骨关节炎患者膝关节滑膜组织来源间充质干细胞的增殖与分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.001

摘要/Abstract

摘要：

背景：相对于其他来源的间充质干细胞，滑膜间充质干细胞来源丰富，并且滑膜组织可以在部分切除后迅速再生，并发症少，已逐渐成为近年来干细胞研究的热点。
目的：观察骨关节炎患者膝关节滑膜组织来源间充质干细胞的增殖和定向分化能力。
方法：对滑膜组织来源间充质干细胞进行分离及培养，采用MTT法检测细胞增殖能力，于成骨诱导第7天定量检测碱性磷酸酶活性，诱导第7，14，21天检测成骨相关基因表达，诱导第21天行茜素红染色。
结果与结论：①第3代滑膜间充质干细胞增殖速度较快，接种第1，2天处于潜伏期，3-6 d为对数增长期，第7天细胞增殖速度变慢，进入平台期。②成骨诱导后第3，7，10天诱导组碱性磷酸酶活性均显著高于对照组(P < 0.05)。成骨诱导21 d，茜素红染色阳性，细胞外基质中出现钙沉积以及钙结节。③成骨诱导第7天可见骨结合蛋白以及Runx-2的表达，至第21 天时，骨结合蛋白以及Runx-2的表达水平达到最大值。④以上结果表明来源于晚期骨关节炎患者膝关节滑膜组织的间充质干细胞具有很强的增殖能力，在体外可成功诱导分化为成骨细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨关节炎, 间充质干细胞, 膝关节, 滑膜组织, 体外培养, 成骨细胞, 定向分化

Abstract:

BACKGROUND: With respect to mesenchymal stem cells from other sources, synovial mesenchymal stem cells are rich in source, and moreover, the synovial tissue can regenerate quickly after partial hepatectomy and lead to fewer complications, in recent year, which have become a hot spot in stem cell research.
OBJECTIVE: To observe the proliferation and directional differentiation of synovial mesenchymal stem cells from osteoarthritis patients.
METHODS: Synovial mesenchymal stem cells were isolated and cultured. MTT assay was used to detect cell proliferation ability. Alkaline phosphatase activity was detected quantitatively at 7 days of osteogenic induction, and osteogensis-related gene expression was measured at 7, 14, 21 days of osteogenic induction. Alizarin red staining was performed at 21 days of induction.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Passage 3 synovial mesenchymal stem cells proliferated faster, which were in latent period at 1, 2 days after inoculation, in logarithmic growth phase at 3-6 days, and then entered into the plateau phase at 7 days. (2) The activity of alkaline phosphatase was significantly higher in the induction group than the control group at 3, 7, 10 days after osteogenic induction (P < 0.05). The cells were positive for alizarin red staining at 21 days of osteogenic induction, and there were calcium deposits and calcium nodules in the extracellular matrix. (3) Bone-binding protein and Runx2 were visible at 7 days of osteogenic induction, and reached the peak at 21 days. These findings indicate that synovial mesenchymal stem cells from patients with advanced osteoarthritis have strong proliferation ability, which can differentiate into osteoblasts under in vitro induction.

Key words: Knee, Synovial Membrane, Mesenchymal Stem Cells, Cell Proliferation, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

陈路，夏先学，蒋科. 骨关节炎患者膝关节滑膜组织来源间充质干细胞的增殖与分化[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.001.

Chen Lu, Xia Xian-xue, Jiang Ke. Proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells from the synovial tissue in patients with osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.001.

图/表（结果） 5

2.1 滑膜间充质干细胞形态倒置显微镜下观察，原代培养24 h左右大部分细胞贴壁，细胞形态多样，主要呈短小梭形，还有一部分呈圆形、多边形、星形等。随着培养时间延长，细胞密度变大。大约7 d可见细胞融合达培养瓶底面积的80%，细胞呈梭形，排列有序，传代后细胞扩增速度明显加快，细胞形态逐渐变成均匀一致的梭形，呈平行排列或漩涡状排列(图1A，B)。

2.2 滑膜间充质干细胞表面抗原表达利用流式细胞仪对滑膜间充质干细胞表面抗原进行检测，其中CD105、CD44、CD90 均呈阳性表达，表达率均 >99%，CD45、CD14、CD34、CD71均呈阴性表达，表达率均在6%-8%之间。
2.3 滑膜间充质干细胞生长增殖情况由第3代细胞生长曲线可见细胞增殖速度较快，接种第1，2天处于潜伏期，3-6 d为对数增长期，第7天细胞增殖速度变慢，进入平台期，说明滑膜间充质干细胞在体外具有很强的增殖能力(图2)。

2.4 滑膜间充质干细胞成骨诱导分化能力第3代滑膜间充质干细胞经成骨诱导后，细胞形态由梭形逐渐转变为立方形，细胞逐渐发生汇合，并形成铺路石状，茜素红染色显示有钙沉积以及钙结节形成(图3)。

