原花青素对大负荷运动模型大鼠脾细胞自由基代谢及凋亡蛋白的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.49.027

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究发现，原花青素可以抑制细胞缺氧、复氧损伤过程中的细胞凋亡现象。
目的：观察原花青素对大负荷运动模型大鼠脾细胞自由基代谢及细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Fas、Bax表达的影响。
方法：将48只SD大鼠随机均分为安慰剂组和用药组，给药组灌胃给予原花青素水溶液15 mL/(kg•d)，安慰剂组灌胃给予等量蒸馏水，连续给药2周。给药2周后，两组各均分为3个亚组，运动后即刻及运动后24 h组进行一次坡度为-10°、20 m/min的大负荷跑台运动，分别于运动后即刻、运动后24 h处死大鼠，安静组直接处死大鼠，检测脾细胞Bcl-2、Bax、Fas蛋白的表达，以及脾脏组织匀浆液超氧化物歧化酶、丙二醛水平。
结果与结论：①超氧化物歧化酶活性：两组组内比较，运动后24 h组<运动后即刻组<安静组；给药组运动后即刻、24 h的酶活性高于安慰剂组对应时相。②丙二醛水平：安慰剂组运动后即刻及24 h的水平均高于安静状态，给药组运动后即刻及24 h的含量均低于安静状态，给药组运动后即刻、24 h的丙二醛水平均低于安慰剂组对应时相(P < 0.01)。③Bcl-2：两组均于运动后即刻升高，于运动后24 h下降，并且给药组运动即刻及24 h的表达高于安慰剂组对应时相(P < 0.01)。④Bax：安慰剂组运动后即刻及24 h的表达高于安静状态(P < 0.01)，给药组运动后即刻及24 h的表达低于安静状态(P < 0.01)，并且给药组安静、运动后即刻及24 h的表达高于安慰剂组对应时相(P < 0.05，P < 0.01)。⑤Fas：两组组内比较，安静组<运动后24 h组<运动后即刻组；给药组运动即刻及24 h的表达低于安慰剂组对应时相(P < 0.01)。表明原花青素有助于减轻大负荷运动引起的脾脏脂质过氧化损伤，有效减缓自由基引起的运动性疲劳，有效降低脾细胞凋亡程度。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物模型, 运动医学模型, 大负荷运动模型, 原花青素, 脾细胞凋亡, 脂质过氧化, 自由基

Abstract:

BACKGROUND: Studies have found that proanthocyanidins can inhibit cell apoptosis in cellular hypoxia and reoxygenation injury.
OBJECTIVE: To investigate the effects of proanthocyanidins on free radical metabolism and the expression of apoptosis related proteins Bcl-2, Fas, Bax in rat splenocytes after heavy-load exercise.
METHODS: Forty-eight Sprague-Dawley rats were randomly and evenly divided into placebo group and medication group. Rats in the medication group were intragastrically daily administered 15 mL/kg of proanthocyanidins solution. Rats in the placebo group were intragastrically administered equal amount of distilled water for 2 successive weeks. After 2 weeks of administration, rats in each group were evenly divided into three subgroups: static control group, immediately after exercise group, and 24 hours after exercise group. Rats in the
immediately after exercise and 24 hours after exercise groups were subjected to heavy-load treadmill exercise at a
-10° gradient and at 20 m/min. The rats were sacrificed immediately after exercise and at 24 hours after exercise. Rats in the static control group were directly sacrificed. Bcl-2, Bax, Fas protein expression in splenocytes, and superoxide dismutase activity and malondialdehyde level in homogenate from spleen tissue were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Superoxide dismutase activity was highest in the static control group, followed by the immediately after exercise group and lowest in the 24 hour after exercise group. The superoxide dismutase activity in the immediately after exercise and 24 hours after exercise groups was greater than that in the placebo group at the corresponding time phrases. (2) In the placebo group, malondialdehyde level immediately after exercise and at 24 hours after exercise was higher than that in the static state. In the medication group, malondialdehyde level immediately after exercise and at 24 hours after exercise were lower than that in the static state (P < 0.01). Malondialdehyde level immediately after exercise and at 24 hours after exercise in the medication group was lower than in the placebo group
(P < 0.01). (3) Bcl-2 expression was increased immediately after exercise and decreased at 24 hours after exercise in both placebo and medication groups. Bcl-2 expression immediately after exercise and at 24 hours after exercise in the medication group was higher than in the placebo group (P < 0.01). (4) Bax expression immediately after exercise and at 24 hours after exercise in the placebo group was higher than in the static state (P < 0.01). In the medication group, Bax expression immediately after exercise and at 24 hours after exercise was lower than in the static state (P < 0.01). Bax expression in the static state, immediately after exercise and at 24 hours after exercise in the medication group was higher than in the placebo group (P < 0.05, P < 0.01). (5) Fas expression was lowest in the static control group, followed by 24 hours after exercise group and highest in the immediately after exercise group. Fas expression immediately after exercise and at 24 hours after exercise in the medication group was lower than in the placebo group (P < 0.01). These results demonstrate that proanthocyanidins is helpful to alleviate the heavy-load exercise-induced spleen lipid peroxidation damage, effectively reduce sports fatigue induced by free radicals, and decrease the degree of splenocyte apoptosis.

