钳夹法构建视神经损伤兔模型：复明颗粒治疗损伤视神经的应力松弛分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.40.026

摘要/Abstract

摘要：

背景：有研究表明，中成药复明颗粒对治疗是神经损伤具有一定的疗效，但仍需进行大量的实验研究进行验证。

目的：以应力松弛实验的方法验证中成药复明颗粒干预治疗视神经损伤的效果。

方法：以钳夹法造成家兔视神经损伤，用复明颗粒稀释灌胃干预，并设模型组和正常对照组作对比，连续给药30 d 后取各组动物视神经进行应力松弛实验和组织形态观察。

结果与结论：正常对照组视神细胞核分别均匀，无明显水肿及增大，无炎症细胞，轴突等内容物形态清晰。模型组视神经纤维排列稀疏，结构模糊，轴突、核碎裂轴突等内容物形态发生了改变。复明颗粒治疗组视神经横断面较大面积神经纤维排列较密集，多数轴突形态正常。视神经7 200 s应力下降量和和应力松弛下降值均为正常对照组>复明颗粒治疗组>模型组(P < 0.05)。结果证实，中成药复明颗粒加快了损伤视神经轴浆恢复，使轴突形态恢复正常，有利于损伤视神经的恢复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物, 组织构建实验模型, 家兔, 视神经, 损伤, 中成药, 复明颗粒, 治疗, 应力松弛, 黏弹性, 组织形态

Abstract:

BACKGROUND: Many studies have shown that Chinese medicine Fuming granules have certain curative effects on optic nerve injury, but a large number of experimental studies are still needed to verify.

OBJECTIVE: To verify the effect of Chinese medicine Fuming granules on optic nerve injury by the method of stress relaxation experiments.

METHODS: The animal models of optic nerve injury were established by the clamping method. Rats were intervened with Fuming granules by intragastric administration. Model group and normal control group were set for comparison. After 30 days of successive administration, optic nerve injury received stress relaxation experiments in each group, and histomorphology was observed.

RESULTS AND CONCLUSION: In the normal control group, the optic nerve nuclei distributed uniformly without edema, augmentation or inflammatory cells, and the axon and other contents had a clear structure. In the model group, the optic nerve fiber arranged sparsely, presented unclear structure, and axon, karyorrhexis and the other contents changed. In the Fuming granule group, the transect of optic nerve which arranged densely had large area, and most of the axon had a normal structure. The decreases in stress at 7 200 s and stress relaxation were as follows: normal control group > fuming granule group > model group (P < 0.05). Results confirmed that Chinese medicine Fuming granule accelerates the recovery of axoplasm of injured optic nerve, restores the morphology of axons, and contributes to the recovery of injured optic nerve.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Biomechanics, Optic Nerve, Stress

中图分类号:

R318

袁毅，常笑语，李新颖. 钳夹法构建视神经损伤兔模型：复明颗粒治疗损伤视神经的应力松弛分析[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(40): 6536-6541.

Yuan Yi, Chang Xiao-yu, Li Xin-ying. Rabbit models of optic nerve injury established by the clamping method: an analysis of stress relaxation of injured optical nerve after treatment with Chinese medicine Fuming granules[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(40): 6536-6541.

图/表（结果） 3

2.1 造模成功动物数量及过程正常对照组制得视神经标本11个，其中10个用于检测应力松弛性能指标、1个用于组织形态观察；模型组和复明颗粒治疗组各21只，制得视神经标本各21个，其中各20个用于检测应力松弛性能指标、各1个用于组织形态观察。实验兔53只无感染和死亡，均纳入结果分析。建模流程图见图1。 2.2 各组视神经试样的应力松弛曲线由3组动物视神经7 200 s应力松弛实验得出的应力松弛曲线见图2A。由图2A可知，正常对照组视神经7 200 s应力较0 s时下降了0.123 MPa、复明颗粒治疗组视神经7 200 s应力较 0 s时下降了0.112 MPa、模型组视神经7 200 s应力较0 s时下降了0.104 MPa，正常对照组视神经7 200 s应力下降量大于模型组、复明颗粒治疗组(P < 0.05)，复明颗粒治疗组7 200 s应力下降量大于模型组(P < 0.05)。随着时间的改变各组试样的应力松弛曲线不断下降，达到7 200 s时曲线基本达到水平。各组试样应力松弛曲线是以对数关系变化的。 2.3 各组视神经试样的归一化应力松弛函数曲线各组视神经试样的归一化应力松弛函数曲线见图2B。视神经 7 200 s应力松弛函数下降值：正常对照组> 复明颗粒治疗组>模型组(P < 0.05)。结果表明，随着时间的改变各组试样的归一化应力松弛函数曲线不断下降，达到7 200 s时曲线基本达到水平，各组试样应力松弛函数曲线是以对数关系变化的。 2.4 各组视神经试样的归一化应力松弛函数的建立由图2可知，应力松弛曲线是以对数关系变化的，按文献[23]的方法设定：

