脱细胞基质材料体外激活巨噬细胞的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.47.026

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (47): 7687-7692.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.47.026

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脱细胞基质材料体外激活巨噬细胞的作用

徐斌^1，2，黄秀艳¹，韦晓慧²，曾耀英¹

1暨南大学生命科学技术学院免疫生物学系，广东省广州市 510632；2广东冠昊生物科技股份有限公司，再生型医用植入器械国家工程实验室，广东省广州市 510530

收稿日期:2015-09-24 出版日期:2015-11-19 发布日期:2015-11-19
通讯作者: 曾耀英，教授，研究员，暨南大学生命科学技术学院免疫生物学系，广东省广州市 510632
作者简介:徐斌，男，1970年生，广西省防城港市人，汉族，暨南大学在读博士，主要从事生物材料及人工器官研究工作。
基金资助:
广东省重大科技专项再生医学材料共性关键技术研究(2010A080407005)

In vitro activation of macrophages by decellularized extracellular matrix materials

Xu Bin^{1, 2}, Huang Xiu-yan¹, Wei Xiao-hui², Zeng Yao-ying¹

1Department of Immune Biology, College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; 2Grandhope Biotech Co., Ltd., National Engineering Laboratory for Regenerative Implantable Medical Devices, Guangzhou 510530, Guangdong Province, China

Received:2015-09-24 Online:2015-11-19 Published:2015-11-19
Contact: Zeng Yao-ying, Professor, Researcher, Department of Immune Biology, College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China
About author:Xu Bin, Studying for doctorate, Department of Immune Biology, College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; Grandhope Biotech Co., Ltd., National Engineering Laboratory for Regenerative Implantable Medical Devices, Guangzhou 510530, Guangdong Province, China
Supported by:
a grant of Regenerative Medicine Materials Common Key Technology Research of Major Science and Technology Projects of Guangdong Province, China, No. 2010A080407005

摘要/Abstract

摘要：

背景：因巨噬细胞在机体炎症反应中有着举足轻重的作用，所以检测生物材料对巨噬细胞行为的影响，可评估材料的免疫原性。
目的：分析脱细胞基质材料对巨噬细胞的激活作用。
方法：获取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞，分5组培养：对照组为单纯细胞培养组；实验1组为脱细胞基质膜材料与巨噬细胞直接接触培养，实验2组为新鲜心包膜材料与巨噬细胞直接接触培养，实验3组为脱细胞基质膜材料与巨噬细胞间接接触培养，实验4组为新鲜心包膜材料与巨噬细胞间接接触培养。培养48 h后，MTT法检测各组A值，判定毒性分级；培养24 h后，检测细胞培养上清中一氧化氮及细胞因子的分泌。
结果与结论：实验1-4组毒性分别为2级、4级、0级及2级。实验1组、实验2组一氧化氮水平高于对照组(P < 0.05)，并且实验2组高于实验1组(P < 0.05)。5组间白细胞介素2、白细胞介素4、干扰素γ、白细胞介素17A和白细胞介素10水平比较差异无显著性意义；实验2组白细胞介素6水平高于对照组(P < 0.05)；实验1组、实验2组、实验4组肿瘤坏死因子水平高于对照组(P < 0.05)，并且实验2组高于实验1组(P < 0.05)、实验1组高于实验4组(P < 0.05)。说明脱细胞基质材料可在直接接触时激活巨噬细胞。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 细胞外基质, 免疫原性, 巨噬细胞, 细胞因子, 炎症

Abstract:

BACKGROUND: Because macrophages play an important role in the body’s inflammatory response, the detection of the impact of biological materials on the behavior of macrophages can assess the immunogenicity of materials.

OBJECTIVE: To analyze the activation effect of decellularized extracellular matrix materials on macrophages.