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中图分类号:

R318

李园，刘文杰，杨宁，闵柱. 原花青素对大负荷运动模型大鼠脾细胞自由基代谢及凋亡蛋白的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(49): 8026-8031.

Li Yuan, Liu Wen-jie, Yang Ning, Min Zhu. Effects of proanthocyanidins on free radical metabolism and apoptosis-related protein expression in rat splenocytes after heavy-load exercise[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(49): 8026-8031.

图/表（结果） 8

2.1 各组脾脏超氧化物歧化酶活性比较安慰剂组中，运动后即刻组超氧化物歧化酶活性较安静组明显降低(P < 0.01)，运动后24 h组较运动后即刻组相比进一步降低，但差异无显著性意义；在给药组中，运动后即刻组超氧化物歧化酶活性较安静组虽有下降，但差异无显著性意义(P > 0.05)，运动后24 h组超氧化物歧化酶活性较运动后即刻组显著下降(P < 0.01)；给药组运动后即刻的超氧化物歧化酶活性显著高于安慰剂组运动后即刻(P < 0.01)，运动后24 h的超氧化物歧化酶活性稍高于安慰剂组运动后24 h，但差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.2 各组脾脏丙二醛水平比较安静状态下，安慰剂组与给药组丙二醛水平比较差异无显著性意义；安慰剂组中，运动后即刻的丙二醛水平较安静状态显著升高(P < 0.01)，而运动后24 h的丙二醛水平较运动后即刻显著降低(P < 0.05)；给药组中，运动后即刻的丙二醛水平较安静状态下降(P < 0.05)，运动后24 h的丙二醛水平较运动后即刻稍升高，但差异无显著性意义；给药运动后即刻、运动后24 h的脾组织丙二醛均明显低于安慰剂组对应时相(P < 0.01)，见表2。2.3 各组大鼠脾细胞Bcl-2的表达变化见图1。

在安慰剂组中，运动即刻后的Bcl-2表达较安静状态显著升高(P < 0.01)，运动后24 h较运动后即刻显著下降(P < 0.01)；给药组中，运动后即刻的Bcl-2表达较安静状态显著升高(P < 0.01)，而运动后24 h的表达较运动后即刻显著下降(P < 0.01)；给药组安静状态、运动后即刻、运动后24 h的Bcl-2表达均明显高于安慰剂组对应时相(P < 0.01)，见表3。

2.4 各组大鼠脾细胞Bax表达的变化见图2。

在安慰剂组中，运动即刻的脾细胞Bax表达较安静状态显著升高(P < 0.01)，运动后24 h的表达较运动后即刻进一步升高(P < 0.01)；给药组中，运动后即刻的Bax表达较安静状态显著降低(P < 0.01)，运动后24 h的表达较运动后即刻进一步降低(P < 0.01)；给药组安静状态、运动后即刻的Bax表达均高于安慰剂组对应时相(P < 0.01或0.05)，运动后24 h的Bax表达明显低于安慰剂组对应时相(P < 0.01)，见表4。

