日期:2015-11-09 出版日期:2015-12-10 发布日期:2015-12-10
通讯作者: 马维，博士，教授，河北医科大学第二医院骨科，河北省石家庄市 050000
作者简介:宋永周，男，1973年生，河北省深泽县人，汉族，2009年河北医科大学毕业，博士，副教授，主要从事骨关节退行性疾病的研究。
基金资助:
河北省医学科学研究重点课题(20150666)

Nrf2-mediated curcumin protects chondrocytes from oxidative stress

^{Song Yong-zhou¹, Guan Jian², Li Ming¹, Ma Wei¹, Yuan He¹, Wang Bin¹, Tong Jiu-hui¹}

¹Department of Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China; ²Department of Joint Surgery, Third Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050011, Hebei Province, China

Received:2015-11-09 Online:2015-12-10 Published:2015-12-10
Contact: Ma Wei, M.D., Professor, Department of Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China
About author:Song Yong-zhou, M.D., Associate professor, Department of Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China
Supported by:
the Medical Scientific Research of Hebei Province, No. 20150666

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明氧化应激在骨关节炎的发生发展中起重要作用，姜黄素具有抗氧化、清除自由基作用。
目的：通过建立H2O2诱导软骨细胞损伤模型，观察姜黄素对软骨细胞的保护作用。
方法：体外培养SD大鼠关节软骨细胞，随机分为正常组、模型组(H2O2)、姜黄素低、中、高剂量剂量组(20，40，80 μmol/L)。姜黄素与软骨细胞培养48 h后，加入H2O2，24 h后收集细胞，MTT法测定细胞存活率，测定细胞超氧化物歧化酶、丙二醛、过氧化氢酶含量，Real-Time PCR和Western blot法检测细胞Nrf2 mRNA及其蛋白表达水平，荧光显微镜观察细胞核形态变化。
结果与结论：与正常组比较，模型组软骨细胞存活率降低，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶含量降低，丙二醛含量增加，Nrf2 mRNA及其蛋白表达水平下调，呈现出凋亡细胞的特征。经姜黄素预先处理，软骨细胞存活率升高，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶含量升高，丙二醛含量降低，Nrf2 mRNA及其蛋白表达水平升高，细胞核形态改善，随姜黄素浓度升高变化更明显。结果说明，姜黄素对H2O2所致软骨细胞氧化应激损伤保护作用可能是通过增强Nrf2表达来实现的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 软骨细胞, 姜黄素, 氧化应激, Nrf2

Abstract:

BACKGROUND: Several studies have showed that oxidative stress plays an important role in the development of osteoarthritis. Curcumin has the effect of antioxidation and eliminating free radicals.
OBJECTIVE: To observe the protective effect of curcumin on chondrocytes through the establishment of a model of oxidative stress damage induced by H2O2.
METHODS: Sprague-Dawley rat articular chondrocytes were prepared and cultured in vitro. Then, the cells were randomly divided into five groups: normal, model (H2O2), low-, mediate-, high-dose curcumin groups (20, 40, 80 μmol/L). Curcumin and chondrocytes were incubated about 48 hours, and then H2O2 was added and co-cultured for 24 hours. Cell viability was detected by MTT assay, and the levels of superoxide dismutase, malondialdehyde, catalase in cells were detected. The mRNA and protein expressions of Nrf2 were detected by real-time PCR and western blot, respectively. The changes of cell nucleus shape were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the normal group, in the model group, the survival rate of chondrocytes decreased; the levels of superoxide dismutase and catalase decreased, while the level of malondialdehyde increased; the mRNA and protein expressions of Nrf2 were down-regulated, and the
characteristics of apoptotic cells were presented. Compared with the model group, in the three groups pretreated with curcumin, the survival rate of chondrocytes increased; the levels of superoxide dismutase and catalase increased, while the level of malondialdehyde decreased; the mRNA and protein expressions of Nrf2 were up-regulated, and the morphology of cell nucleus was improved by curcumin pretreatment. With the increase of concentration, these changes were more obvious. These findings indicate that the protective effect of curcumin against oxidative stress injury induced by H2O2 in chondrocytes can be achieved by enhancing the expression of Nrf2.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

中图分类号:

R318

宋永周，关健，李明，马维，袁鹤，王斌，童九辉. Nrf2介导姜黄素对软骨细胞氧化应激损伤的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(51): 8218-8222.

Song Yong-zhou, Guan Jian, Li Ming, Ma Wei, Yuan He, Wang Bin, Tong Jiu-hui. Nrf2-mediated curcumin protects chondrocytes from oxidative stress[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(51): 8218-8222.