METHODS: The peritoneal macrophages of BALB/c mouse were obtained and cultured by dividing into five groups. Control group was simple cell culture group, experimental group 1 was acellular matrix membrane material directly contacting with macrophage for culture, experimental group 2 was fresh pericardial material directly contacting with the macrophage for culture, experimental group 3 was acellular matrix membrane material indirectly contacting with macrophages for culture, experimental group 4 was fresh pericardium material indirectly contacting with macrophages for culture. After 24 hours of culture, the secretion of nitric oxide and cytokines in cell culture supernatant was determined. After 48 hours of culture, the absorbance value was determined by MTT method and the toxicity grading was determined.

RESULTS AND CONCLUSION: The toxicity grading in experimental groups 1-4 was respectively grades 2, 4, 0, 2. The nitric oxide level in experimental groups 1 and 2 was higher than that in the control group (P < 0.05), and the nitric oxide level in the experimental group 2 was higher than that in the experimental group 1 (P < 0.05). There were no significant differences in interleukin-2, interleukin-4, interferon γ, interleukin-17A and interleukin-10 levels between these five groups. The interleukin-6 level in the experimental group 2 was higher than that in the control group (P < 0.05); The expression levels of tumor necrosis factors in experimental group 1, 2 and 4 were higher than those in the control group (P < 0.05), and experimental group 2 higher than the experimental group 1 (P < 0.05), experimental group 1 higher than the experimental group 4 (P < 0.05). These results show that acellular matrix material can activate macrophages in direct contact.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Extracellular Matrix, Inflammation, Macrophages, Tissue Engineering

徐斌，黄秀艳，韦晓慧，曾耀英. 脱细胞基质材料体外激活巨噬细胞的作用[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(47): 7687-7692.

Xu Bin, Huang Xiu-yan, Wei Xiao-hui, Zeng Yao-ying. In vitro activation of macrophages by decellularized extracellular matrix materials[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(47): 7687-7692.

图/表（结果） 3

2.1 脱细胞基质材料对巨噬细胞的毒性实验1组对细胞均有一定的毒性，而实验3组对细胞无明显毒性，说明脱细胞基质材料对巨噬细胞的毒性是由材料表面的附着物造成的，而且这些物质不会释放到培养液中，因为实验3组未显示出明显的毒性；然而，实验2组和实验4组对巨噬细胞均有一定的毒性，说明新鲜心包膜材料的毒性物质可以释放到培养液中，见表1。

2.2 脱细胞基质材料与腹腔巨噬细胞共培养后的一氧化氮分泌对照组、实验1组、实验2组、实验3组与实验4组的一氧化氮浓度分别为(1.90±0.03)，(8.74±0.47)，(34.38± 0.89)，(1.24±0.23)，(3.11±0.11)μmol/L，见图1。

与对照组比较，实验1组、实验2组、实验4组会刺激巨

噬细胞产生一氧化氮(P < 0.01)，而实验3组不会刺激巨噬细胞产生一氧化氮(P > 0.05)；与实验2组比较，实验1组、实验4组刺激巨噬细胞产生的一氧化氮明显减少(P < 0.01)；材料直接接触组分泌的一氧化氮水平高于相应的材料间接接触组(P < 0.01)，说明材料表面的附着物不易溶于培养基中。

2.3 脱细胞基质材料对腹腔巨噬细胞分泌细胞因子的影响见图2。

白细胞介素2、白细胞介素4、干扰素γ、白细胞介素17A和白细胞介素10：从图2可以看出，两种材料对巨噬细胞分泌白细胞介素2、白细胞介素4、干扰素γ、白细胞介素17A和白细胞介素10无显著影响。

白细胞介素6：对照组、实验1组、实验2组、实验3组与实验4组的白细胞介素6质量浓度分别为(1.98±1.15)，(1.91±1.23)，(44.56±2.52)，(1.49±1.34)，(1.85±1.08) ng/L。与对照组比较，实验1组、实验3组、实验4组未刺激巨噬细胞产生白细胞介素6(P > 0.05)，而实验2组会刺激巨噬细胞产生大量的白细胞介素6(P < 0.01)；与实验2组比较，实验1组分泌的白细胞介素6质量浓度显著减少(P < 0.01)。

