三种温控脱细胞载体的制备与性能评估

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.43.022

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (43): 7004-7009.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.43.022

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三种温控脱细胞载体的制备与性能评估

安帅星¹，于美丽²，郭宏玥²，李澶²，李杨²

1天津医科大学研究生院，天津市 300070；2天津市第三中心医院人工细胞重点实验室，天津市 300170

收稿日期:2015-09-11 出版日期:2015-10-15 发布日期:2015-10-15
通讯作者: 于美丽，天津市第三中心医院人工细胞重点实验室，天津市 300170
作者简介:安帅星，男，1985年生，天津医科大学在读硕士，主要从事生物医学工程，高分子材料研究。
基金资助:
天津市卫生行业重点攻关项目(13KG110，14KG109)；天津市科委基金；天津市科技计划项目(11JCYBJC27700)

Preparation and performance of three kinds of thermoresponsive acellular carriers

An Shuai-xing¹, Yu Mei-li², Guo Hong-yue², Li Tan², Li Yang²

1Graduate School of Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; 2Key Laboratory of Artificial Cells, Tianjin Third Central Hospital, Tianjin 300170, China

Received:2015-09-11 Online:2015-10-15 Published:2015-10-15
Contact: Yu Mei-li, Key Laboratory of Artificial Cells, Tianjin Third Central Hospital, Tianjin 300170, China
About author:An Shuai-xing, Studying for master’s degree, Graduate School of Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
Supported by:
the Key Research Project of Tianjin Health Industry, China, No. 13KG110, 14KG109; a Project Funded by Tianjin Science and Technology, China; the Science and Technology Program of Tianjin, China, No. 11JCYBJC27700

摘要/Abstract

摘要：

背景：设计、制备新型温敏高分子三维细胞支架是目前高分子科学研究的热点之一。
目的：制备3种不同的温控脱细胞载体，并评估其性能。
方法：分别制备共聚异丙基丙烯酰胺温控脱细胞支架、大孔共聚异丙基丙烯酰胺温控脱细胞支架与大孔共聚异丙基丙烯酰胺交联醛基化海藻酸钠温控脱细胞支架，检测3组支架的比表面积、温敏性能、孔隙率、孔径及细胞相容性。
结果与结论：共聚异丙基丙烯酰胺温控脱细胞支架、大孔共聚异丙基丙烯酰胺温控脱细胞支架与大孔共聚异丙基丙烯酰胺交联醛基化海藻酸钠温控脱细胞支架的比表面积分别为135，386，421 m2/g，最低临界溶解温度分别为30，28.5，29.5 ℃，细胞毒性反应分别为2级、2级、1级，说明3种支架均具备温度敏感特性，而且最低临界溶解温度相近；大孔共聚异丙基丙烯酰胺交联醛基化海藻酸钠温控脱细胞支架的细胞相容性明显优于另两种支架。大孔共聚异丙基丙烯酰胺温控脱细胞支架、大孔共聚异丙基丙烯酰胺交联醛基化海藻酸钠温控脱细胞支架的孔隙率与孔径大于共聚异丙基丙烯酰胺温控脱细胞支架(P < 0.05)，说明大孔共聚异丙基丙烯酰胺温控脱细胞支架与大孔共聚异丙基丙烯酰胺交联醛基化海藻酸钠温控脱细胞支架具有更加明显的孔洞结构。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 三维细胞支架, 温控载体制备, 孔隙率和孔径, 温度敏感性, 生物相容性

Abstract:

BACKGROUND: To design and fabricate a novel three-dimensional thermoresponsive polymer cell scaffold is one of the hot topics in the research of polymer science.
OBJECTIVE: To prepare three different kinds of thermoresponsive acellular carriers and to evaluate their performance.
METHODS: The copolymer N-isopropylacrylamide temperature acellular scaffold, macroporous copolymer N-isopropylacrylamide temperature acellular scaffold and macroporous copolymer N-isopropylacrylamide crosslinking aldehyde sodium alginate thermoresponsive acellular scaffold were prepared. The specific surface area, thermoresponsive performance, porosity, pore size and biocompatibility of these three groups of scaffolds were determined.
RESULTS AND CONCLUSION: The specific surface area of copolymer N-isopropylacrylamide
thermoresponsive acellular scaffold, macroporous copolymer N-isopropylacrylamide thermoresponsive acellular scaffold and macroporous copolymer N-isopropylacrylamide crosslinking aldehyde sodium alginate thermoresponsive cellular scaffold was respectively 135, 386, 421 m2/g. The lower critical solution temperature was 30, 28.5, 29.5 ℃. The cell toxicity reaction was respectively grade 2, 2, 1. These indicators showed that the three kinds of scaffolds were provided with a temperature-sensitive characteristics and similar lower critical solution temperature. The biocompatibility of macroporous copolymer N-isopropylacrylamide crosslinking aldehyde sodium alginate thermoresponsive acellular scaffold was significantly better than the other two scaffolds. The porosity and pore size of macroporous copolymer N-isopropylacrylamide thermoresponsive acellular scaffold and macroporous copolymer N-isopropylacrylamide crosslinking aldehyde sodium alginate thermoresponsive acellular scaffold were greater than those of the copolymer N-isopropylacrylamide thermoresponsive acellular scaffold (P < 0.05). These results demonstrate that macroporous copolymer N-isopropylacrylamide thermoresponsive acellular scaffold and macroporous copolymer N-isopropylacrylamide crosslinking aldehyde sodium alginate thermoresponsive acellular scaffold have more obvious pore structure.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Tissue Scaffolds, Histocompatibility Testing, Liver, Artificial, Tissue Engineering

安帅星，于美丽，郭宏玥，李澶，李杨. 三种温控脱细胞载体的制备与性能评估[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(43): 7004-7009.

An Shuai-xing, Yu Mei-li, Guo Hong-yue, Li Tan, Li Yang. Preparation and performance of three kinds of thermoresponsive acellular carriers[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(43): 7004-7009.

图/表（结果） 3

2.1 三种支架比表面积分析由于PNIPAM温控脱细胞支架没有加入任何致孔剂，其比表面积只有135 m²/g；由于大孔PNIPAM温控脱细胞支架内部以海藻酸钠为致孔剂形成多孔结构，使其比表面积显著增加，达到386 m²/g；由于大孔PNIPAM交联醛基化海藻酸钠温控脱细胞支架内部不但以海藻酸钠为致孔剂，而且交联醛基化海藻酸钠形成互穿式网状结构，使其比表面积达到421 m²/g，可以印证大孔PNIPAM温控脱细胞支架和大孔PNIPAM交联醛基化海藻酸钠温控脱细胞支架比PNIPAM温控脱细胞支架具有更加明显的孔洞结构。

2.2 三种支架的温敏性能检测在28-31 ℃温度区间内，3种支架的透光率Tansmittance急剧下降；PNIPAM、大孔PNIPAM、大孔PNIPAM交联醛基化海藻酸钠温控脱细胞支架的最低临界溶解温度分别为30，28.5，29.5 ℃，说明3种温控脱细胞支架具备温度敏感特性，而且最低临界溶解温度相近。饱和而丧失形状甚至解体，同时也足以满足细胞营养的获得和代谢物质的传输。

2.3 三种支架的孔隙率和孔径测定结果 PNIPAM、大孔PNIPAM、大孔PNIPAM交联醛基化海藻酸钠温控脱细胞支架的孔隙率分别为(71.80±2.40)%、(89.75±2.50)%、(88.91±2.30)%，孔径分别为(130.23±42.30)，(181.26± 50.40)，(193.35±47.20) μm；大孔PNIPAM、大孔PNIPAM交联醛基化海藻酸钠温控脱细胞支架的孔隙率、孔径均高于PNIPAM温控脱细胞支架(P < 0.05)。

2.4 三种支架红外光谱比较结果图1a为大孔PNIPAM温控脱细胞支架红外光谱(由于PNIPAM与大孔PNIPAM温控脱细胞支架材料相同，仅孔径不同，所以两者红外光谱基本相同)，在3 506.13 cm^-¹和3 429.00 cm^-¹处为-NH₂上N-H的伸缩振动峰，3 303.57 cm^-¹处为-NH上N-H的伸缩振动峰， 3 077.27 cm^-¹处为次强酰胺带的倍频伸缩振动峰，在 2 974.47，2 927.56，2 876.64 cm^-¹处为甲基、亚甲基及次甲基上C-H伸缩振动峰，在1 743.00，1 652.63 cm^-¹处分别为脂基和酰胺基上羰基的伸缩振动峰，可知大孔PNIPAM的侧链主要由-CH(CH₃)₂、-CONHNH₂和-COCH₃基团构成；图1b为大孔PNIPAM交联醛基化海藻酸钠温控脱细胞支架红外光谱，与大孔PNIPAM温控脱细胞支架红外谱图比较，其在3 506.13，3 429.00 cm^-¹处的峰消失，表明-NHNH₂基团参与了反应，大孔PNIPAM温控脱细胞支架上的-NHNH₂和醛基化海藻酸钠上的-CHO反应生成C=N键。

