采用组织块移植法快速建立裸鼠原位骨肉瘤模型

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.49.004

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨肉瘤细胞起源于间叶组织这一特点使得骨肉瘤动物模型的构建存在较多困难，进展缓慢的问题。
目的：采用组织块移植法建立裸鼠原位骨肉瘤模型，并观察和评价其生物学特性。
方法：选用SPF 级 6 周龄裸鼠15只，将制备好的MG-63 骨肉瘤细胞悬液注射到裸鼠右前肢腋下，成瘤后连续传 3 代，待肿瘤生长稳定后将瘤块组织移植到裸鼠下肢胫骨髓腔内，评价其生物学特性，采用X射线观察裸鼠成瘤率和成瘤特点。并以正常裸鼠5只做对照。
结果与结论：15只裸鼠造模过程顺利，造模后通过观察1只成瘤失败，成瘤率为93%；造模后观察发现采用组织块移植法三四周可见裸鼠下肢局部肿瘤状组织形成，四五周后X射线观察可见裸鼠胫骨中上段出现不明显的溶骨以及瘤样骨形成；骨肉瘤模型组碱性磷酸酶的表达水平明显高于正常对照组(P < 0.01)。数据表明采用组织块移植法进行裸鼠原位骨肉瘤造模，其造模方法简单，成瘤率高，瘤体生长速度快，对骨皮质及周围软组织的破坏力较强，接近临床骨肉瘤患者的实际情况。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物模型, 骨及关节损伤动物模型, 骨肉瘤, 裸鼠, 移植法, 原位模型

Abstract:

BACKGROUND: Construction of animal models of osteosarcoma is difficult, and the progress is slow because osteosarcoma cells are from mesenchymal tissue.
OBJECTIVE: To establish the nude mouse models of orthotopic osteosarcoma using tissue mass transplantation method, observe and evaluate its biological characteristics.
METHODS: Fifteen nude mice aged 6 weeks of SPF grade were selected. The right forelimb armpit of nude mice was injected with the prepared MG-63 osteosarcoma cell suspension. After tumorgenesis, osteosarcoma cells were sub-cultured for 3 generations. When the tumor grew stably, tumor tissue block was transplanted into lower tibial marrow cavity of nude mice and its biological characteristics were evaluated. Tumor-forming rate and tumor characteristics were observed by X-ray, and 5 normal nude mice were taken as controls.
RESULTS AND CONCLUSION: The modeling process in these 15 nude mice went smoothly. After modeling, only one nude mouse failed in tumor induction and the tumor-forming rate was 93%. Tumor-like tissue formation in the lower extremity of nude mice was visible at 3-4 weeks after tissue mass transplantation. After four or five weeks, X-ray observation showed that unobvious osteolytic bone tumor and tumor-like lesions were present in the upper and middle segments of the tibia of nude mice. The expression level of alkaline phosphatase in the osteosarcoma model group was significantly higher than in the control group (P < 0.01). These results show that tissue mass transplantation for modeling orthotopic osteosarcoma in nude mice is simple to operate and has a high tumor-forming rate. The induced tumors grow quickly and exhibit strong destructive power to cortical bone and surrounding soft tissue, which are close to the actual situation of patients with osteosarcoma in the clinic.

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中图分类号:

R318

周斌. 采用组织块移植法快速建立裸鼠原位骨肉瘤模型[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.49.004.

Zhou Bin. Quick establishment of nude mouse models of orthotopic osteosarcoma using tissue mass transplantation [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.49.004.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析实验选用裸鼠20只，分为2组，实验过程中无脱失，全部进入结果分析。分组流程图见图1。

2.2 动物行为和体征观察通过观察发现正常对照组裸鼠反应灵敏、喜动、动作灵活。模型组的裸鼠造模后第1周内活动量明显减少，精神状态以及觅食量较正常对照组稍差，其余和正常对照组比较没有明显的差别；第2周模型组裸鼠活动量增加，精神状态好转，觅食量也较前增加；第4周开始模型组裸鼠因下肢开始肿胀活动量减少，精神状态不稳定，时而出现烦躁，其他方面无明显异常。
2.3 动物体质量变化模型组和正常对照组裸鼠体质量在前4周通过比较，差异无显著性意义，在第5周时模型组体质量增加明显，与正常对照组比较差异有显著性意义 (P < 0.01)，见表1。

2.4 骨肉瘤大体观察与成瘤率造模完成后，每日对裸鼠生长情况以及采用大体观察和游标卡尺对成瘤情况进行观察。造模后三四周左右裸鼠右下肢可见有肿瘤逐渐形成(图2)，其体积逐渐增大，每日将测得的数据进行详细记录和分析，未发现有自然消退现象。用于造模的15只裸鼠未出现意外死亡，其中有1只未见瘤体生长，其余均造模成功，成瘤率为93%。

