骨吸收抑制剂降钙素对骨关节炎大鼠软骨组织形态及蛋白多糖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.42.003

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来有报道指出降钙素在临床上治疗骨关节炎有较好的临床疗效，但关于其对骨关节炎的作用机制却少有报道。

目的：观察降钙素对实验性骨关节炎模型大鼠软骨组织形态及蛋白多糖的影响。

方法：将30只SD大鼠随机均分为3组，模型组与给药组均切断右肢前交叉韧带制作骨关节炎模型，假手术组仅打开关节腔，不做韧带切断，给药组于造模后成功后第2天开始皮下注射降钙素15 IU/(kg•d)，模型组与假手术组均皮下注射等量生理盐水，连续给药6周。造模后10周，观察各组大鼠胫骨关节面，X射线检查股骨远端和内外侧踝软骨下骨骨密度，苏木精-伊红染色观察骨组织形态，甲胺苯蓝染色观察软骨组织中蛋白多糖含量。

结果与结论：假手术组大鼠胫骨关节面光滑，有光泽；模型组大鼠胫骨关节面无光泽，关节软骨暗红色，有较大溃疡面形成；给药组大鼠软骨面无光泽，局部溃疡，表面粗糙不平。与假手术组比较，模型组内外侧踝软骨下骨骨密度、骨体积、骨小梁数目升高(P < 0.05)，骨小梁分离度及蛋白多糖含量降低(P < 0.05)；给药组内外侧踝软骨下骨骨密度、骨体积、骨小梁数目低于模型组(P < 0.05)，骨小梁分离度及蛋白多糖含量高于模型组(P < 0.05)。表明降钙素对骨关节炎大鼠软骨有较好的保护作用，并能促进骨组织分泌蛋白多糖。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 降钙素, 骨关节炎模型, 骨关节炎, 骨组织形态, 蛋白多糖

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, calcitonin has been reported to have better clinical efficacy in the treatment of osteoarthritis, but its mechanism of action for osteoarthritis is rarely reported.

OBJECTIVE: To investigate the effect of calcitonin on the cartilage morphology and proteoglycan expression in rats with osteoarthritis.

METHODS: Thirty Sprague Dawley rats were randomly divided into three groups: model group, treatment group, and sham group. Anterior cruciate ligament transaction of the right limbs was implemented in the model and treatment groups, and only the joint cavity was exposed in the sham group. At 2 days after modeling, the treatment group received a daily subcutaneous injection of salmon calcitonin, 15 IU/(kg•d), and the model group and sham group were administered with normal saline at the same dose. The injection lasted for 6 weeks. At 10 weeks after modeling, the articular surface of the tibia of rats in each group was generally observed; bone mineral density of the distal femoral bone and subchondral bone of the lateral and medial ankle were detected using X-ray test; bone morphology and proteoglycan secretion were measured by hematoxylin-eosin staining and toluidine blue staining, respectively.

RESULTS AND CONCLUSION: The tibial articular surface was smooth and glossy in the sham group, but oxblood in the model group with large-area ulcers; the treatment group showed rough and local ulceration. Compared with the sham group, the bone mineral density of the subchondral bone of medial and lateral ankle were increased significantly in the model group (P < 0.05), but trabecular separation and proteoglycan content were decreased (P < 0.05). Compared with the model group, the bone mineral density of the subchondral bone of medial and lateral ankle were decreased significantly in the treatment group (P < 0.05), while the trabecular separation and proteoglycan content were increased (P < 0.05). These findings indicate that calcitonin has better protection on the cartilage of rats with osteoarthritis, and can promote bone the secretion of proteoglycan.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Calcitonin, Osteoarthritis, Models, Animal, Tissue Engineering

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图/表（结果） 4

2.1 造模成功动物数量及过程给药组与模型组实验动物均造模成功，进入结果分析。

2.2 模型方法的改进本次研究使用的是右肢踝骨前交叉韧带切断，并在其基础上将给药方式改为皮下注射，并且缩短了给药时间，将实验步骤简单化。

2.3 模型稳定性经过多年的实验验证，使用右肢踝骨前交叉韧带切断制作的大鼠模型具有较高的稳定性，且大鼠本身的发育机制与人类非常接近，因此常被用来制作各种疾病模型，以降低临床试验的风险。