肿瘤坏死因子α：对照组、实验1组、实验2组、实验3组与实验4组肿瘤坏死因子α质量浓度分别为(8.23±32.23)，(150.77±25.35)，(889.26±34.43)，(7.96±18.75)，(90.24± 25.98) ng/L。与对照组比较，实验1组、实验2组、实验4组会刺激巨噬细胞产生肿瘤坏死因子α(P < 0.01)，而实验3组不会刺激巨噬细胞产生肿瘤坏死因子α(P > 0.05)；实验1组肿瘤坏死因子α质量浓度高于实验3组(P < 0.01)，实验2组肿瘤坏死因子α质量浓度高于实验4组(P < 0.01)；实验1组肿瘤坏死因子α质量浓度低于实验2组(P < 0.01)，却高于实验4组(P < 0.01)。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2010年3月至2015年5月在暨南大学生命科学技术学院免疫生物学系实验室设计与完成。

1.3 材料

实验动物：8-10周龄清洁级BALB/c小鼠，雌雄不拘，体质量(25±3) g，购自广东省动物医学实验中心，许可证号：SCXK(粤)：2008-0002。

1.4 方法

新鲜膜材料的制备：取牛心包膜材料，经⁶⁰Co照射灭菌。将新鲜膜材料剪成均匀大小，以便放于24孔培养板或Transwell上层小室。

脱细胞基质材料体外激活巨噬细胞实验用材料、试剂与仪器：
材料、试剂与仪器	来源
脱细胞基质膜材料	广东冠昊生物科技股份有限公司，经过专利技术US patent，#6106555特殊处理
DMEM/LOW培养基、PBS、胎牛血清、β-二巯基乙醇、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素、HEPES、非必需氨基酸、丙酮酸钠	美国GIBCO公司
脂多糖、离心机(3-16K)	美国Sigma公司
CBA Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit、0.5/1.0/15/50 mL离心管、流式管12 mm× 75 mm、8.0 μm cell culture inserts	美国BD-Pharmingen公司
Griess Reagent Kit	美国Promega公司
流式细胞仪FACS Canto Ⅱ	美国Becton Dickinson公司
超净工作台SW-CJ-IF型	新加坡ESCO 公司
倒置显微镜	中国重庆光学仪器厂
酶标仪	美国BioTek公司
CO₂细胞培养箱	美国Thermo公司
细胞培养板96/24/6孔	美国Corning公司

脱细胞基质膜材料的制备：在传统工艺的基础上添加了磷酸二酯酶。将脱细胞基质材料剪成均匀大小，以便放于24孔培养板或Transwell上层小室。

小鼠腹腔巨噬细胞的获取：眼球放血处死BALB/c小鼠，以体积分数75%乙醇中浸泡1 min消毒，乙醇棉球擦拭皮肤，沿腹中线剪开皮肤并向身体两侧撕扯至露出腹膜，用无菌眼科镊轻轻提起暴露的腹膜，用无菌注射器吸取3 mL DMEM/LOW无血清基础培养基，轻轻地注射到小鼠腹腔内，轻柔5 min，用无菌眼科剪在腹膜右侧剪开一小口，小心吸取腹腔细胞，收集到15 mL 离心管中，冷PBS洗1次(4 ℃、1 500 r/min离心5 min)，DMEM/LOW无血清基础培养基重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹。将上述细胞悬液接种于24孔培养板中，每孔1 mL，于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中孵育过夜。24 h 后，轻轻吸取丢掉含有未贴壁细胞的上清，并用DMEM/LOW无血清基础培养基轻轻洗涤3次，剩下的贴壁细胞即为巨噬细胞，用巨噬细胞标记物F4/80抗体染色鉴定纯度，此种方法得到的巨噬细胞纯度(F4/80⁺细胞比例)>90%，可用于以下实验。

