不同生物标记物预测关节置换后假体周围感染与无菌性松动的效能分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.44.009

摘要/Abstract

摘要：

背景：假体周围感染是关节置换后一种难以处理的并发症，早期诊断是治疗的关键，寻找到一种反应快速的、高敏感度和特异度的分子生物学标志物可显著优化假体周围感染的诊断过程。
目的：监测血降钙素原、白细胞介素6和脂多糖结合蛋白水平，并与血白细胞计数和C-反应蛋白水平比较，明确上述指标鉴别关节置换后感染的敏感度和特异度。
方法：招募2008年1月至2013年12月因关节置换后疼痛就诊于济宁医学院附属医院的患者81例。所有的感染患者修复手术分为两期，一期彻底清创，安装临时占位器，平均3个月后进行二期重建。术前1 d采集静脉血，检测降钙素原、白细胞介素6、脂多糖结合蛋白、白细胞计数和C-反应蛋白水平，术中采集滑膜及假体周围假包膜的样本，行细菌及组织形态学检查。应用受试者工作特征曲线计算敏感度和特异度。
结果与结论：单因素方差分析结果显示，脂多糖结合蛋白的受试者工作特征曲线最大，为0.962，95%置信区间0.924-1.000，诊断价值最佳，此时的临界值为23.5 μg/L，表明术前患者血脂多糖结合蛋白超过23.5 μg/L时，诊断为假体周围感染的可能最大；其次是C-反应蛋白，其受试者工作特征曲线为0.871；而白细胞的受试者工作特征曲线接近0.5，术前根据白细胞计数诊断假体周围感染的价值不大。提示检测脂多糖结合蛋白对于关节置换后假体周围感染的诊断具有良好的应用前景，它对假体周围感染的阳性预测率和阴性预测率均很高。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

关键词: 骨科植入物, 人工假体, 感染, 关节置换, 脂多糖结合蛋白, 假体周围感染, 无菌性松动, 山东省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Periprosthetic joint infection is a complication that is difficult to deal with after joint arthroplasty. Early diagnosis is the key to treatment. To find a fast response, high-sensitivity and high-specificity molecular biomarker can significantly optimize the diagnosis process of periprosthetic joint infection.
OBJECTIVE: To monitor blood procalcitonin, interleukin-6 and lipopolysaccharide binding protein levels, to compare with blood leukocyte count and C-reactive protein levels, to identify above indexes, and to distinguish sensitivity and specificity of periprosthetic joint infection.
METHODS: A total of 81 patients with pain after arthroplasty who were treated in Affiliated Hospital of Jining Medical College from January 2008 to December 2013 were enrolled in this study. The repair surgery of all patients was divided into two stages. In the first stage, complete debridement and the installation of temporary occupancy device were conducted. After 3 months averagely, two-phase reconstruction was performed. At 1 day before surgery, venous blood was collected. Calcitonin, interleukin 6, lipopolysaccharide binding protein, leukocyte count and C- reactive protein levels were detected. During the operation, synovial membrane and sample of false envelope around the prosthesis were collected. Bacterial and histological examinations were performed. The sensitivity and specificity were calculated using receiver operating characteristic curve.
RESULTS AND CONCLUSION: One-way analysis of variance results showed that the receiver operating characteristic curve of lipopolysaccharide binding protein was bigger, 0.962; 95 confidence interval 0.924-1.000. Diagnostic value was optimal, and the critical value was 23.5 μg/L. These data suggested that when lipopolysaccharide binding protein exceeded 23.5 μg/L before surgery, periprosthetic joint infection would be identified. The receiver operating characteristic curve of C-reactive protein was 0.871. The receiver operating characteristic curve of leukocytes was close to 0.5. The diagnostic value of leukocyte count on periprosthetic joint infection was not great. These findings indicate that lipopolysaccharide binding protein has good application prospect in the diagnosis of periprosthetic joint infection after joint replacement, and shows high positive predictive rate and negative predictive rate of periprosthetic joint infection.

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Key words: Arthroplasty, Replacement, Prosthesis Implantation, Infection, C-Reactive Protein, Tissue Engineering

张玉革，王国栋，张元民，赵晓伟，牛帅帅. 不同生物标记物预测关节置换后假体周围感染与无菌性松动的效能分析[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(44): 7097-7102.

