体表脉冲电刺激大动物的安全性评估

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.40.025

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前电刺激技术已成为研究热点，但其对机体心电活动的影响尚不明确，且既往此方面研究主要针对小型动物。

目的：在不影响心电活动的前提下，寻找刺激猪肝区所能使用最大的脉冲电压及频率。

方法：取健康雄性荣昌猪3头，将脉冲电刺激仪输出电极固定于猪肝右叶体表投影前后对应部位，设置固定电刺激参数为波宽10 ms、方波，刺激时间为1 h，分别进行5-100 V的电压耐受实验和1-5 Hz的频率耐受实验，观察猪的动态心电图变化、其不适反应和生活行为的改变。

结果与结论：电压耐受实验中脉冲电刺激电压高低与心率增量呈正相关；当电压> 35 V时，可发生窦性心律不齐、室性早搏等轻度心律失常，无恶性心律失常、死亡；当电压> 60 V时，可见电刺激诱发形成的qRs波。频率耐受实验中当频率> 2 Hz时可见心律失常发生，无恶性心律失常，脉冲电刺激可诱发形成qRs波。提示选择参数为电压35 V、频率2 Hz的脉冲电刺激猪肝区是安全的，电压大于35 V或频率大于2 Hz的脉冲电刺激猪肝区均可引发心律失常，多为良性心律失常。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物, 组织构建实验模型, 脉冲电刺激, 脉冲疗法, Ⅱ导联心电图, 心率, 心律失常, 心血管系统

Abstract:

BACKGROUND: At present, electrical stimulation technology has become a hot topic, but its effect on body’s electrical activity remains unclear. Moreover, previous studies on this aspect mainly focused on small-sized animals.
OBJECTIVE: Under the premise without prejudice to cardiac electrical activity, to find the maximum pulse voltage and frequency of electrostimulation that is taken on the liver area of pigs.
METHODS: Three healthy male Rong-Chang pigs were obtained. Pulse electrical stimulator electrodes were fixed on right lobe of the surface projection of corresponding liver area. Fixed electrical stimulation parameters were set, including pulse width 10 ms, square wave, stimulation time 1 hour. They received voltage tolerance experiment between 5 V and 100 V and a frequency tolerance experiment between 1 Hz and 5 Hz. A detail record of pigs’ electrocardiogram, discomfort reaction and changes in life behavior of the pigs were obtained.
RESULTS AND CONCLUSION: During voltage tolerance experiment, high- and low-voltage electrical stimulation pulse was positively associated with heart rate increment. When the voltage was greater than 35 V, mild arrhythmia such as sinus arrhythmia and ventricular premature beats appeared, without malignant arrhythmia or death. When the voltage was greater than 60 V, qRs formation induced by electrical stimulation wave occurred. In frequency tolerance experiment, when frequency was greater than 2 Hz, arrhythmia appeared, no malignant arrhythmia was found. Pulsed electrical stimulation can induce the formation of qRs wave. Above findings suggest that the appropriate frequency and voltage of pulse electrical stimulation are 2 Hz and 35 V. At > 35 V voltage or > 2 Hz frequency, pulsed electrical stimulation on the liver area can cause arrhythmia, mostly benign arrhythmia.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Electric Stimulation, Electrocardiography, Arrhythmias, Cardiac, Arrhythmia, Sinus

中图分类号:

R318

邱杰，张辉，张晓刚. 体表脉冲电刺激大动物的安全性评估[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(40): 6531-6535.

图/表（结果） 1

所有荣昌猪均进入结果分析。荣昌猪安静情况下心电图表现为窦性心律，与人类的心电图相似，全天心率波动在130-170次/min，偶见室上性早搏[(2±2)次/d]，未见室性早搏、房颤(图2)。 2.1 脉冲电刺激电压耐受实验 2.1.1 电压变化与心率的关系脉冲电刺激电压变化与心率增量呈正相关(表1，图3)。