2.5 三种支架扫描电镜观察图2A所示为PNIPAM温控脱细胞支架扫描电镜表面形貌，其表面起伏不平类似云团或低矮峰峦；图2B为大孔PNIPAM温控脱细胞支架扫描电镜表面形貌，可以清楚地观察到多孔结构，孔洞密集且分布均匀，相互贯穿相连，这是由于加入致孔剂海藻酸钠导致温敏凝胶产生了多孔结构；图2C为大孔PNIPAM交联醛基化海藻酸钠温控脱细胞支架扫描电镜表面形貌，可清楚地观察到互穿网状的多孔结构，孔洞密集且分布均匀，相互贯穿相连，这是由于将温敏凝胶交联醛基化海藻酸钠并加入致孔剂海藻酸钠，导致温敏凝胶产生互穿网状多孔结构。

2.6 三种支架的生物相容性评价结果阴性对照组细胞相对增殖率为99.1%，细胞毒性反应为1级；阳性对照组细胞相对增殖率为4.0%，细胞毒性反应为4级，实验系统反应成立。PNIPAM温控脱细胞支架浸提液组细胞相对增殖率为77.4%，细胞毒性反应为2级；大孔PNIPAM温控脱细胞支架浸提液组细胞相对增殖率为78.1%，细胞毒性反应为2级；大孔PNIPAM交联醛基化海藻酸钠温控脱细胞支架浸提液组细胞相对增殖率为90.3%，细胞毒性反应为1级，见表1。

通过细胞毒性实验证实，大孔PNIPAM交联醛基化海藻酸钠温控脱细胞支架由于交联了醛基化海藻酸钠降低了细胞毒性，生物相容性明显优于另两种温控脱细胞支架。

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引言

生物人工肝是一种体外机械/化学/生物性装置，可暂时部分替代肝脏功能，从而协助治疗肝功能不全、肝衰竭或相关肝脏疾病，其最基本和最重要的作用是解毒功能[1-2]。生物人工肝系统的核心是生物反应器，其主要成分是细胞支架材料及在支架上人工培养的肝细胞。生物人工肝研究的重点是尽量使肝细胞在培养环境许可下表达全部范围的肝功能，包括蛋白合成、生物酶活性等，而肝细胞作为生物人工肝的主要生物成分，在该系统中起着核心作用[3-5]。
生物人工肝另一核心组成就是三维细胞支架[6-7]。支架在生物人工肝中同样扮演重要作用。它模拟细胞外基质的许多功能，提供细胞生长的基本环境，并且控制细胞的分化[8-11]。因此生物人工肝的成功设计必须要有适当支架材料的配合。为了细胞的正常生长和繁殖，支架材料应具有的特性包括：良好的生物相容性，三维多孔结构，适宜的力学性能，良好的细胞亲和性，细胞可无损伤脱附等[12-15]。文献中已有很多报道使用温度敏感高分子作为实时形成的凝胶支架。设计、制备新型温敏高分子三维细胞支架是目前高分子科学研究的热点之一[16-19]。
共聚异丙基丙烯酰胺(Poly(N-isopropylacrylamide)，PNIPAM)是典型的温敏高分子。利用其温敏性，已有多种PNIPAM实时形成支架材料的报道[20-26]。基于PNIPAM的温敏性凝胶具有很好的生物相容性，非常适合作为支架材料[27-30]。本实验利用PNIPAM温敏特性，凝胶制备了3种温控细胞支架，并进行生物性能(细胞毒性、多孔结构等)比较。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞支架制备筛选和性能评价。