2.5 滑膜间充质干细胞成骨诱导后碱性磷酸酶表达水平成骨诱导第3天碱性磷酸酶活性显著增加，诱导第7天达到峰值，随后逐渐降低。对照组细胞的碱性磷酸酶活性始终未出现明显的变化。诱导后第3，7，10天诱导组碱性磷酸酶活性均显著高于对照组(P < 0.05)，见图4。

2.6 滑膜组织来源间充质干细胞成骨诱导过程中成骨相关基因表达在成骨诱导第7天可见骨结合蛋白以及Runx-2的表达，至第21天时，骨结合蛋白以及Runx-2的表达水平均达到最大值，见图5。

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引言

材料方法

1 材料和方法 Materals and methods
1.1 设计细胞体外观察性实验。
1.2 时间及地点于2014年6月至2015年6月在川北医学院附属医院完成。
1.3 材料

滑膜组织来源：选取在川北医学院附属医院外科住院的膝关节骨性关节炎患者13例，男5例，女8例，平均年龄68岁，均行全膝关节置换治疗，提取术中需切除的膝关节滑膜组织。术前向患者详细交代提取样本的用途及实验目的，得到患者知情同意并签订知情同意书。排除有心血管疾病、肝肾疾病、肿瘤以及各种内分泌、结缔组织疾病患者。研究相关内容经川北医学院附属医院伦理部门审核并批准。
1.4 实验方法
1.4.1 滑膜组织来源间充质干细胞分离及培养无菌取出膝关节滑膜组织，放于含PBS的培养皿中去除脂肪和结缔组织，用PBS清洗3遍，剪成1 mm×1mm×1mm组织碎块，加入0.25%胰酶于37 ℃摇床中消化30 min，加入0.1%Ⅱ型胶原酶于37℃摇床中消化2 h，然后经100目筛网过滤去除组织碎片，用移液管将过滤液移入离心管，1 500 r/min离心10 min，弃去上清液，用含体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM培养基重悬，于37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中培养，隔天换液，在倒置显微镜下观察细胞生长状况，待细胞长满瓶底80%-90%时，吸去培养液加入0.25%胰酶-0.02%EDTA消化，镜下观察到胞质回缩，细胞间质增大后，加入体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基终止消化，用吸管吹打成单细胞悬液，以1∶3进行传代培养并用于后续实验。
1.4.2 流式细胞仪检测滑膜组织来源间充质干细胞表面抗原表达取第3代滑膜间充质干细胞，弃去原培养基，PBS漂洗2次，加入0.25%胰酶-0.02%EDTA消化，用PBS洗涤2次后，离心制成1×10¹⁰ L^-1细胞悬液。取100 µL细胞悬液加入实验管后分别加入3 µL不同的荧光标记单克隆抗体(分别为CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD90-FITC、CD14-FITC、CD71-FITC、CD105-PE)和相应的同型对照抗体振荡混匀，室温避光孵育30 min后，流式细胞仪检测，使用CellQuest软件分析数据。
1.4.3 滑膜间充质干细胞生长增殖情况取第3代滑膜间充质干细胞，常规消化、离心后，调整细胞悬液浓度为 1×10⁷ L^-1，以每孔100 μL接种于96孔板，设5个复孔，置于培养箱中培养24 h后每孔滴加5 μL MTT溶液(5 g/L)，再置于培养箱中培养4 h，每孔滴加150 μL二甲基亚砜，振荡 10 min后用酶标仪测量每孔吸光度(A)值，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
1.4.4 滑膜间充质干细胞成骨诱导分化能力取第3代滑膜间充质干细胞，胰酶消化传代，接种于6孔板，待细胞融合到80%后，加入成骨细胞诱导液(含体积分数为10%胎牛血清，10^-7 mol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸钠， 0.2 mmoL/L抗坏血酸的DMEM培养基)培养，对照组只用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基培养，每3 d换液1次，诱导第7天进行碱性磷酸酶活性检测，诱导第7，14，21天进行成骨相关基因表达检测，诱导第21天进行茜素红染色。
1.4.5 碱性磷酸酶活性定量检测在成骨诱导分化第3，7，10天，吸弃培养液，PBS清洗3遍，按碱性磷酸酶试剂盒操作步骤进行碱性磷酸酶活性检测，用酶标仪测定波长570 nm处各孔吸光度值，采用BCA法检测细胞内总的蛋白量，用以校正碱性磷酸酶活性。
1.4.6 茜素红染色取成骨诱导分化第21天的细胞，PBS清洗3次，40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS清洗3次，0.1%的茜素红室温染色40 min，PBS清洗3次，倒置显微镜下观察染色结果。
1.4.7 RT-PCR检测成骨相关基因表达取成骨诱导第7，14，21天细胞，弃培养液，PBS冲洗3次后，使用TRIzol试剂提取总RNA，通过cDNA合成试剂盒将RNA反转录合成cDNA，按反转录聚合酶链反应检测说明书操作步骤检测成骨相关基因表达。以β-actin为内参照，以目的基因与β-actin mRNA比值表示目的基因表达量。实验所用的引物见表1。