2.5 各组大鼠脾细胞Bcl-2/Bax表达的变化在安慰剂组中，与安静对照组相比，运动后即刻的Bcl-2/Bax表达较安静状态显著降低(P < 0.01)，运动后24 h的Bcl-2/Bax表达进一步降低(P < 0.05)；给药组中，运动后即刻的Bcl-2/Bax表达较安静状态显著增高(P < 0.05)，运动后24 h的Bcl-2/Bax表达与运动后即刻比较无显著变化；给药组安静状态的Bcl-2/Bax表达显著低于安慰剂组对应时相(P <0.01)，运动后即刻及运动后24 h的Bcl-2/Bax表达高于安慰剂组同时相(P < 0.05或0.01)，见表5。

2.6 各组大鼠脾细胞Fas表达的变化见图3。

安慰剂组与给药组安静状态下的Fas表达无差异；在安慰剂组中，运动即刻后Fas表达较安静状态显著升高(P < 0.01)，运动后24 h的表达与运动即刻无差异；给药组中，运动后即刻的Fas表达较安静状态显著升高(P < 0.01)，运动后24 h的表达较运动即刻显著降低(P < 0.05)；给药组运动后即刻、运动后24 h的Fas表达均明显低于安慰剂组对应时相(P < 0.01)，见表6。

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引言

材料方法

1.1 造模动物及材料
实验动物：成年雌性SD大鼠48只，体质量(174.47± 19.15) g，由四川大学华西医学中心实验动物服务站提供，许可证号：SCXK川2013-9；分笼喂养，自由摄食饮水，保证通风条件良好，室温控制在25-28 ℃，相对湿度40%-60%，自然光照。所有动物实验前均未进行过跑台运动。适应性喂养3 d后，采用完全随机化分组方法均分为安慰剂组和给药组两大组，连续给药2周后，两大组按照运动时相又分别随机均分为安静组、运动后即刻组、运动后24 h组。
实验药物：实验原花青素为红棕色粉末，纯度为95%，购自天津市尖峰天然产物研究开发有限公司。
试剂及仪器：超氧化歧化酶检测试剂盒、丙二醛检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；Bcl-2/Bax/FAS蛋白检测试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)；SP500型半自动生化分析仪(法国)；Olympus光学显微镜(日本)；水浴锅、离心机(中国)。
1.2 造模方法
实验动物运动模型：实验周期为14 d，每日早晨起称体质量，根据体质量变化计算给药量，正式实验那天停止给药。将原花青素粉末与蒸馏水配制成10 g/L的原花青素水溶液，以15 mL/(kg•d)对给药组大鼠灌胃给药，对照组灌胃给予等量蒸馏水作为安慰剂。所有大鼠每日早晨起称质量，根据体质量变化计算安慰剂量和给药量，两组连续给药2周。运动实验组大鼠进行3 d的适应性跑台运动(速度为10 m/min，时间为10 min/d，坡度为0°)后休息2 d。正式实验时，运动组大鼠分批进行一次性剧烈跑台运动，速度20 m/min，坡度为-10°，运动过程中使用电刺激或毛刷刺激大鼠尾部。大鼠经驱赶还不能坚持运动时，休息2 min后继续运动，如此反复3次后终止运动。
1.3 主要指标检测安静组直接处死大鼠，运动后即刻组、运动后24 h组分别于运动后即刻、运动后24 h处死大鼠，进行以下指标检测。
黄嘌呤氧化酶法检测脾细胞超氧化物歧化酶活性：取脾脏0.3 g左右制作匀浆，离心后取上清液，按照超氧化物歧化酶试剂盒试使用说明书进行操作，最后用可见光分光光度仪测其样本的吸光度，通过公式计算超氧化物歧化酶活力。
硫代巴比妥酸法检测脾细胞丙二醛水平：取脾脏0.3 g左右制作匀浆，离心后取上清液，按照丙二醛试剂盒试说明书进行操作，最后用可见光分光光度仪测其样本的吸光度，通过公式计算丙二醛水平。
脾细胞Fas蛋白、Bax蛋白及Bcl-2蛋白表达：断颈处死大鼠，取大鼠脾组织0.3 g，采用免疫组化染色(苏木精-伊红染色)方法。免疫组化中棕黄色颗粒和棕黄色面积代表蛋白的阳性表达，每张切片随机选取10个视野(不重复、不重叠)，采用低倍与高倍相结合的办法采用观察与拍照，低倍选准位置，高倍观察形态结构并拍照，用Image-Pro Plus图像分析系统测定每个视野中阳性表达的积分吸光度，以检测蛋白表达。
1.4 统计学分析所有数据均以x(_)±s表示。统计分析使用SPSS 17.0版统计分析软件完成。组间的两两比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，在方差齐性的情况下用LSD法进行后效检验，方差不齐的情况下用Tamhane’s T2方法进行后效检验。