将实验数据代入(2)式分别解出各组视神经的c，d值，将两组试样的c，d值代入(1)式得出各组视神经试样的归一化应力松弛函数方程如下：

正常对照组：

2.5 扫描电镜观察各组视神经横断面的超微结构给药30 d后，扫描电镜观察显示，正常对照组视神细胞核分别均匀，无明显水肿及增大，无炎症细胞，轴突等内容物形态清晰，见图3A。模型组视神经纤维排列稀疏，结构模糊，轴突、核碎裂轴突等内容物形态发生了改变见图3B。视神经损以复明颗粒治疗组视神经横断面较大面积神经纤维排列较密集，多数轴突形态正常，见图3C。

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引言

创伤性视神经损伤后早期可以没有外部、眼底及镜下的损伤表现，却可出现视力丧失，发生率为0.5%-5.0%^[1]，大约50%患者最终失明^[2]，而40%患者可有不同程度的视力损失^[3]。国内外学者对视神经的保护、视神经损伤诊断和治疗进行了大量的研究^[3-12]。目前临床上视神经损伤常用的治疗方法包括糖皮质激素、甘露醇脱水和视神经管减压等，但国际视神经创伤研究小组认为，激素治疗和视神经管减压术均不是治疗创伤性视神经病变的金标准，都不能有效阻止视神经萎缩的发生^[1^，^5]。从治疗效果和不良反应等考虑中药治疗视神经损伤较西药更具综合优势^[13]。有学者们对中药治疗视神经损伤进行了大量的研究，朱劲等^[14]采用视神经夹伤方法，建立家兔创伤性视神经病变模型，通过测定凋亡相关基因bcl-2和bax的表达，观察复光颗粒对受损视神经的影响。得出了复光颗粒具有上调抗凋亡基因bcl-2和下调促凋亡基因bax表达的作用，可减轻视神经损伤作用的结论。李月华等^[15]对银杏叶提取物(EGb761)对大鼠急性高眼压诱导缺血再灌注模型中视网膜神经节细胞的保护作用进行了研究，结果发现在急性高眼压诱导缺血再灌注模型中，银杏叶提取物能有效地保护视网膜神经节细胞。王玉娟等^[16]报道了补阳还五汤对实验性视神经损伤后视网膜中丙二醛及超氧化物歧化酶含量的影响。结果发现治疗后5，14，28 d，补阳还五汤可明显抑制丙二醛含量的增高和超氧化物歧化酶活性的下降。得出了视神经损伤可以导致视网膜中丙二醛含量增加及超氧化物歧化酶活性下降。补阳还五汤对实验性视神经损伤具有一定的修复作用的结论。徐丽等^[17]观察了中成药复明颗粒对实验性牵拉性视神经损伤后轴浆运输的影响，实验分别以³H-亮氨酸和辣根过氧化物酶作为示踪剂, 通过放射自显影和电镜观察发现中成药治疗30 d后，损伤视神经的轴浆流动速度明显改善。得出了牵拉性视神经损伤后，其轴浆流速明显降低，中成药复明颗粒可明显加快牵拉性视神经损伤后轴浆流速度的恢复的结论。以应力松弛指标判断复明中药治疗视神经损伤效果罕见报道。实验推断认为，视神经损伤动物模型以复明颗粒干预治疗后，动物视神经的应力松弛特性、组织形态会得到一定的恢恢，但必须经过实验来证明。基于此，实验以视神经损伤兔为动物模型，以中成药复明颗粒进行干预治疗，以应力松弛特性、组织形态学的观点探讨以中成药复明颗粒干预治疗视神经损伤动物模型的效果，旨在为临床提供生物力学基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