2.4 各组大鼠骨组织大体观察从图1可以看出，假手术

组大鼠胫骨关节面光滑，有光泽；模型组大鼠胫骨关节面无光泽，关节软骨暗红色，有较大溃疡面形成；给药组大鼠软骨面无光泽，局部溃疡，表明粗糙不平。

2.5 各组骨密度测量结果表1方差分析结果表明，3组大鼠股骨远端骨密度比较差异无显著性意义(F=1.342，P > 0.05)；3组大鼠内外侧踝软骨下骨骨密度比较差异有显著性意义(F=8.317，P < 0.05)，模型组显著高于假手术组(P < 0.05)，给药组低于模型组(P < 0.05)，给药组和假手术组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.6 各组骨组织形态测量结果从表2可以看出，3组大鼠骨体积比较差异有显著性意义(F=27.48，P < 0.05)，模型组高于假手术组(P < 0.05)，给药组低于模型组(P < 0.05)，给药组和假手术组比较无差异(P > 0.05)；3组大鼠膝关节骨小梁厚度比较差异无显著性意义(F=1.421，P > 0.05)；3组大鼠骨小梁数目比较差异有显著性意义(F=4.132，P < 0.05)，模型组多于假手术组(P < 0.05)，给药组低于模型组(P < 0.05)，给药组和假手术组对比无差异(P > 0.05)；3组大鼠骨小梁分离度比较差异有显著性意义(F=17.812， P < 0.001)，模型组低于假手术组(P < 0.05)，给药组高于模型组(P < 0.05)，给药组和假手术组对比无差异。

2.7 各组甲苯胺蓝染色结果从图2中可以看出，模型组甲苯胺蓝染色灰度值明显高于假手术组(F=16.34，P < 0.05)；模型组甲苯胺蓝染色灰度值高于给药组(F=14.32，P < 0.05)；给药组甲苯胺蓝染色灰度值高于假手术组(F=14.34，P < 0.05)。

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引言

骨关节炎是一种退行性骨关节疾病，在中老年人群中有着较高的发病率，临床上又将该病称作增生性或退行性关节炎^[1-2]。有资料显示，欧洲国家范围内每1.5 min就会有1例由于骨关节炎导致的关节置换手术需要实施，而在美国这一情况更加严重，平均每年大约有500 000例关节置换手术^[3]。如此之高的发病率不但给患者个人造成严重的身心损害，同时也给家庭及社会造成了严重的经济负担^[4]。作为最常见的影响人类健康的关节疾病之一，骨关节炎主要表现多为关节软骨基质中的蛋白多糖及胶原纤维网络的降解，以及关节骨质增生和滑膜炎，从而造成关节软骨结构破坏、弹性降低，严重影响关节功能^[5]。近年来，随着中国老龄化的加剧，老年人口所占比例逐渐增加，受到骨关节炎威胁的人越来越多，有报道认为骨关节炎现已成为造成老年人运动障碍及残疾的首要原因，严重影响老年人的生活质量^[6]，因此对骨关节炎开展研究已成为临床医学的热门课题之一。

关节软骨退变是骨关节炎最为显著的病理变化之一，主要表现为软骨基质的降解和软骨细胞的调亡，其中有多种合成代谢与分解代谢细胞因子参与关节软骨退变进程中，因此骨关节炎关节软骨病变机制较为复杂^[7]，单一干预方式很难达到有效保护关节软骨的作用，目前临床治疗策略主要是增强关节软骨营养供应，润滑关节，减轻由炎症反应引起的疼痛症状等^[8]。尽管这些治疗手段在一程度上能够改善临床症状，但对抑制多种复杂致病因子的共同作用还尚显不足^[9]。以此为研究目标，进而探究潜在的骨关节炎改善性药物日渐受到重视^[10]。近年来有报道指出，降钙素在临床上治疗骨关节炎有较好的临床疗效。降钙素是由机体甲状腺C细胞产生和分泌的一种多肽，其可以抑制破骨细胞，从而抑制骨骼中的钙离子进入到血液中，临床上将其应用于骨炎、骨质疏松等骨科疾病取得了较好的临床效果，而关于其对骨关节炎的作用机制却少有报道^[11]。