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讨论

3.1 原花青素对运动大鼠脾组织超氧化物歧化酶、丙二醛的影响超氧化物歧化酶是清除超氧自由基内源性金属离子的有效清除剂^[6]。自由基清除剂能与自由基反应而去除自由基；抗氧化剂可以阻止自由基连锁反应的启动和蔓延，终止自由基反应过程。丙二醛是自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸而引发的脂质过氧化反应的重要代谢产物，其大小间接反映氧自由基水平和脂质过氧化程度，可作为细胞被氧自由基攻击的定量指标，间接反映出细胞损伤程度，其含量越高脂质过氧化程度也越高。丙二醛含量异常增高会引起细胞损伤。
由本实验结果可见，安慰剂组运动后即刻的超氧化物歧化酶活性显著低于运动前，运动后24 h继续下降，而丙二醛水平的变化与超氧化物歧化酶相反，为运动后即刻显著高于安静状态，运动后24 h虽有所下降，但仍显著高于安静时。运动后即刻的超氧化歧化酶降低、丙二醛水平升高，可能是因为大强度运动打破了体内自由基代谢的平衡状态，使得脂质过氧化程度增强，加剧了其代谢产物丙二醛的生成，同时也大量消耗了用于清除自由基的超氧化物歧化酶，使得脾组织中此酶显著降低。休息一段时间后，虽然消除了一些自由基及丙二醛，但由于自由基及代谢产物生成太多，超过了机体的分解能力，使超氧化物歧化酶等抗氧化酶类大量消耗，运动后24 h的超氧化物歧化酶活性仍有所降低，但随着自由基被清除，超氧化物歧化酶从运动后即刻到24 h期间下降趋势显著减弱。给药组超氧化物歧化酶活性的变化趋势同安慰剂组相似。给药组丙二醛水平的变化趋势同安慰剂组相反，运动后即刻的丙二醛水平显著降低，24 h后略有升高，但无显著性差异。给药组运动后即刻的超氧化物歧化酶活性显著高于安慰剂组对应时相，运动后24 h略高于安慰剂组对应时相，而且在运动后即刻给药组超氧化物歧化酶活性虽略有所下降，但无显著性差异；丙二醛含量在运动即刻和运动后24 h显著低于安慰剂组对应时相。其可能的机制是：运动中虽然有自由基的大量产生，但原花青素在体内被氧化后释放出H+，竞争性地与自由基及氧化物结合，阻断自由基链式反应，发挥了清除自由基的作用，同时具有保护自由基清除酶的作用，节约了内源性抗氧化酶超氧化物歧化酶，原花青素对大强度运动导致的超氧化物歧化酶活性下降和丙二醛水平升高具有拮抗作用，因此给药组运动后即刻的超氧化物歧化酶活性虽有降低，但下降并不明显，同安慰剂组的显著下降形成明显的对照，而且虽然经过大强度运动，但给药组丙二醛水平在运动后即刻出现显著下降，结果跟曾明^[7]的研究结果一致。之后随着自由基的减少，超氧化物歧化酶活性又逐渐降低，可以推测原花青素可以保护自由基清除酶，更好地清除自由基及代谢产物丙二醛，降低了脂质过氧化程度及细胞膜破坏程度，对减缓人体大强度运动中脾细胞损伤有积极作用，提高了脾组织的抗氧化能力，在一定程度上保护了运动导致的脾细胞脂质过氧化损伤。而自由基的产生是运动性疲劳产生的重要原因，因此原花青素有效减少自由基的作用，可以起到减少自由基引起的运动损伤和运动性疲劳等目的。本研究结果同前人的研究结果基本一致^[8-10] 。