Zhang Yu-ge, Wang Guo-dong, Zhang Yuan-min, Zhao Xiao-wei, Niu Shuai-shuai . Different biomarkers predict periprosthetic joint infection and aseptic loosening after joint arthroplasty[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(44): 7097-7102.

图/表（结果） 4

2.1 参与者数量分析按意向性处理，81例关节置换后疼痛患者根据前述标准分为3组，假体周围感染组21例，无菌性松动组41例，对照组19例。全部进入结果分析，无脱落。2.2 基线资料比较尽管各组的样本数并不一致，但是其年龄(P=0.474)、性别(P=0.654)、侧别(P=0.894)、体质量指数(P=0.616)等人口统计学指标差异并无显著性意义。假体周围感染组和无菌性松动组髋关节置换后患者相对更多，而对照组膝关节置换后患者更少，但分布差异各组之间差异同样无显著性意义(P=0.074)，见表1。

2.3 各组间不同指标的化验结果分析 AVONA结果显示，各组间术前白细胞计数之间差异无显著性意义(F=0.027，P=0.974)；各组间术前C-反应蛋白水平之间差异有显著性意义(F=28.271，P=0.000)，Dunnett T 3检验两两比较显示，假体周围感染组和无菌性松动组(P=0.001)及对照组(P=0.000)之间差异均有显著性意义，无菌性松动组和对照组之间的差异无显著性意义(P=0.088)；各组间术前的脂多糖结合蛋白水平之间差异有显著性意义(F=44.806，P=0.000)，Dunnett T 3检验两两比较显示，假体周围感染组和无菌性松动组(P=0.000)及对照组(P=0.000)之间差异均有显著性意义，无菌性松动组和对照组之间的差异无显著性意义(P=0.843)；各组间术前的白细胞介素6计数之间差异有显著性意义(F=7.061，P=0.002)，Dunnett T 3检验两两比较显示，假体周围感染组和无菌性松动组(P=0.021)及对照组(P=0.014)之间差异均有显著性意义，无菌性松动组和对照组之间的差异无显著性意义(P=0.937)；各组间术前的降钙素原水平之间差异有显著性意义(F=12.786，P=0.000)，Dunnett T 3检验两两比较显示，假体周围感染组和无菌性松动组(P=0.003)及对照组(P=0.000)之间差异均有显著性意义，无菌性松动组和对照组之间的差异无显著性意义(P=0.423)，见图1及表2。

2.4 生物标记物预测能力分析根据前述诊断标准，结合术中取材组织的细菌学和形态学检查，术后诊断为假体周围感染的患者与非假体周围感染患者的ROC曲线见图2。脂多糖结合蛋白的AUC最大，为0.962，95%置信区间0.924-1.000，敏感性和特异性均较高，诊断价值最佳，此时的临界值(cut off)为23.5 μg/L，表明术前患者血脂多糖结合蛋白超过 23.5 μg/L时，诊断为假体周围感染的可能最大；其次是C-反应蛋白，其AUC为0.871；而白细胞计数的AUC接近0.5，术前根据白细胞计数诊断假体周围感染的价值不大。2.5 不良事件 3例患者的3髋在清创术中发生股骨干穿孔，2例患者的2髋术后发生假体脱位(1例为无菌性松动患者，1例为假体周围感染患者)，经手法复位、下肢牵引后治愈，随访期间未再发生脱位。