图/表（结果） 4

2.1 细胞培养观察检测倒置显微镜下观察，原代软骨细胞12 h开始贴壁，24-72 h大部分贴壁。细胞有一两个核仁，胞核清晰，7 d左右铺满培养皿底面。传代周期5-7 d。经甲苯胺蓝染色后，细胞质染成浅蓝色，细胞核染成深蓝色，清晰可见一两个核仁。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，胞浆被染成棕黄色，细胞相互接触少的地方棕色较淡，细胞密集生长的地方棕色较深，并且细胞外也可见到棕色。说明在培养的软骨细胞和细胞外基质中有Ⅱ型胶原表达，培养的细胞具有软骨细胞的特征[7-8](图1)。

2.2 姜黄素对H2O2损伤的软骨细胞存活率的影响对各组细胞活力检测表明，经H2O2处理后模型组与对照组相比较，软骨细胞存活率明显降低，差异有显著性意义(P < 0.01)。而经用40，80 μmol/L姜黄素预先处理的中、高剂量组，软骨细胞存活率明显提高，差异有显著性意义(P < 0.05，P < 0.01)。见表1。
2.3 姜黄素对H2O2损伤的软骨细胞超氧化物歧化酶、丙二醛、过氧化氢酶的影响通过与对照组进行比较，经H2O2处理后软骨细胞丙二醛含量增加，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性降低，差异有显著性意义(P < 0.01)；而经用姜黄素中、高剂量预先处理后，丙二醛含量降低，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性增强，差异有显著性意义(P < 0.05，P < 0.01)，提示姜黄素预先处理可减少H2O2造成的氧化应激损伤。见表1。

2.4 Nrf2 mRNA及其蛋白表达水平 H2O2模型组与对照组比较，Nrf2 mRNA及其蛋白表达水平均明显降低(P < 0.01)，姜黄素中、高剂量与模型组比较，Nrf2 mRNA及其蛋白表达水平均明显升高(P < 0.05，P < 0.01)，提示姜黄素可以促进Nrf2的表达。见图2，表2。

2.5 Hoechst33258核染色荧光显微镜观察细胞内DNA形态，正常组软骨细胞胞核较大，染色质呈均质状，为弥漫均匀的低强度荧光；0.1 mmol/L H2O2作用24 h后出现大量凋亡细胞，表现为细胞核呈现固缩形态，浓染致密；经用不同浓度姜黄素预处理后，浓染致密固缩形态的软骨细胞明显减少，且随剂量增加变化更加明显，荧光强度渐降低。见图3。

参考文献

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引言

骨关节炎又称增生性关节炎或退行性关节炎，是中老年患者中最常见的关节疾病，随年龄增长而发病率明显增加，主要病变是关节软骨的退行性变和继发性骨质增生，进行性关节破坏，临床上主要表现为关节畸形、疼痛和功能失用。骨关节炎病因复杂，发病机制未明。近年来氧化应激对关节软骨的损伤作用已开始为人们所认识，并成为研究的热点^[1]。
核转录因子红细胞系2(NF-E2)p45相关因子2(nuclear factor-erythroid 2 p45-related factor 2，Nrf2)是近年来发现的在调控氧化应激中起主要作用的因子^[2]。在正常情况下，Nrf2位于细胞质中与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1 (Keap1)以二聚体的形式处于结合态而存在于细胞胞浆中，细胞处于稳定状态。在氧化应激源作用下，Keap1构型发生改变，二者发生解离，Nrf2转移入核，与抗氧化反应原件(ARE)结合，启动下游编码抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的基因表达，发挥细胞保护作用。
姜黄素是一种来源于姜黄的植物多酚，是一种天然的抗氧化剂，具有抗肿瘤、抗炎和清除自由基等多方面药理作用，可以抑制细胞氧化损伤和炎症反应^[3-4]，对免疫系统、心血管系统及消化系统有良好的调节作用。同时Nrf2也是姜黄素作用的重要靶标，激活Nrf2是姜黄素药理作用的重要分子机制^[5-6]。然而，Nrf2在姜黄素保护软骨细胞损伤中的作用少见报道。
H2O2是活性氧的一种，体内可转变成-OH，其毒性更强，常被用来观察细胞的氧化应激损伤。本研究利用H2O2作为外源性氧化剂处理软骨细胞，从而模拟氧化应激导致细胞损伤，同时用姜黄素预先处理，探讨姜黄素对软骨细胞氧化应激的保护作用，为姜黄素治疗骨关节炎提供实验依据。