2.5 影像学观察结果通过裸鼠X射线片可以看出第1周裸鼠胫骨无明显变化；自第2周开始裸鼠胫骨上端的骨密度有所降低，中上段出现膨大迹象，但周围软组织肿胀不明显；第3、4周裸鼠胫骨处的骨肉瘤增长较为明显，骨密度降低，骨质遭到一定程度的破坏，周围软组织出现肿胀并涉及整个右下肢；第5周X射线可见裸鼠胫骨骨皮质破坏明显，并出现破损断裂，周围软组织进一步肿胀(图3)。

2.6 两组裸鼠血清测定结果的比较于造模后第5周成瘤较为明显时随机在造模组抽取5只裸鼠与正常对照组进行血清测定。数据统计后发现骨肉瘤模型组碱性磷酸酶的表达水平明显高于正常对照组(P < 0.01)，而Ca浓度2组间无统计学差异，骨肉瘤模型组P的水平与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

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引言

研究证明骨肉瘤是起源于间叶组织的骨原发性且恶性程度较高的肿瘤，该疾病好发于儿童和青少年，肺部转移率较高并且术后易复发，常给患者以及社会带来较为巨大的经济压力和负担，至今仍是医疗界希望攻克的难题之一[1-4]^。在研究骨肉瘤的过程中，对其发病机制以及肺转移的形成机制的研究对于提高骨肉瘤的预后具有较大的研究价值。但因为骨肉瘤细胞起源于间叶组织这一特点使得骨肉瘤动物模型的构建存在较多困难，进展缓慢的问题^[5-7]。
近年来，随着国内外诸多学者对原位骨肉瘤动物模型的不断探索以及对骨肉瘤分子生物学特性认识的不断深入，原位移植构建骨肉瘤动物模型构的方法慢慢得到了大家的关注与认可。截至目前，虽然已有众多国内外学者通过不同方法成功建立了多种骨肉瘤动物模型，但是多数均存在一些弊端^[8-12]。因此如何探索一种造模方法使得成瘤速度快、成瘤率高、生物学特性与人接近，且操作简单的骨肉瘤动物模型制作方法，已经成为骨肉瘤研究领域中一个亟待解决的重要问题。
实验采用组织块移植的方法将人肿瘤细胞移植到受体动物的胫骨髓腔内，使其获得与人体肿瘤相似的微环境以及多种促进肿瘤生长的内源性生长因子，不仅可以改变其生长和转移的一些特性，而且还可更好的模拟人原发骨肉瘤浸润的恶性行为和生长特点，不仅可提高移植的成功率，而且所获得的移植瘤的生物学特性更接近人体肿瘤的生物学行为，这些都是皮下移植瘤无法比拟的。

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材料方法

1.1 设计裸鼠原位骨肉瘤模型实验。
1.2 时间和地点于2014年10月至2015年4月在兰州大学基础实验研究室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物采用兰州大学实验动物中心提供的 SPF级4周龄BALB/cA Nu/Nu 裸鼠20只，体质量(20±5) g，雌雄各半，饲养在恒温(26-27 ℃)、恒湿(45%-50%)半屏障系统环境下。
1.3.2 组织块移植法建立裸鼠原位骨肉瘤模型实验主要仪器与试剂 BJI-XN动物X射线光机(恒胜创新公司)；红霉素眼膏；光学显微镜(OLYMPUS)；盐酸氯胺酮注射液(规格为2 mL/0.1 g，江苏恒瑞医药股份有限公司)；碘伏等。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组 20只BALB/cA Nu/Nu 裸鼠，随机被分为原位骨肉瘤模型组(模型组)15只和正常对照组5只。在动物适应性喂养5 d后开始造模。
1.4.2 造模方法
MG-63细胞悬液制备：在进行造模之前首先制备对数生长期MG-63细胞，利用锥虫蓝染色进行MG-63细胞计数，活细胞数量≥ 90%以上，用PBS冲洗，细胞计数法制备成细胞浓度为1×1012 L-1的骨肉瘤细胞悬液备用。
成瘤组织块移植：将前面制备好的骨肉瘤细胞悬液以0.2-0.25 mL/只的注射量注射于裸鼠右前肢腋下部位，两三周待瘤体长至1 cm×1 cm×1.5 cm时取出处于生长期的骨肉瘤组织，用眼科剪将其剪成体积大小约为0.2 cm×0.2 cm× 0.2 cm的块状埋植于裸鼠臀部皮下。使其连续传3代，待肿瘤生长稳定后取出，无菌条件下剪成0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm大小的块状备用。用医用碘伏将裸鼠右后肢常规消毒，于膝关节前内侧切开一长0.2-0.4 cm的切口，暴露膝关节，采用1 mL一次性无菌注射器针头沿胫骨平台前缘向胫骨远端(髓腔)方向插入钻孔，当出现落空感时表示钻孔成功(也可将针头暂时留在胫骨内通过小动物成像系统判断钻入的方向和深度是否合适)，随后抽吸少量的骨髓液以减小髓腔压力，将制备好的碎块置入胫骨髓腔内，将针拔出，骨蜡密封骨创口，缝合皮肤，局部用红霉素眼膏涂抹预防感染，最后放入笼中饲养观察。
1.4.3 动物行为和体征观察在造模后于每天早晨喂食前观察并记录2组裸鼠的精神状态、活动、便、觅食等情况，5 d记录1次。
1.4.4 动物体质量前后变化在造模后于第1，3，5周各称量1次，连续对裸鼠的体质量进行观察和记录，其中正常对照组5只全部称量，模型组随机抽取5只进行称量，每次称取时间均在上午9：30(即喂食前)。
1.4.5 瘤体生长观察造模后前期进行定时大体观察，并借助游标卡尺定时测量局部尺寸的变化。
1.4.6 小动物X射线观察借助小动物成像技术每5 d对造模后裸鼠行X射线检查，观察胫骨造模处瘤体生长情况、形态变化、骨质的破坏程度、周围软组织的受累情况等。
1.4.7 血清测定通过定时观察待裸鼠成瘤明显后随机处死裸鼠4只，采集裸鼠的股动脉血进行碱性磷酸酶、钙(Ca)、磷(P)检测。
1.4.8 骨肉瘤成瘤率计算成瘤率=(成瘤只数/本组动物总数)×100%。
1.5 主要观察指标 ①动物行为和体征观察。②动物体质量变化。③骨肉瘤大体观察与成瘤率。④影像学观察结果。⑤两组裸鼠血清测定结果的比较。
1.6 统计学分析实验数据采用统计软件SPSS16.0对数据进行分析，计量资料数据以x(_)±s表示，两组比较采用t 检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