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引言

假体周围感染是关节置换后一种难以处理的并发症。每一例出现疼痛的关节置换病例都应被怀疑可能是由于感染所导致的，需要进一步检查直至排除这种可能性[1]。假体周围感染的诊断、治疗目前仍存在争议，手术干预前就明确假体周围感染的诊断有时非常困难；但是早期明确关节置换后疼痛是否因假体周围感染引起是极其重要的，对这些病例的处理方案应包括通过标准的实验室筛查来检测是否存在感染。很多研究聚焦于发现更新的和精确的诊断假体周围感染的分子标志物[2-3]，然而，目前仍然缺乏金标准。
目前，临床中比较常用的是检测血液中白细胞和C-反应蛋白的水平[4]。但是，上述指标敏感性高，但特异度低，有时会受到其他因素的干扰，如年龄、性别、慢性炎症疾病、代谢综合征、吸烟或术后血肿[5-6]，可能会导致假阳性或者假阴性，如在慢性假体周围感染中，血液白细胞水平一般维持在正常水平。因此，寻找到一种快速反应的、高敏感度和特异度的分子生物学标志物可明显优化假体周围感染的诊断过程。有研究表面，白细胞介素6是一种诊断髋关节置换后感染的敏感标志物，通常在术后6 h内升高达到峰值，并能在术后72 h内下降至正常，较C-反应蛋白反应迅速[6]。
降钙素原是降钙素的前体蛋白质，是由116个氨基酸构成的，降钙素原在体内不会受到多种因素的影响和制约，不易降解，可经有效的检测设备准确检出，降钙素原在正常人体内降钙素原的含量是非常低的，降钙素原对细菌感染性疾病具有良好的特异性，在细菌性炎症疾病感染、多种器官功能失调综合征、脓毒症中，降钙素原会发生选择性升高，具有高度的选择性。脂多糖结合蛋白是存在于正常人和动物血清中的一种糖蛋白，人血清中脂多糖结合蛋白的正常浓度为5-10 mg/L，急性反应期可升高到 200 mg/L，脂多糖结合蛋白可刺激单核细胞、内皮细胞等，促进肿瘤坏死因子α等炎性递质的释放。以上研究表明，脂多糖结合蛋白有可能成为诊断关节置换后疼痛的又一工具。课题检测血降钙素原、白细胞介素6和脂多糖结合蛋白水平，并与血白细胞计数和C-反应蛋白水平比较，明确上述指标诊断关节置换后假体周围感染的敏感度和特异度。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

材料方法

1.1 设计对比观察试验。

1.2 时间及地点于2008年1月至2013年12月在济宁医学院附属医院骨关节科完成。

1.3 材料膝关节置换所用假体为NexGen高屈曲度膝关节置换系统，生产企业：美国 Zimmer Inc. 捷迈公司，产品性能结构及组成：该系统为组合式膝关节系统。其部件包括：股骨部件(CR、C-Flex、LPS、LPS-Flex)、关节面(标准型、NSM型、Prolong型)、胫骨平台(超高分子聚乙烯型)。其中股骨部件材料采用铸造钴铬钼合金，部分C-Flex型号内表面有纯钛丝盘绕，关节面、胫骨平台材料采用超高分子量聚乙烯。

髋关节置换假体选择为美国DePuy Orthopaedics， Inc.，髋臼杯为Pinnacle臼杯，主要包括髋臼杯试模、聚乙烯试模内衬、负荷垫片试模、负荷头试模，打压及通用工具等等；Corail柄表面为全羟基磷灰石涂层；根据患者要求选择不同的摩擦界面，包括陶瓷-陶瓷、陶瓷-聚乙烯及金属-聚乙烯。

1.4 对象招募因关节置换后疼痛就诊的患者81例。

纳入标准：全髋关节置换或者全膝关节置换后疼痛，需要行翻修术的患者。患者知情同意。

排除标准：除该部位(髋或者膝)感染之外，存在身体其他部位的炎症反应；或者是可能影响到炎症因子表达的其他生理或者病理状态，如过度肥胖(体质量指数> 30 kg/m²)、长期大量吸烟及自身免疫系统疾病等。

假体周围感染的诊断标准^[7-8]：开放的伤口或窦道与关节相通；全身感染合并关节疼痛，且关节液呈脓性；5项辅助检查结果中至少符合以下中的3项：①血沉> 30 mm/h。②C-反应蛋白>10 mg/L。③关节穿刺液细菌培养至少1次阳性。④术中冰冻结果>5个多核白细胞/高倍视野。⑤术中培养>1/3的培养结果阳性。符合假体周围感染诊断标准的为假体周围感染组；不符合上述标准的诊断为无菌性松动，纳入无菌性松动组；同期没有感染或松动表现的患者纳入对照组。

1.5 方法

关节置换方法：膝关节置换患者取仰卧位，采用腰硬联合麻醉或气管插管全身麻醉，上止血带。采用膝前正中切口髌旁内侧入路，切除炎症明显的滑膜，按要求对股骨和胫骨进行截骨，并评估软组织平衡，作相应软组织松解，试模满意后用骨水泥固定假体，不行髌骨置换，假体采用Zimmer NexGen后稳定性假体，不保留后交叉韧带。