材料方法

1.1 造模动物及实验动物健康6月龄日本大耳白家兔53只，体质量2.8-3.0 kg，均为雌性，由长春高新医学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK(吉)2003-0004。实验前采用体积分数10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉动物，外眼及眼底检查均无病变者纳入实验。动物饲养室室温19-24 ℃，相对湿度55%-70%，自然光照，空气流通。动物在笼中饲养，自由摄食饮水，饲料为全价兔颗粒料。

钳夹法复制视神经损伤模型兔实验相关试剂及仪器：
试剂及仪器	生产厂家
复明颗粒，国药准准字Z61021134	西安碑林药业股份有限公司
庆大霉素	沈阳天医生物制药股份有限公司
MODEL55100型自动控制电子万能试验机	长春试验机研究所
W40160(3.7 cm)反向血管夹	上海医疗器械厂
CCs-3读数显微镜	长春市第三光学仪器厂
MERLIN Compact型扫描电镜	德国耶那城卡尔蔡司公司

1.2 造模方法实验于2014年1月至6月在吉林大学力学实验中心完成。

分组及干预：将53只日本大耳白家兔随机分为正常对照组11只、复明颗粒治疗组21只和模型组21只。正常对照动物组与不做任何处理，模型组建模不给药，复明颗粒治疗组于造模4 d后以灌胃的方法给予复明颗粒(4 g/kg)，1次/d。连续给药30 d^[14]。

构建视神经损伤模型兔：按以往研究方法复制视神经损伤动物模型^[18-19]，实验以质量浓度1 g/L的乌拉坦(5 mg/kg)兔耳缘静脉注射麻醉，之后将家兔俯卧固定于动物手术台上。切开兔左侧眼顶侧眶上皮肤，暴露眶上缘切迹和眶壁，经眶上缘切迹处向视神经管方向咬除双侧部分眶壁骨板(深7.0-8.0 mm，宽6.0 mm)，剪开后部眼球筋膜，沿上直肌向球后钝性分离，暴露球后视神经。游离视神经约 5.0 mm，离后极部约3.0 mm，以上海医疗器械厂W40160 (3.7 cm)反向血管夹(夹于同一部位钳夹视神经5 s。术野用庆大霉素液冲洗2次后以青岛耐克医材有限公司生产的10-0号尼龙线分层缝合。造模过程中避免损伤视网膜中央血管系统。术后结膜囊内涂红霉素眼膏。

1.3 造模成功的检测标准致伤眼直接对光反应消失，瞳孔散大固定；检眼镜观察眼底，视网膜血管无出血与梗塞者作为造模成功的动物纳入实验。

1.4 视神经标本取样给药30 d后^[14]，处死模型组、复明颗粒治疗组、正常对照组动物，暴露视神经，在镜下取出眶内段视神经，置于生理盐水槽中，在4 ℃保存备用。

1.5 扫描电镜观察观察各组视神经纵断面的显微结构给药30 d后，取各组动物眶内视神经各一随机选取各组动物眶内视神经各1条，坐骨神经，均修剪为5 mm的小段，体积分数4%戊二醛前固定，体积分数1%锇酸后固定，丙酮梯度脱水，临界点干燥，真空喷金镀膜，场发射扫描电镜下观察各组视神经织横断面，了解神经细胞、髓鞘、轴突及神经基底膜等结构的变化。

1.6 应力松弛实验实验设备为长春试验机研究所生产的自动控制电子万能试验机，以长春市第三光学仪器厂生产的读数显微镜测量各组视神经试样的长度和直径，各组动物视神经拉伸试样长均为10 mm，正常对照动物组视神经试样直径1.00-1.03 mm，模型组视神经试样直径0.98-1.00 mm，复明颗粒治疗组试样直径0.99-1.02 mm。再按以往研究的方法对每个视神经试样反复加卸载10次，进行预调处理^[20-22]。实验模拟正常人体温(36.5±1.0) ℃条件下，分别将3组视神经试样装夹在试验机夹头内，以50%/min的速度对试样施加应变，当正常对照组试样应变达到3.98%、复明颗粒治疗组试样应变达到3.85%、模型组试样应变达到3.78%时，各组试样应力达到0.454 MPa时，使应变保持恒定，应力随着时间的改变不断下降。设定实验时间为7 200 s。观察试样的应力松弛数据和曲线，应力与时间的变化规律。为保持试样的湿度，实验过程中不断的向试样淋生理盐水。实验结束后，控制机器的计算机自动输初应力松弛数据和曲线。