3.2 原花青素对脾细胞Bcl-2、Bax表达的影响 Bcl-2家族均以线粒体作为靶细胞器，根据Bcl-2蛋白家族在细胞凋亡中的作用，分为抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白^[11]。Bcl-2为抑制凋亡蛋白，而Bax为促凋亡蛋白。Bax蛋白会在线粒体膜与Bcl-2形成异源二聚体，抑制Bcl-2的活性，使MPTP不可逆开放，启动和维持细胞凋亡的“线粒体途径”^[12]。另一方面，Bax也独立地参与细胞凋亡的调控，可形成同源二聚体，促进细胞凋亡^[13]。近年研究提示，Bcl-2和Bax调节细胞凋亡不仅取决于自身表达的高低，Bcl-2/Bax异源二聚体的形成是调节细胞凋亡的一个非常重要的环节，通常Bcl-2和Bax的比值决定了细胞凋亡的发生与否^[14]。
由本实验结果可见，安慰剂组脾细胞Bcl-2的表达在运动后即刻显著升高，运动后24 h显著下降，Bax表达在运动后即刻显著增高，24 h后表达进一步增高，运动后即刻及24 h的Bcl-2/Bax比值变化均逐步显著下降。这与之前大多数研究结果一致，造成这样的原因是大负荷运动导致机体内自由基急剧增多，自由基的增多可改变细胞膜能量代谢及造成脂质过氧化损伤，通过一系列的酶促联级反应诱导凋亡蛋白的表达，进而促进细胞凋亡的发生^[15]。本实验脾细胞中Bax表达在运动后24 h升高更加显著，而抑凋亡蛋白Bcl-2显著降低，这可能与大负荷运动后细胞缺血再灌注损伤有关^[16]。
与安慰剂组对应时相相比，给药组大负荷运动后的Bcl-2明显升高，而蛋白Bax在运动即刻高于安慰剂组，24 h后却低于对照组，更值得注意的是，在安静状态下，用药组Bcl-2/Bax比值比安慰剂组低，其结果具有统计学意义。造成这样结果的原因可能与原花青素促进细胞代谢的作用有关。原花青素可加速损伤细胞的凋亡，同时又能抑制正常细胞的凋亡损伤。有研究表明，原花青素可以使佐剂滑膜炎大鼠滑膜Bax表达明显升高，促进Caspase-3相对活性的升高，达到促进滑膜细胞凋亡的目的^[17]。虽然给药组运动后即刻的脾细胞蛋白Bax表达高于安慰剂组，但Bcl-2/Bax比值仍然比安慰剂组高，并且一直持续到24 h后。结果提示原花青素可能激活了凋亡相关蛋白的表达，对原有的损伤细胞进行清除，而对大负荷运动后造成的凋亡损伤具有抑制作用。
3.3 原花青素对脾细胞凋亡相关蛋白Fas表达的影响 Fas基因是主要的促凋亡基因^[18]，其表达的蛋白可与配体Fas-l结合后向细胞内传递死亡信号，最终诱导细胞凋亡^[19]。本实验结果显示，安慰剂组与给药组安静状态时的Fas表达无差异。在安慰剂组中，在运动后即刻的Fas蛋白显著增高，24 h有下降趋势，但还是维持在较高水平，造成这样的原因可能是因为大强度运动导致自由基过多，引起促凋亡基因过多表达，使蛋白Fas表达增多。因细胞损伤还具有延迟性，因此在运动24 h后Fas蛋白表达维持在较高水平，这与之前的研究一致^[20]。而给药组运动后各时相的Fas表达均显著低于安慰剂组，并在运动24 h后显著降低，这可以说明，原花青素能够有效清除自由基，显著降低Fas的表达，有效降低了Fas和FasL结合，抑制凋亡信号的传递，达到抑制脾细胞凋亡的目的。

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