髋关节置换采用前外侧入路，T形切开关节囊后显露髋关节，保留股骨矩1.5 cm左右进行股骨颈截骨，取出股骨头。先行处理髋臼部分，保持髋臼外展角45°，前倾10°左右进行髋臼磨挫，当去除髋臼软骨露出软骨下骨后安装髋臼假体部件，并再次确认髋臼外展角45°，前倾角10°左右。如果选用自带防脱位设计的内衬时，一般将防脱位的部分置于髋臼后外侧缘11点位置。股骨部分的处理：屈曲内收外旋髋关节暴露股骨近端。此时清理梨状窝处的软组织，使用方形开髓挫从梨状窝处朝向股骨矩方向进行扩髓，然后顺序使用髓腔挫进行髓腔成型。然后置入股骨柄假体。

感染修复方法：所有的感染患者手术分为两期，一期彻底清创。显露关节后分别取培养标本和组织病理标本，然后取出假体，清除骨水泥、坏死组织、感染肉芽组织和所有异物，用双氧水和新洁尔灭浸泡冲洗后用大量生理盐水冲洗，清创彻底后重新铺单并换手套，安装临时占位器。平均3个月后进行二期重建。间隔期间如有感染持续存在，可以重复清创。

术中采集滑膜及假体周围假包膜的样本，行细菌及组织形态学检查。标本取自术中的特定部位：髋关节取自股骨颈周围的滑膜，膝关节取自髌旁内侧的滑膜，样本分为两部分，一部分行细菌学检查，一部分行组织学检查^[9]。为提高细菌学检出的阳性率，抗生素治疗在取材之后才开始；已在外院应用抗生素患者，术前停药2-4周，病情严重或者急症，停药4 d。

1.6 主要观察指标术前1 d采集静脉血，分析脂多糖结合蛋白、降钙素原、白细胞介素6、白细胞计数和C-反应蛋白水平。脂多糖结合蛋白测定采用相应试剂盒(Immulite 1000，Siemens Healthcare，Eschborn，Germany)；降钙素原和白细胞介素6检测采用相应试剂盒(Elecsys BRAHMS降钙素原及白细胞介素6试剂盒；Roche Diagnostics，Mannheim, Germany)。

1.7 统计学分析统计学软件采用SPSS 13.0。脂多糖结合蛋白、降钙素原、白细胞介素6、白细胞计数和C-反应蛋白水平的各组间比较采用单因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)及LSD检验(方差齐)或者Dunnett T 3检验(方差不齐)。受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)的曲线下面积(area under the curve，AUC)越大，诊断准确性越高。ROC曲线将灵敏度与特异性以图示方法结合在一起，可准确反映某分析方法特异性和敏感性的关系，是试验准确性的综合代表。在ROC曲线上，最靠近坐标图左上方的点为敏感性和特异性均较高的临界值。

讨论

假体周围感染是人工关节置换后的一种严重并发症，即使最终得到有效处理，其治疗期限也通常较长，同时患者也会经历长时期的关节功能丧失并且难以继续参与日常工作，使得总体治疗结果较差。造成疗效较差的主要原因在于往往难以对假体周围感染早期作出准确的诊断，并由此给予正确的处理。大部分情况下，患者的症状仅仅为疼痛不适，而很少合并高热、寒战等炎症表现^[10-16]。当前用于诊断假体周围感染的方案综合了血清学检验(血沉、C-反应蛋白)、组织学检查、病变关节外观、术中取材培养、术前关节抽吸液检查(包括细菌培养)结果、白细胞计数、以及白细胞分类等。但是，没有一种指标是100%可靠的，都存在一定的假阳性及假阴性率^[17-23]。对假体周围感染的延误诊断会导致感染状态持续存在，并可能导致假体的最终失败；而假阳性会导致患者接受了不必要的二次手术。无论哪一种，后果都是极其严重的。近年来，许多学者致力于更加精确和可靠的检验指标的研究^{[1-2，24-31]}。血沉及C-反应蛋白都是反映感染的敏感指标，但由于在任何一种炎症性病变存在时它们都会有明显升高，因此它们在诊断假体周围感染时特异性很低^[1]，血浆C-反应蛋白浓度为16.5 mg/L才有诊断意义^[15]，这与本研究的研究结果相类似，本研究中C-反应蛋白的临界值为17 mg/L，此时诊断的灵敏度为85.7%，特异度为65%。另外还有关节穿刺抽吸标本，但该方法的问题是可能会出现假阳性或假阴性结果，术后早期即使关节抽吸液检测异常也很难判定是否存在感染，因为术后早期正常情况下也会有炎症标志物水平的升高^[32]。Parvizi等^[33]的研究发现，白细胞酯酶与血沉、C-反应蛋白、滑膜白细胞计数以及滑膜中性粒细胞比例之间有很好的相关性。在白细胞酯酶提供较高敏感性和特异性的基础上，使用其他一些细胞学标志物可能会更进一步地提高诊断的准确性。这些标志物包括白细胞介素6、降钙素原、白细胞介素8、C-反应蛋白、α-2巨球蛋白以及血管内皮生长因子等。