1.7 主要观察指标应力松弛数据与曲线，应力与实间的变化规律。

1.8 统计学分析计量资料以x(_)±s表示，用SPSS 16.0统计学软件(SPSS，Chicago，IL，USA)进行数据分析，组间数据差异的比较采用单因素方差分析法和Schffe法，以回归分析的方法分别建立各组试样的应力-应变函数关系表达式。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

应力松弛实验结果表明，正常对照组视神经7 200 s应力下降量大于视神经损伤动物以复明颗粒治疗组、模型组，复明颗粒治疗组视神经7 200 s应力下降量大于模型组。实验结果显示，各组试样应力松弛实验最初600 s应力下降较快，之后应力缓慢下降，达到7 200 s时应力松弛曲线趋于水平，各组试样应力松弛曲线是以对数关系变化的。视神经损伤动物以复明颗粒治疗组动物视神经应力松弛特性与组织形态均得到了一定的恢复，与所期望的结果相符。视神经的黏弹性特性是为了适应视神经的生理功能存在的，其黏弹性流变特性主要以应力松弛、蠕变为表现形式。视神经应力松弛是视神经对变形适应性的反应。应力松弛特性对于视神经的生理功能非常重要，视神经正常范围内的应力松弛特性有利于抵抗变形，视神经的生理功能要求神经纤维保持完整的结构，结构完整的视神经才具有良好的应力松弛特性。电子显微镜观察结果表明，模型组视神经纤维排列稀疏，结构模糊，轴突、核碎裂轴突等内容物形态发生发生了改变。所以其应力松弛特性发生了改变。正常对照组视神细胞核分别均匀，无明显水肿及增大，无炎症细胞，轴突等内容物形态清晰，所以其具有良好的应力松弛特性。复明颗粒治疗组视神经横断面较大面积神经纤排列维密集，大多数轴突形态正常，所以其应力松弛特性具有较大的恢复。目前, 药物早期应用仍是视神经损伤的主要治疗手段之一。一些西药如神经营养药、谷氨酸拮抗药、钙通道阻滞药、一氧化氮合成酶抑制药等已用于创伤性视神经损伤的实验和临床研究，但毒不良反应较明显，单味中药或其提取物或其复方具有清除自由基，扩张微血管, 改善微循环等作用，从治疗效果和不良反应等考虑中药治疗视神经损伤较西药更具综合优势^[24]。中医认为，创伤性视神经病变主要致病机制在于：目系受损，气血失和，血瘀气滞，脉道瘀阻，玄府闭塞，神光发越受阻甚至神光泯灭，从而表现视力骤降或丧失。临床治疗多以活血化瘀、疏肝解郁、滋养肝肾为治疗原则^[14]。复明颗粒由菊花、决明子、石斛、人参、枸杞子、山茱萸(制)、熟地黄、黄连、羚羊角、石决明、夏枯草、木通等24味组成，复明颗粒的组方，大多以活血化瘀、疏肝解郁、滋养肝肾为主。在以往的临床观察中，复明颗粒对改善青光眼视神经损伤患者视力方面有一定功效^[25-50]。本次实验组织形态观察和应力松弛结果表明，通过以中药复明中药治疗动物视神经钳夹伤取得了较好的疗效。复明颗粒是已上市的国药准字号中成药，用于动物实验以往的文献报道均采用将复明颗粒稀释后灌服的方法，证明灌服的方法效果很好。本次实验对视神经损伤以复明颗粒干预治疗组家兔采用将复明颗粒稀释后灌服的方法，由于对以复明颗粒干预治疗组的每只家兔每天均灌服相同剂量的复明颗粒，所以可避免治疗效果产生偏倚。以往对动物视神经损伤模型药物治疗效果分析多以生物学、组织形态学观察等进行研究。文章与以往研究不同的是以应力松弛指标和组织形态分析结果探讨以复明颗粒治疗视神经损伤的效果，具有创新性。文章提示，应力松弛特性指标是判断视神经损伤以药物治疗效果的方法之一。由于实验试样样本数量有限和生物材料的个体差异性，实验数据难免有一定的离散性，但是对临床还是有一定的参考价值的。大鼠视神经钳夹伤动物模型的病理学观察。中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程