为了提高临床试验的安全性，学术界通常使用动物模型来进行疾病的研究，这种研究方法简单方便、容易实施，并且成功率较高，重复性也好，因此很受欢迎。目前在动物模型的研究中，使用最多的动物是大鼠，在本次研究使用的也是大鼠，原因有以下几点^[12]：有研究证明，大鼠各个系统的发育机制与人类非常相似；大鼠生长较快，繁殖能力较强，常被用作与生长发育有关的实验研究；大鼠模型相对比较稳定且操作比较简单。使用动物模型能够明显降低风险程度，且根据多年的研究，大鼠模型与人类器官和组织的发育非常相似，具有较高的稳定性，是医学研究的最佳材料。本实验通过建立大鼠骨关节炎模型，并用降钙素进行治疗，探讨降钙素对实验性骨关节炎大鼠软骨组织形态及其蛋白多糖的影响，以期为降钙素的临床应用提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 造模动物及材料戊巴比妥钠、体积分数40%甲醛溶液、PBS、蒸馏水、氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠等都由上海依科赛生物制品有限公司提供；HMIAS-2000型全自动医学彩色图像分析系统(西安金马医疗器械有限公司)；切片机(无锡双盛石化)；降钙素(CT，诺华公司(瑞士)；双能X射线骨密度测量仪(DEXA，美国)。

取10周龄雄性SD大鼠30只，由河南贯中实验动物中心提供，SYXK(豫)2010-0001，动物许可证号：2005C047，随机均分为3组，分别为模型组、给药组与假手术组。

1.2 造模方法前交叉韧带横断是近年采用较多的建立骨关节炎模型方法。关节不稳定时，由于关节应力发生变化(局部增大或减小)，可引起关节的退行性改变，从而导致骨关节炎的发生。有学者在实验发现前交叉韧带切断后，表层带软骨细胞数量减少、肿胀、纤维化，变性的Ⅱ型胶原降解产物在纤维化区域明显增加。有研究将犬膝关节前交叉韧带切断后，发现犬关节滑膜增厚，软骨色泽改变，软骨表面糜烂，细胞成簇排列，骨赘形成，与前交叉韧带破裂所致自然发生关节不稳定病理现象相同。前交叉韧带横断模型手术简单、创伤小、稳定性好，对动物生理结构改变较少，能全面反映骨关节炎软骨退行性变化的病理过程，但该法造模时间长，一般需6周以上才能造模成功。

模型组和给药组均实施右肢踝骨前交叉韧带切断术制作骨关节炎模型，具体步骤为将2%戊巴比妥钠按照 40 mg/kg的剂量腹腔注射麻醉大鼠，之后将大鼠固定，手术区采用乙醇、碘酊消毒后铺设手术创巾。手术切口位置位于右肢踝骨前内侧髌骨旁，依次切口皮肤、筋膜和关节囊，可见髌骨、股骨关节面。此时将髌骨向外侧推开，同时使膝关节屈曲，露出前交叉韧带，之后将前交叉韧带切断，再以抽屉实验确认前交叉韧带是否已被切断，确认无误后以生理盐水冲洗干净，将髌骨复位，依次缝合关节囊，皮肤即可。假手术组则仅采用与上述手术相同的方法打开关节腔，直到暴露前交叉韧带为止，用生理盐水处理后，不做韧带切断便逐层缝合切口。