本课题研究设计评价脂多糖结合蛋白、白细胞介素6及降钙素原在关节置换后疼痛患者中的诊断价值，并与目前临床中最常用的研究指标白细胞计数和血沉相比，证实其在鉴别假体周围感染和无菌性松动的诊断效果。脂多糖结合蛋白属于Ⅰ型急性期反应蛋白，是一种糖蛋白，正常人的血浆浓度为5-10 mg/L，而急性炎症反应时则明显升高。脂多糖结合蛋白可与革兰阴性细菌细胞膜上的脂多糖的类脂A高亲和力结合，在内毒素血症早期识别极少量脂多糖的存在，向宿主发出警告，形成脂多糖结合蛋白/脂多糖复合物。促进脂多糖与髓源性细胞胞膜表面的膜性CD14(mCD14)结合，形成脂多糖-脂多糖结合蛋白-mCD14复合物，通过TLR4-MD2-MyD88通路识别复合物经核因子κB向胞内传递信号，从而介导分泌前炎症因子基因的激活，引起前炎症因子如肿瘤坏死因子α等释放，触发全身炎症反应。研究发现假体周围感染和无菌性松动组间血清脂多糖结合蛋白浓度差异有显著性意义(P=0.000)，这与前人的研究相类似，脂多糖结合蛋白的临界值为23.5 μg/L，此时敏感度81.0%，特异度98.3%，比C-反应蛋白灵敏度稍低；白细胞介素6的临界值为133 ng/L，此时敏感度为57.1%，特异度为78.3%；但有研究发现脂多糖结合蛋白在鉴别假体周围感染和无菌性松动上，并不比C-反应蛋白或白细胞介素6准确。其原因考虑可能与本组细菌培养大部分为阴性杆菌感染有关，也可能与脂多糖结合蛋白具有浓度依赖性的双重作用(低浓度脂多糖结合蛋白促进脂多糖诱导激活单核/巨噬细胞，而高浓度脂多糖结合蛋白将抑制脂多糖诱导的细胞反应)在不同的炎症反应时项显示不同的作用有关，但目前样本量较少，还无法明确具体的原因，这也是本课题的下一步研究方向。

降钙素原是无激素活性的降钙素前肽物质，在脓毒症和感染的患者血浆中被发现明显升高，其升高程度反映脓毒症和感染的严重程度及预后。既往研究降钙素原对关节置换后感染诊断的敏感性为95%，特异性为100%，特异性明显优于C-反应蛋白^[3]；但该组患者降钙素原临界值为0.75 μg/L，诊断敏感度为61.9%，特异度为90%，敏感度相对较低。降钙素原在全身细菌感染后4 h即可检测到，维持时间久，稳定性好，不受体内激素水平的影响。降钙素原在健康人血清中水平极低，在细菌感染引起全身反应时显著增高，且其增高程度与感染的严重程度呈正相关。既往研究表明，降钙素原在敏感性与C-反应蛋白相差不大的情况下，特异性却显著高于C-反应蛋白，这与本研究结果类似，但其敏感度和特异度仍不如脂多糖结合蛋白。其原因的探讨也是本课题的研究方向。

检测脂多糖结合蛋白对于关节置换后假体周围感染的诊断具有良好的应用前景，它对假体周围感染的阳性预测率和阴性预测率均很高。由于该检测方法具有简单、方便、结果可靠的特点，有利于关节外科医生在门诊诊室以及手术室中随时进行相应操作，从而能根据相应结果及时决定进一步的处理措施。如果更进一步的研究能确定其临床应用价值，无疑将极大地方便对关节置换后假体周围感染的诊断和处理。
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