1.2 时间及地点于2014年6月至2015年6月在天津市第三中心医院，天津市人工细胞重点实验室完成。

1.3 材料 N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸甲酯(Aldrich公司)；过硫酸铵(天津化学试剂公司)；高G单元海藻酸钠、海藻酸钠(相对分子质量7 000-20 000)、高碘酸钠、N-四甲基乙二胺(Sigma公司)；N，N-亚甲基双丙烯酰胺(美国ACROSORGANICS公司)；小鼠成纤维细胞L-929(中国食品药品检定研究院)；MEM培养液(GIBCO，批号：862839)；二甲基亚砜(天津市瑞金特化学品有限公司)；胰酶(SCIENTIFIC RESEARCH SPECIAL，批号：27250018)；四唑盐MTT(SCIENTIFIC RESEARCH SPECIAL)；酶标仪(芬兰雷勃公司，MK3)；美国扫描电镜(Phenom，FEI Company)。

1.4 方法

1.4.1 PNIPAM温控脱细胞支架的制备

原理：由于PNIPAM分子内存在亲水基团(酰胺基)和疏水基团(异丙基)，其低临界溶解温度为32 ℃，当温度低于最低临界溶解温度时，PNIPAM分子链呈伸展状态，亲水基团暴露，表现亲水性，与水发生水合作用而溶于水，其水溶液呈透明状；当温度高于最低临界溶解温度时，PNIPAM分子链收缩，疏水基团暴露，表现疏水性，从水溶液中沉析，其水溶液不透明，

利用PNIPAM这一温敏特性，制备具有温敏性脱细胞性能的三维细胞培养支架，在37 ℃细胞培养温度，使所培养的细胞在温敏性细胞支架中吸附、增殖，形成细胞族，再将细胞培养支架移至低温环境(低于最低临界溶解温度)，利用PNIPAM的亲疏水性变化，细胞从支架材料中自动脱附，避免了酶解法对细胞功能造成的损伤，获得一定数量的细胞。

方法：将丙烯酸甲脂经减压蒸馏除去阻聚剂，交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺和促进剂N-四甲基乙二胺分别用甲醇重结晶。将100 mg N-异丙基丙烯酰胺单体在试管中以100 mL三蒸水溶解，加入亲水性的丙烯酰胺25 mg，再加入2.5 mg的交联剂N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、4.5 µL促进剂N-四甲基乙二胺，置于18 ℃恒温水浴锅。稍后加入2.0 mg引发剂过硫酸铵，并且通氮气将试管中空气置换完全，放入50 ℃恒温水浴中避光密封反应24 h。合成反应完成后，取出。室温下放入双蒸水中浸泡四五天，每6-8 h换水1次，以便清除未反应的单体、交联剂及其他杂质，冷冻干燥后制成PNIPAM温控脱细胞支架。

1.4.2 大孔PNIPAM温控脱细胞支架的制备由于海藻酸钠是一种无毒、生物相容性良好的多糖类天然高分子材料，也是一种电荷密度较高的线形聚电解质，在NaCl溶液中，海藻酸钠分子链间的排斥作用减弱，分子链发生卷曲，为此实验选择海藻酸钠为致孔剂，在NaCl溶液中制备出种大孔PNIPAM温控脱细胞支架。

将100 mg N-异丙基丙烯酰胺单体在100 mL三蒸水中溶解，加入亲水性的丙烯酰胺25 mg。再加入2.5 mg的交联剂N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、4.5 µL促进剂N-四甲基乙二胺，加入4%海藻酸钠10 mL，加入10%NaCl溶液5 mL，置于18 ℃恒温水浴锅。稍后加入2.0 mg引发剂过硫酸铵，并且通氮气将试管中空气置换完全，放入50 ℃恒温水浴中避光密封反应24 h。合成反应完成后，取出。室温下放入双蒸水中浸泡四五天，每6-8 h换水1次，以便清除未反应的单体、交联剂、致孔剂及其他杂质，冷冻干燥后制成大孔PNIPAM温控脱细胞支架。

1.4.3 大孔PNIPAM交联醛基化海藻酸钠温控脱细胞支架的制备首先制备大孔PNIPAM温控脱细胞支架，将其与醛基化海藻酸钠进行交联反应，利用共聚异丙基丙烯酰胺的- NHNH₂与醛基化海藻酸钠的-CHO，在巯基硼氢化钠催化作用下，发生Schiff碱反应，形成共价键：将10 mL醛基化海藻酸钠(2 mg/L)、55.0 mg NaCl、25.0 mg NaBH₃CN溶于pH= 7.4的100 mL PBS中，反应温度为40 ℃，使大孔PNIPAM温控脱细胞支架与醛基化海藻酸钠进行交联反应5 h，反应完成后取出。室温下放入双蒸水中浸泡1 d，每三四小时换水1次，以便清除巯基硼氢化钠及其他杂质，冷冻干燥后制成大孔PNIPAM交联醛基化海藻酸钠温控脱细胞支架。