给药组于模型制作成功后的第2天开始给予皮下注射降钙素，剂量为15 IU/(kg•d)^[13]，模型组和假手术组均皮下注射等量生理盐水，各组大鼠均持续给药6周。

1.3 造模成功的检测标准对其进行正常的饮食管理，直至大鼠右肢踝骨出现不同程度的歪曲和颤动，说明造模成功。

1.4 标本采集与处理造模后第10周，将各组实验动物全部处死，取右肢踝骨胫骨干骺端，之后将附着在其上的周围软组织去除，用蒸馏水冲洗干净后，用体积分数10%中性甲醛浸泡在4 ℃下固定24 h。固定结束后，将组织用PBS浸洗，流水冲洗2 h后用15%乙二胺四乙酸二钠溶液进行脱钙处理，一般每5 d更换1次EDTA溶液，大约脱钙4周后，以针刺组织无阻力时表明脱钙完成。之后再将组织用梯度乙醇脱水(乙醇体积分数依次为70%、80%、95%、100%，每个梯度脱水 2 h)，二甲苯中透明处理，再经浸蜡，包埋后即可进行切片，切片时厚度定位5 μm，进行关节软骨全层不连续切片。

1.5 观察指标及评价方法 ①骨密度测量：将大鼠处死后，使用双能X射线骨密度测量仪在小物体扫描模式下测量股骨远端骨密度和软骨下骨骨密度。②骨组织形态测量：将切片经苏木精-伊红染色后，在HMIAS-2000图像分析系统下行骨组织形态计量分析，测量参数包括骨体积、骨小梁厚度、骨小梁数目及骨小梁分离度，每例标本取3张，每张随机取6个视野，测量后取平均值。③蛋白多糖：采用甲苯胺蓝染色法评估关节软骨中蛋白多糖的含量，切片常规脱蜡至水，甲苯胺蓝染液染色10 min；染色缓冲液漂洗2次，各1 min；脱水、透明、封固。

1.6 统计学分析采用SPSS 17.0数据处理软件分析数据，计量资料采用x(_)±s的形式表示，组间比较采用单因素方差分析，以P < 0.05表示差异显著性意义。

讨论

随着近年来中国人口结构调整，老龄化人口所占比例不断上升，骨关节炎作为中老年人群的一种常见关节疾患，严重影响了老年人的身体健康和生活质量，给患者家庭及社会都带来负担。研究表明，骨关节炎的发病历程为早期发生渐进性的软骨破坏，后期发生软骨下骨重建，而软骨下骨重建异常发生软骨下骨硬化，骨体积增加，降低了其对应力的吸收能力，从而使过多应力传至软骨造成软骨退变，致病情恶化^[14]。骨关节炎是一种以渐进性的软骨破坏和软骨下骨重建为特征的退行性关节疾病。在骨重建过程中，骨吸收与骨形成相偶联，破骨和成骨在同一部位有序进行^[15]。骨关节炎早期，软骨下骨重建以骨吸收占主导，后期继之以骨形成增加，最终导致软骨下骨硬化和骨体积的增加。近来越来越多的研究表明，骨关节炎中发生的骨重塑异常改变了软骨下骨的材料学特征，损害了其吸收应力的作用，丧失对关节软骨的保护功能^[16]。本实验选择常用的骨吸收抑制剂降钙素作为治疗药物，通过大体观察、骨密度测量、骨组织形态计量，同时通过甲苯胺蓝染色判断骨组织中蛋白多糖含量变化来探讨降钙素对骨关节炎的作用及机制。

为了提高临床试验的安全性，学术界通常使用动物模型来进行疾病的研究^[17]，这种研究方法简单方便、容易实施，并且成功率较高，重复性也好，因此很受欢迎^[18-20]。目前在动物模型的研究中使用最多的动物是大鼠，在本次研究中使用的也是大鼠，使用的造模方法是右肢踝骨前交叉韧带切断，操作过程严格按照操作标准进行，而且模型制作结果也比较成功。