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材料方法

1.1 设计分组对照细胞学实验。
1.2 时间及地点实验于2014年5月至2015年7月在河北医科大学第二医院实验动物中心完成。
1.3 实验方法
1.3.1 软骨细胞的培养参照作者已发表的文章方法[7-8]：

取新生1周SD大鼠脱颈处死，无菌条件下切取双侧髋膝关节软骨，放入培养皿，浸入L-DMEM中漂洗数次，剪碎至 1 mm×1 mm大小，L-DMEM再次漂洗，除去上清液后将软骨组织移入另一培养皿，加入胶原酶NB4(0.3 U/mL)，37 ℃消化4 h。消化后将细胞悬液以150目不锈钢滤网过滤， 1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入含体积分数10%胎牛血清、双抗(青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL)的L-DMEM培养基，锥虫蓝染色检查死亡细胞比例，血球计数板计数，以1×108 L-1细胞浓度接种于培养瓶，置于CO2培养箱中培养(温度37 ℃，饱和湿度，体积分数5%CO2)。48 h后视细胞贴壁情况更换培养液，以后每两三天换液1次。倒置显微镜下观察细胞生长情况。
当倒置显微镜下观察软骨细胞汇合成片长满大部分培养瓶壁后，倾去培养液，加入0.25胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸进行传代培养。甲苯胺蓝染色及SABC法Ⅱ型胶原免疫组织化学染色证实培养细胞为软骨细胞。采用二三代软骨细胞进行下一步实验。
1.3.2 H2O2及姜黄素处理姜黄素粉剂使用二甲基亚砜配制为500 mol/L的贮存溶液，120 ℃，20 min高压灭菌，分装后-20 ℃保存。实验时的工作溶液用含体积分数10%FBS的DMEM配置为1 000 μmol/L。
实验分为5组：对照组、H2O2模型组、姜黄素低、中、高剂量组(20，40，80 μmol/L)。细胞传代铺于培养瓶中，细胞贴壁后轻吸去培养液，对照组和模型组使用正常培养液，而低、中、高剂量组分别加入20，40，80 μmol/L的姜黄素培养液培养。48 h后吸去培养液，除对照组外均用 0.1 mmol/L的H2O2进行处理，24 h后收集细胞，并进行相应指标检测。
1.4 主要观察指标
1.4.1 细胞MTT测定软骨细胞以细胞浓度1×107 L-1， 100 μL接种于96孔板中培养24 h。细胞贴壁后轻吸去培养液，按上述方法进行处理后，每组加入50 μL MTT(5 g/L)，37 ℃温育4 h，将培养基吸出，加入200 μL 二甲基亚砜，振荡器上振荡10 min，用酶标仪于570 nm波长测吸光值(A值)。细胞存活率=用药组A值/正常对照组A值×100%。
1.4.2 超氧化物歧化酶、丙二醛、过氧化氢酶测定细胞经处理后，弃去培养液，PBS洗2次，胰蛋白酶消化，4 ℃、1 000 r/min离心，4 ℃超声波细胞粉碎机上破碎细胞，取裂解液4 ℃、1 000 r/min离心10 min后取上清检测。首先应用BCA试剂盒进行定量检测，然后按试剂盒说明书进行超氧化物歧化酶、丙二醛和过氧化氢酶含量测定。
1.4.3 测定Nrf2 mRNA及其蛋白表达水平
Nrf2 mRNA表达检测：采用Real-time PCR法检测软骨细胞Nrf2 mRNA表达，目的基因的上游引物为上游5’-TTC CTC TGC TGC CAT TAG TCA GTC-3’，下游引物为5’-GCT CTT CCA TTT CCG AGT CAC TG-3’，扩增产物大小为215 bp[9]，β-actin作为内参基因。收集培养细胞，抽提总RNA，测定RNA 纯度，并反转录合成cDNA第1链后进行PCR，用AB 7500型荧光定量PCR仪，扩增条件为：94 ℃变性3 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环35次，最后72 ℃延伸10 min。采用2-??CT法计算其表达量相对值。
Nrf2 蛋白表达检测：应用Western blot法分析软骨细胞Nrf2蛋白表达，软骨细胞加入4 ℃裂解缓冲液中，超声裂解细胞，在4 ℃的冰冻环境下14 000 r/min离心5 min。取上清液，BCA法测定蛋白浓度。
蛋白变性后上样，同时上Marker，电泳后进行转膜和封膜。分别采用封闭一抗(兔抗大鼠Nrf2单克隆抗体)和荧光二抗(FITC标记的山羊抗兔IgG抗体)，扫描并且记录各个条带的积分吸光度值(IA)。使用其与内参蛋白IA的比值来反映目标蛋白的表达水平。
1.4.4 Hoechst33258染色观察将各实验组软骨细胞接种于12孔板，按上述方法处理后，吸尽培养液，加入4 ℃ 40 g/L多聚甲醛固定细胞10 min，弃去固定液，加入PBS洗2次，加入300 μL Hoechst33258染色液染色10 min，荧光显微镜下观察、摄片。
1.5 统计学分析计量资料用x(_)±s形式表示，组间比较采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。所有数据采用SPSS 17.0软件进行处理。