小鼠腹腔巨噬细胞的培养：以DMEM/LOW无血清基础培养基重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1，接种于24孔板，24 h 后轻轻吸取丢掉含有未贴壁细胞的上清，并用DMEM/LOW无血清基础培养基轻轻洗涤3次，将Transwell小室放入24孔平底细胞培养板，在Transwell小室与24孔平底细胞培养板每孔中分别加入1 mL新鲜的DMEM/LOW完全培养基，分组培养：对照组下室中不加入任何物质，实验1组在24孔平底细胞培养板中加入脱细胞基质材料，实验2组在24孔平底细胞培养板中加入新鲜心包膜材料，实验3组在Transwell小室中加入脱细胞基质材料，实验4组在Transwell小室中加入新鲜心包膜材料。每组3个复孔，放置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养。

1.5 主要观察指标

MTT检测细胞增殖：培养48 h后移除Transwell小室，向培养板孔中加入200 μL 5 g/L的MTT溶液，在培养箱中继续避光培养4 h，300 ×g离心5 min，吸掉上清，加入100 μL DMSO，室温避光振荡10 min，以充分溶解孔内的紫色结晶，在酶标仪用490 nm波长处检测各孔的吸光度(A₄₉₀值)，并计算细胞相对增殖率，评估细胞毒性。细胞相对增殖率(%)=实验组A₄₉₀值/对照组A₄₉₀值×100%。当细胞相对增殖率≥100%时，毒性为0级；在80%-99%之间，为1级；在50%-79%之间，为2级；在30%-49%之间，为3级；在0-29%之间，为4级。实验结果0或1级反应为合格；为2级反应的，应结合细胞形态分析，综合评价；3至4级反应为不合格。

Griess法检测巨噬细胞培养上清中一氧化氮的分泌：培养24 h 后，收集细胞培养上清，用于一氧化氮的检测。先把Griess试剂盒平衡至室温15-30 min，并按照该试剂盒的说明书稀释不同浓度的标准品，即各浓度梯度的标准品为(0，1.56，3.13，6.25，12.5，25，50，100 μmol/L)，并取各浓度的标准品50 μL和培养上清50 μL分别加入到96孔平底酶标板中，再加入50 μL Griess试剂A，室温避光反应8-10 min，然后加入50 μL Griess 试剂B，室温避光反应8-10 min，混匀，在30 min内用酶标仪在540 nm波长处检测各孔的吸光度(A₅₄₀)，用标准品的浓度与对应的A_{540 nm}数值绘制标准曲线，计算其直线回归方程式为：Y= 0.003 3 X+0.077 7，R²=0.999 4，其中Y为NO浓度(μmol/L)，X为对应的A_{540 nm}数值。将不同样本的A_{540 nm}吸光度(X值)代入回归方程即可得出待测培养上清中一氧化氮浓度。

流式CBA法检测巨噬细胞培养上清中细胞因子的分泌：培养24 h后，收集细胞培养上清，用于细胞因子的检测。用BD Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Th1/Th2/ Th17 Cytokine Kit，通过流式细胞仪检测白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素6、干扰素γ、肿瘤坏死因子、白细胞介素17A和白细胞介素10，具体操作过程如下：将试剂盒放置于室温平衡30 min左右；标准品配制，按照说明书用适量的Assay Diluent溶解标准品的冻干粉，制备成 5 000 ng/L的起始质量浓度，用Assay Diluent系列稀释标准品，最终得到 5 000，2 500，1 250，625，312.5，156，80，40，20， 0 ng/L的标准品；混合Capture Beads，10 μL/test，即标准品数加上样本数乘以10 μL，就是吸取每种细胞因子的体积数，混匀，然后吸取50 μL的Capture Bead到标记好的流式管中；在相应的流式管中加50 μL的标准品或待测培养上清；向各流式管中加入50 μL的PE Detection Reagent；均匀，室温，避光孵育2 h；用1 mL Wash Buffer (100 ×g离心5 min)洗涤一次；用300 μL Wash Buffer重悬后，待测。取50 μL Setup Beads于流式管中，再加入450 μL Wash Buffer，校正仪器参数；流式细胞仪(BD FACSCanto Ⅱ)获取数据；用FCAP Array v 1.0软件获得标准曲线和计算样本浓度。