1.5 主要观察指标 ①滑膜间充质干细胞生物学特性。②滑膜间充质干细胞成骨诱导后的碱性磷酸酶表达以及成骨诱导过程中成骨相关基因表达。
1.6 统计学分析利用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理，计量资料予以t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨关节炎是一种常见的慢性退行性疾病，患者会出现不同程度的软骨退化现象^[5]。以往大多采用常规中药熏蒸、中药内服、针灸、推拿、离子导入等方式，以提高局部血液循环，改善软组织挛缩^[6-8]，并通过增加关节活动度，阻止关节面的进一步损害来保持关节的正常功能，多用于早期患者^[9]。对于关节软骨已经出现一定损伤，且关节功能存在明显障碍者，可以通过微创治疗并配合功能锻炼，以促进关节功能的康复。对于晚期软骨损伤面积较大，且开始出现关节畸形患者，则推荐进行关节置换^[10]。不同的治疗方法均具有一定的局限性和不足之处，无法获得满意的临床效果。
随着组织工程技术与干细胞技术的不断发展，间充质干细胞与骨关节炎治疗相关问题逐渐引起人们的广泛关注^[11-13]。鉴于间充质干细胞具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离培养操作简便等特点，正日益受到人们的关注。在适宜的诱导条件下，间充质干细胞能够较为容易地分化为软骨、成骨和脂肪细胞。目前，根据间充质干细胞的生物学特性，已建立骨髓、脂肪、脐血、脐带等多种组织来源间充质干细胞的分离、培养、扩增和鉴定的实验方法。滑膜组织具有很强的自我修复能力，即便受到一定的手术创伤或化学损伤，滑膜组织也能够完全恢复，且不会对关节的正常结构和功能等产生十分明显的影响^[14-15]。为此，实际临床治疗过程中，以不损伤患者关节正常结构和功能为前提，可以在微创手术
过程中获得所需的滑膜组织。本研究纳入13例患者均接受全膝关节表面置换，术中切除需要的滑膜组织，从而分离获得丰富的组织工程种子细胞。而且，受到滑膜自身特殊性的影响，血管数量较少，因此滑膜间充质干细胞免疫原性较低。
本实验获得的滑膜组织来源间充质干细胞具有典型的间充质干细胞生物学特性：为成纤维细胞样，呈漩涡状贴壁生长，其中CD105、CD44、CD90 均呈阳性表达，表达率均 > 99%，CD45、CD14、CD34、CD71均呈阴性表达。由第3代滑膜间充质干细胞生长曲线可见细胞增殖速度较快，接种第1，2天处于潜伏期，3-6 d为对数增长期，第7天细胞增殖速度变慢，进入平台期，说明滑膜间充质干细胞在体外具有很强的增殖能力。实验参照以往学者的方法对滑膜间充质干细胞进行成骨诱导分化^[16]，经定量碱性磷酸酶检测，碱性磷酸酶表达水平呈现出不断上升的情况，并在第7天达到最大值。在诱导21 d时，经茜素红染色和观察，可以发现存在大量被染成红色的钙质沉积。上述结果表明，通过体外成骨诱导之后，滑膜间充质干细胞成功的向骨细胞进行定向分化，这一结果也提示，诱导7 d为细胞外基质处于成熟期，诱导21 d可能为矿化期。细胞诱导成骨分化过程涉及到一些标志物^[17]，Runx2是一种成骨分化的特异性转录因子，被认为是成骨过程中重要的标志物，并对各种骨细胞外基质蛋白的合成产生积极的促进作用；骨结合蛋白是成骨细胞特异转录因子，在维持正常的骨骼生长发育中起着重要作用^[18-20]。实验结果也发现，在成骨诱导第7天可见骨结合蛋白以及Runx-2的表达，至第21天时，骨结合蛋白以及Runx-2的表达水平达到最大值，这一结果也与上文提到的诱导7 d为细胞外基质处于成熟期，诱导21 d可能为矿化期的结果一致。但受到入组样本数量以及观察时间等因素的影响，研究所得到的相关结果以及结论可能存在一定的片面性和不准确。
综上所述，晚期骨关节炎患者膝关节滑膜组织来源间充质干细胞在一定的体外环境下可诱导分化为成骨细胞，表明滑膜组织来源间充质干细胞有可能成为重要的组织工程种子细胞来源之一，可以给未来的再生医学带来新希望，并在骨组织修复等过程中发挥出重要的作用。