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讨论

骨关节炎是一种关节退行性疾病，近年研究提示活性氧造成的氧化应激可能是骨关节炎的发病原因之一^[1]。正常生理状态下，机体内活性氧的产生及清除处于动态平衡。体内清除活性氧的酶系统包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物酶等。当细胞内活性氧生成增加和清除活性氧能力下降，超过机体清除能力，就会出现氧化应激，进而导致细胞氧化损伤甚至凋亡坏死。H2O2是体内氧化代谢的产物，是一种细胞膜高通透性氧化剂，能自由穿过细胞膜并生成-OH等活性更强的自由基，引起细胞损伤。活性氧攻击细胞生物膜上的不饱和脂质，引起脂质过氧化形成丙二醛。因此通过检测丙二醛含量可以反映细胞氧化应激状态下脂质过氧化情况，进一步提示软骨细胞受活性氧破坏的程度^[10-13]。体内过量的活性氧可被超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等内源性抗氧化物酶清除，使机体处于平衡状态，这些抗氧化酶是防止氧化应激损伤的第一道防线，其活力的高低反映机体清除活性氧的能力^[14]。
本实验结果显示：通过向培养的软骨细胞培养液中加入H2O2，造成氧化应激模型，软骨细胞存活率明显下降，同时丙二醛含量升高，表明软骨细胞受到了氧化应激损伤。经姜黄素处理后的软骨细胞丙二醛含量减少，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的活性明显升高，提示姜黄色可能通过清除活性氧，保持软骨细胞膜的完整性，对H2O2损伤的软骨细胞有保护作用。
Nrf2是核转录因子，在细胞抗氧化应激反应中起着重要作用^[2]。生理状态下，Nrf2位于细胞质中与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)处于结合态；在氧化应激条件下，Keap1与Nrf2解离，Nrf2向细胞核转移，与抗氧化反应元件(antioxidant-response element，ARE)相互作用，启动下游抗氧化酶的表达^[15]。
姜黄素是从姜黄属中药姜黄、郁金、莪术、菖蒲等的根茎中提取的一种化学成分，为姜黄属植物主要活性成分之一，具有破血行气、散风活血、通经止痛等多种功效。近年研究发现，姜黄素是外源性Nrf2激动剂^[16]，它可以诱导Nrf2从Nrf2/Keap1复合物中解离，转位入核，并与抗氧化反应元件结合，上调多种抗氧化酶、解毒酶的表达，降低细胞内氧化应激水平^[17]，从而发挥抗炎、抗氧化作用。
通过检测Nrf2mRNA及蛋白表达，以及Nrf2-ARE信号通路的下游产物超氧化物歧化酶、丙二醛、过氧化氢酶的变化，可提示Nrf2-ARE信号通路是否参与了姜黄素干预的软骨细胞保护机制。本研究发现，姜黄素预先处理的软骨细胞Nrf2mRNA及蛋白表达增高，丙二醛含量减少，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性升高，说明Nrf2-ARE信号通路参与了姜黄素可以减轻软骨细胞氧化应激损伤。
细胞凋亡是由基因控制的细胞程序性死亡，通过应用Hoechst33258对细胞核染色发现，经0.1 mmol/L H2O2作用24 h后，模型组出现大量凋亡细胞，表现为细胞核呈现固缩形态，浓染致密，表明H2O2对软骨细胞核有损伤作用。经姜黄素预先处理后，软骨细胞核明显改善，凋亡数明显减少，表明番姜黄素可以抑制软骨细胞凋亡，推测其作用机制可能与其抗氧化性密切相关。
本实验通过胶原酶NB4消化，分离培养并获得大量的软骨细胞。此法培养的细胞生长速度快，研究周期短，满足实验的要求。通过氧化应激模型，进一步观察了姜黄素对软骨细胞氧化应激损伤的保护作用及与Nrf2的关系。
综上所述，姜黄素能减轻软骨细胞氧化应激损伤的机制可能与激活Nrf2核转位，激活Nrf2-ARE信号通路有关，为以Nrf2为靶点治疗和预防骨关节炎提供新的理论基础。

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