近年来研究发现骨肉瘤在骨源性肿瘤中较为常见，也是最常见的原发性骨肿瘤之一^[13-15]。该疾病恶性程度高、易复发、预后差，患者往往出现较高的致残率与病死率^[16-19]。在研究如何攻克骨肉瘤的研究过程中，通过建立与人接近的原位骨肉瘤动物模型，研究不同时期骨肉瘤在动物体内生长变化的规律及特点，以及在此基础上开展的相关发病机制、有效药物疗效、药物的药理毒理等实验已经成为骨肉瘤研究领域的重要方向^[20-22]。
随着对骨肉瘤研究的开展，国内外学者通过不同方法和途径成功建立了多种骨肉瘤动物模型，但多数因为存在这样活着那样的问题而逐渐被弃用^[23-26]。因此，如何建立一种操作简单、经济、成瘤速度快、成瘤率高而且瘤体生物学特性与人较为接近的模型成为学者研究的焦点^[27-31]。
3.1 造模方法的创新性及注意要点本研究选用SPF级 4周龄裸鼠15只，将制备好的MG-63骨肉瘤细胞悬液注射到裸鼠右前肢腋下，成瘤后连续传3代，待肿瘤生长稳定后将瘤块组织移植到裸鼠下肢胫骨髓腔内，随后观察评价其生物学特性，并采用影像学手段观察该方法的成瘤率和成瘤特点。15只裸鼠造模过程顺利，造模后通过观察1只成瘤失败，成瘤率为93%；造模后观察发现采用组织块移植法三四周可见裸鼠下肢局部肿瘤状组织形成，四五周后借助小动物影像学技术观察可见裸鼠胫骨中上段出现不明显的溶骨以及瘤样骨形成；光镜下观察可见典型的骨肉瘤病理组织学特征。采用组织块移植法进行裸鼠原位骨肉瘤造模，其造模方法简单、成瘤率高、瘤体生长速度快、对骨皮质及周围软组织的破坏力较强。
在采用该方法造模期间应注意以下几点：①原位骨肉瘤移植部位的选择：一般选取裸鼠胫骨，因为骨骺端疏松，相对容积较大，且髓腔内血供及营养丰富，肿瘤在移植容易生长。②移植瘤块的数量：作者通过反复实验得出移植块数量≤10块时成瘤率较低，约为10%，而移植瘤块数量≥20块时造模成功率为90%以上，在剪切瘤块时尽量用眼科剪，剪后的瘤块大小要均匀。③钻孔与密封：在暴露裸鼠膝关节后先用1 mL注射器针头缓慢用力插入胫骨，待有落空感时缓慢吸出少量的骨髓液以减轻髓腔内的压力，然后植入事先备好的瘤块，最后采用骨蜡封闭针孔，防止组织块溢出。
3.2 模型更接近人类或临床实践裸鼠胫骨原位移植模型的恶性生物学行为更接近临床骨肉瘤患者的实际情况。而且采用该方法建立的裸鼠原位骨肉瘤动物模型，操作简单、成瘤快、模型成功率高、所需费用低、重复率高，可在原位骨肉瘤基础实验研究中较大范围的应用。

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