1.5 主要观察指标

3种支架比表面积测定：比表面积是每克物质中所有颗粒总外表面之和。比表面积是衡量物质表面特性的重要参数，其大小与颗粒粒径、形状、表面缺陷及孔结构密切相关；同时，比表面积大小对物质其他的许多物理及化学性能会产生很大影响。将液氮淬冷后并经冷冻干燥的温控脱细胞支架，应用N₂吸附法做比表面积分析，采用美国 Micromeritics公司ASAP2020M型全自动比表面积及微孔分析仪进行比表面积多孔结构分析。

3种支架温敏性能检测：配制质量分数为1%的支架溶液，倒入到比色皿中。分光光度计样品池的透光孔用载波片密封，将装有蒸馏水(参比溶液)和支架溶液的比色皿置入样品池中，注满蒸馏水，放入水浴锅中，从1-43 ℃每半小时升温1 ℃。在每一温度下，将样品池取出，迅速擦干水，放入分光光度计中，在450 nm处测溶液的透光率Tansmittance，记录在每一温度下溶液的透光率，作Tansmittance-T曲线图。定义当大分子水溶液出现透光率急剧变化的温度为其最低临界溶解温度。

3种支架孔隙率测定：利用排乙醇法测量支架孔隙率。首先称量充满乙醇的比重瓶质量m₁和干燥样品质量m_s，然后称量放入支架后充满无水乙醇的比重瓶质量m₂，最后称量取出支架后的比重瓶质量m₃。

支架的孔隙率ε= (m₂-m₃-m_s)/ (m₁-m₃)

3种支架孔径测定：分别选取3种支架扫描电镜照片，每种选6张，随机取20个孔测量并计算支架平均孔径。

3种支架红外光谱比较：将完全干燥的支架与溴化钾充分碾磨，压片后在NICOLET 6700 Thermo红外光谱仪测定其红外光谱图。

3种支架扫描电镜观察：将支架在20 ℃下达到吸水平衡，经滤纸分别吸干表面，用刀片将支架切成厚度约 1.5 mm小薄片。经液氮淬冷，24 h冷冻干燥，用扫描电镜在15 kV加速电压下观察其形貌。

3种支架的生物相容性评价：采用四唑盐(MTT)比色法对3种支架浸提液进行生物相容性评价。该项试验的目的是将支架样品浸提液与细胞在体外进行接触培养，通过对细胞形态、增殖和抑制影响的观察，评价实验样品的体外细胞毒性作用。

浸提液的制备：经0.22 µm滤器过滤含体积分数10%胎牛血清的MEM培养液(浸提介质)。在无菌操作下，称取支架样品2.0 g，加浸提介质10 mL，于37 ℃浸提24 h后得到之间浸提原液，浸提比例为0.2 g/mL。

细胞悬液制备：将正常传代培养的L-929细胞经0.25%胰酶消化，制成浓度为1×10⁷ L^-¹的细胞悬液，接种于96孔板，分6组培养，实验组(3种支架浸提液组)、空白对照组、阴性对照组、阳性对照组，每孔200 µL，每组6孔，置体积分数5%CO₂培养箱内37 ℃培养24 h。

浸提液交换：细胞培养24 h后，弃去原培养液，空白对照组用浸提介质交换，阴性对照组用浸提比例为 6 cm²/mL的高密度聚乙烯浸提液交换，阳性对照组用含5%二甲基亚砜的浸提介质交换，实验组分别用3种支架浸提液进行交换。置体积分数5%CO₂培养箱内37 ℃培养72 h。