实验对各组大鼠胫骨关节面的大体观察可看出，模型组胫骨关节面较假手术组破坏严重，给药组胫骨关节面仅形成局部溃疡，破坏程度较模型组较轻，但与假手术组相比仍可看出有一定程度的破坏，从此结果可看出降钙素对大鼠实验性骨关节炎有较好的治疗作用。此外，本实验对骨密度的测量结果表明，3组大鼠股骨远端骨密度比较差异无显著性意义；同时可发现3组大鼠内外侧踝软骨下骨骨密度差异显著，模型组高于假手术组(P < 0.05)，而给药组低于模型组(P < 0.05)，这说明骨关节炎大鼠的软骨下骨密度会增大，这种密度增大将不可避免地降低其在机体负重状态下对应力的吸收能力，从而降低其对软骨的保护作用，造成软骨破坏^[7]。

通过骨组织形态测量结果发现，与假手术组相比，模型组骨体积明显增大，骨小梁厚度明显降低，骨小梁数量增多，骨小梁间隙表现出降低的趋势，这一结果说明骨关节炎早期，软骨下骨在多种因素的共同作用下，代谢增强，骨小梁厚度、数量明显增加，这与骨密度测量结果显示模型组软骨下骨内外侧踝软骨下骨骨密度较假手术组明显升高完全符合。而给药组的骨体积、骨小梁厚度、骨小梁数量及骨小梁间隙与模型组相比均表现出了完全的逆转趋势，即降钙素抑制了软骨下骨的代谢，阻滞了软骨下骨的增生，保持了软骨下骨的材料特性，继续在关节负重时发挥对软骨的保护作用^[21]。这一结果与相关国外报道认为降钙素可通过存在于破骨细胞上的受体降低破骨细胞的活性，阻滞骨吸收，限制了软骨下骨的重建过程，保持了软骨下骨的生理特性，发挥对软骨的保护作用一致，这也与本实验发现给药组的胫骨关节面破坏较模型组轻基本相符^[22-23]，进一步佐证了本实验结果的科学可靠。

此外，通过分析甲苯胺蓝染色的实验结果可以看出，模型组甲苯胺蓝染色灰度值较假手术组明显偏高(P < 0.05)，给药组较模型组明显偏低(P < 0.05)，这一结果说明骨关节炎大鼠骨组织蛋白多糖的分泌量会减少，而降钙素可以在一定程度上上调骨关节炎大鼠的蛋白多糖分泌量。这一结果与相关报道认为降钙素可通过促进蛋白多糖分泌发挥对软骨的保护作用基本相符^[10]。

降钙素是目前临床上治疗骨质疏松的常用药物，其抑制骨吸收的作用是通过与破骨细胞上的降钙素受体相结合，抑制破骨细胞的功能来实现的^[24]。降钙素治疗大鼠骨性关节炎的作用机制尚不清楚，机械因素是其中一个很重要的原因^[25]。正常非负重状态，关节对合面并非完全吻合，负重时关节软骨和软骨下骨发生形变，最大限度增加关节面的接触面积^[26]。软骨下的网状基质以纵向的柱状排列，将负荷向下传递到骨干，这些网状骨如一个吸收能量的骨床，保护了上面覆盖的关节软骨^[27]。骨关节炎晚期，软骨下骨形成增加，骨质硬化^[28]。软骨下骨的异常，削弱了其吸收应力的能力，应力过分传导到关节软骨，促使其退变。本实验通过应用降钙素抑制早期软骨下骨吸收，与骨吸收相偶联的骨形成增加也随之减少，保护了软骨下骨的材料学特性，保护了关节软骨^[29]。除机械性的保护之外，软骨下骨可能还通过代谢性因素作用于关节软骨。骨关节炎中软骨的退变伴随着软骨下骨增厚，软骨病变与软骨下骨代谢增加，骨蛋白合成失调有关。这种失调导致骨细胞代谢异常，产生更多的前列腺素、白三烯和生长因子^[30]，这些因子可以通过裂隙和血管化形成的软骨和软骨下骨间通道影响软骨的代谢。

综合上述分析可以得出结论，降钙素对骨关节炎大鼠软骨有较好的保护作用，能促进骨组织分泌蛋白多糖，同时认为其发挥对软骨保护作用的机制可能是通过抑制软骨下骨重塑过程来实现的。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程