1.6 统计学分析获得的结果用x(_)±s表示，n为样本量。统计作图软件用GraphPad Prism 5。统计方法用one-way t检验，P < 0.05时为差异有显著性意义。

讨论

巨噬细胞作为重要的炎症反应介导细胞^[20-28]，它的激活会分泌大量炎症因子，包括一氧化氮和细胞因子，这些炎症因子会通过自分泌作用于巨噬细胞自身或作用于其他细胞(包括免疫细胞，血管内皮细胞，上皮细胞等)，多细胞共同参与放大炎症级联反应。此外，巨噬细胞作为重要的专业抗原提呈细胞，它的激活会上调很多协同刺激分子，辅助T细胞识别抗原。因此，拟系统性评价脱细胞基质材料的免疫原性，首先应检测脱细胞基质材料对巨噬细胞的刺激作用。

本实验采用贴壁法获得高纯度的小鼠腹腔巨噬细胞，研究在Transwell小室环境条件下脱细胞基质材料直接或是间接共培养时对巨噬细胞功能的影响及其差异。Transwell膜为聚碳脂膜，膜上有孔，孔径为8 μm，这样使得整片脱细胞基质材料不与培养板板底的巨噬细胞直接接触，又能让生物大分子自由通过膜的微孔。实验中将脱细胞基质材料置于上室，腹腔巨噬细胞接种于下室，上下两室的培养液都能通过聚碳脂膜相互交换，从而可以观察在非接触状态下脱细胞基质材料对巨噬细胞的影响。另外，本实验也选用了脱细胞基质材料置于下室，与下室中已经贴壁好的巨噬细胞直接接触共培养，这就更能反映脱细胞基质材料作用于巨噬细胞后，脱细胞基质材料对巨噬细胞分泌一氧化氮和细胞因子的影响的程度，评估了脱细胞基质材料的细胞毒性，较国标里采用浸提液方式进行细胞毒性实验进行了更深层次的分析。

本实验结果显示，新鲜心包膜材料与巨噬细胞直接接触可显示出明显的细胞毒，而脱细胞基质材料的细胞毒性明显小于新鲜心包膜材料；通过对比材料直接接触和间接接触的毒性大小差异，发现材料直接接触产生的毒性明显高于间接接触，说明材料表面附着的毒性物质不易溶于培养液。另外，尽管新鲜心包膜材料可以在一定程度上引发巨噬细胞死亡，但还是能够很显著的刺激巨噬细胞分泌一氧化氮、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α，其中一氧化氮是巨噬细胞合成用来杀灭入侵微生物的活性分子，但有研究表明一氧化氮可以引起炎症灶的其他细胞凋亡；而白细胞介素6和肿瘤坏死因子α作为重要的炎症细胞因子，不仅仅参与损伤和感染，而且还具有调制修复、代谢、再生和造血等生物活性。因此仅凭体外实验，无法确认脱细胞基质材料引起这些物质的释放是有利还是有害，如果这种应答是可控或者自限性的，可能不会造成严重后果甚至可能是有益的，原因是组织修复过程是一个低度的自限性炎症过程。

另外，由于脱细胞基质材料是不可溶的物质，当巨噬细胞贴壁好之后再与脱细胞基质材料共培养时，在一定时间内培养液是否可以充分透过膜材料而给细胞提供足够的营养，脱细胞基质材料与细胞直接接触共培养时的激活作用部分原因是否是由于材料对细胞的物理因素引起的呢？还需进一步研究以明确一氧化氮和细胞因子的作用机制和影响时间，下一步的研究计划是将脱细胞基质材料植入实验动物体内，对模型动物的免疫状态进行长期的观察与评估，为最终的临床应用打下基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

脱细胞基质材料体外激活巨噬细胞的作用

In vitro activation of macrophages by decellularized extracellular matrix materials

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