吸光度的测定：取培养72 h的孔板，每孔加入40 µL 5 g/L四唑盐(MTT)溶液继续培养4 h后，弃去孔内液体，加入150 µL二甲基亚砜，置振荡器上振荡10 min，在酶标仪 570 nm和630 nm处测定各孔吸光度。按下式计算细胞相对增殖率(RGR)。A为样品组(实验组、阴性对照、阳性对照组)吸光度，A₀为空白对照组吸光度。细胞毒性反应分级：当细胞相对增殖率≥100%时，为0级；当细胞相对增殖率在80%-99%之间时，为1级；当细胞相对增殖率在50%-79%之间时，为2级；当细胞相对增殖率在30%-49%之间时，为3级；当细胞相对增殖率在0-29%之间时，为4级。根据细胞毒性反应分级标准判定，阴性对照组的反应应≤1级，阳性对照组至少为3级。

1.6 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行分析，定量资料用x(_)±s表示，用方差分析进行多组间比较，两两比较利用SNK-q检验，统计学差异检验标准P < 0.05。

讨论

利用聚异丙基丙烯酰胺的温敏特性，合成PNIPAM温控脱细胞支架；采用海藻酸钠为致孔剂，将温敏性PNIPAM制成相互连通的大孔PNIPAM温控脱细胞支架；通过Schiff反应在PNIPAM上交联醛基化海藻酸钠，并以海藻酸钠为致孔剂，制成具有互穿网络结构的大孔PNIPAM交联醛基化海藻酸钠温控脱细胞支架。通过对3种温控脱细胞支架红外光谱进行比较分析，证明PNIPAM与醛基化海藻酸钠发生了化学交联反应，PNIPAM上的-NHNH₂和醛基化海藻酸钠上的-CHO反应生成C=N键。支架比表面积测定结果表明，PNIPAM温控脱细胞支架由于没有加入任何致孔剂，其比表面积只有135 m²/g；大孔PNIPAM温控脱细胞支架由于内部以海藻酸钠为致孔剂形成多孔结构，使其比表面积显著增加，达到386 m²/g；大孔PNIPAM交联醛基化海藻酸钠温控脱细胞支架由于内部不但以海藻酸钠为致孔剂，而且交联醛基化海藻酸钠形成互穿式网状结构，使其比表面积达到421 m²/g，可以印证大孔PNIPAM、大孔PNIPAM交联醛基化海藻酸钠温控脱细胞支架比PNIPAM温控脱细胞支架具有更加明显的孔洞结构。支架扫描电镜检测结果显示，PNIPAM温控脱细胞支架具有不规则的孔结构；大孔PNIPAM温控脱细胞支架具有规则的多孔结构，孔洞密集且分布均匀，相互贯穿相连，这是由于加入致孔剂海藻酸钠导致温敏凝胶产生多孔结构；大孔PNIPAM交联醛基化海藻酸钠温控脱细胞支架具有互穿网状的多孔结构，孔洞密集且分布均匀，相互贯穿相连，说明将温敏凝胶交联醛基化海藻酸钠并加入致孔剂海藻酸钠，导致温敏凝胶产生互穿网状多孔结构。支架温敏性能检测结果表明，3种温控脱细胞支架均具备温度敏感特性，而且最低临界溶解温度相近。支架孔隙率和孔径测定结果显示，大孔PNIPAM、大孔PNIPAM交联醛基化海藻酸钠温控脱细胞支架的孔隙率、孔径均高于PNIPAM温控脱细胞支架。支架生物相容性评价结果证实，大孔PNIPAM交联醛基化海藻酸钠温控脱细胞支架由于交联了醛基化海藻酸钠降低了细胞毒性，生物相容性明显优于另两种温控脱细胞支架。

哺乳动物细胞体外培养用于生物材料和医疗器械的细胞毒性评价已有很长历史，ISO10993-5：2009中推荐使用的细胞为小鼠成纤维细胞L-929。本实验选用该种细胞体外培养技术，将支架样品浸提液与细胞在体外进行接触培养，以细胞培养液(浸提介质)作为空白对照，已知无毒的高密度聚乙烯浸提液作为阴性对照，含5%二甲基亚砜的细胞培养液作为阳性对照。通过对细胞形态、增殖和抑制影响的观察和测定，来检测供试品接触细胞后对体外细胞产生的毒性作用，其方法具有合理性。

通过实验筛选出最佳三维细胞支架为大孔PNIPAM交联醛基化海藻酸钠温控脱细胞支架，进一步实验研究是以其为细胞培养支架，进行增殖培养研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

三种温控脱细胞载体的制备与性能评估

Preparation and performance of three kinds of thermoresponsive acellular carriers

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