2.1.2 电压变化与心律失常的关系脉冲电刺激为电压5-35 V时，猪未见心律失常发生。脉冲电刺激电压> 35 V时，实验猪发生窦性心律不齐、室性早搏、窦性心动过速等轻度心律失常(图4)。脉冲电刺激电压为35-100 V时，监护心电图在实验刺激电压范围内，无恶性心律失常、死亡等发生。脉冲电刺激电压>60 V时，脉冲电刺激电压>60 V时可见电刺激诱发形成的qRs波(图4C)。 2.1.3 电压变化与猪不适反应的关系脉冲电刺激电压为5-35 V时，猪未见适反应。脉冲电刺激电压>35 V时，猪表现为烦躁、呻吟不止。脉冲电刺激电压>60 V时，呼吸急促、剧烈挣扎、嚎叫不止。脉冲电刺激电压为100 V时，可见尿便失禁，甚至以头撞等自残行。 2.1.4 电压改变与猪生活行为的关系当脉冲电刺激电压小于60 V时，实验后猪恢复好，活动、饮食等均无明显改变；当电刺激电压大于90 V时，猪出现无进食、活动明显减少、患疾病等重度生活行为异常，经休息、药物治疗后能快速好转，未发生死亡。 2.1.5 电压变化与局部组织损伤的关系脉冲电刺激电压5-100 V范围内，肝区电刺激部位无明显损伤。 2.2 脉冲电刺激频率耐受实验

2.2.1 心电图变化脉冲电刺激频率为1.0-2.0 Hz时，未见心律失常发生，亦无脉冲电刺激诱发形成的qRs。脉冲电刺激频率大于2 Hz时，可见心律失常发生；脉冲电刺激可诱发形成qRs波(图5)。 2.2.2 不适反应、生活行为改变脉冲电刺激频率为1.0-2.0 Hz时，猪未见明显不适。脉冲电刺激频率为3-5 Hz时，猪出现无进食、活动明显减少、患疾病等重度生活行为异常，经休息、药物治疗后能快速好转，未发生死亡。局部损伤未见。

参考文献

[1] 王彤,吴海东,符岳,等.电刺激诱发猪心室颤动模型的研究和改进[J].岭南急诊医学杂,2006,32(2):132-136.
[2] 白怀,Mccaing CD,Forrester JV,等.微电场影响血管内皮细胞血管新生行为的分子机制[C].第九届西南三省一市生物化学与分子生物学学术交流会,2008:45.
[3] Li X, Kolega J. Effects of direct current electric fields on cell migration and actin filament distribution in bovine vascular endothelial cells. J Vasc Res. 2002;39(5):391-404.
[4] Small JV. Lamellipodia architecture: actin filament turnover and the lateral flow of actin filaments during motility. Semin Cell Biol. 1994;5(3):157-163.
[5] Cortese B, Palamà IE, D'Amone S, et al. Influence of electrotaxis on cell behaviour. Integr Biol (Camb). 2014; 6(9):817-830.
[6] Herman IM. Molecular mechanisms regulating the vascular endothelial cell motile response to injury. J Cardiovasc Pharmacol. 1993;22 Suppl 4:S25-36.
[7] Fujino Y, Tanishima T. Actin in wound-healing of rabbit corneal endothelium. II. Study by nitrobenzoxadiazole-phallacidin method. Jpn J Ophthalmol.1987;31(3):393-404.
[8] Zhao M, Agius-Fernandez A, Forrester JV, et al. Orientation and directed migration of cultured corneal epithelial cells in small electric fields are serum dependent. J Cell Sci. 1996; 109 ( Pt 6):1405-1414.
[9] Bai H, McCaig CD, Forrester JV, et al. DC electric fields induce distinct preangiogenic responses in microvascular and macrovascular cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004; 24(7): 1234-1239.
[10] Le Clainche C, Carlier MF. Regulation of actin assembly associated with protrusion and adhesion in cell migration. Physiol Rev. 2008;88(2):489-513.
[11] Wu S, Wang Y, Guo J, et al. Nanosecond pulsed electric fields as a novel drug free therapy for breast cancer: an in vivo study. Cancer Lett. 2014;343(2):268-274.
[12] Chen X, Zhuang J, Kolb JF, et al. Long term survival of mice with hepatocellular carcinoma after pulse power ablation with nanosecond pulsed electric fields. Technol Cancer Res Treat. 2012;11(1):83-93.
[13] Guo F, Yao C, Li C, et al. In vivo evidences of nanosecond pulsed electric fields for melanoma malignancy treatment on tumor-bearing BALB/c nude mice. Technol Cancer Res Treat. 2014;13(4):337-344.
[14] Chen R, Sain NM, Harlow KT, et al. A protective effect after clearance of orthotopic rat hepatocellular carcinoma by nanosecond pulsed electric fields. Eur J Cancer. 2014;50(15): 2705-2713.
[15] Wu S, Guo J, Wei W, et al. Enhanced breast cancer therapy with nsPEFs and low concentrations of gemcitabine. Cancer Cell Int. 2014;14(1):98.
[16] Chen X, Kolb JF, Swanson RJ, et al. Apoptosis initiation and angiogenesis inhibition: melanoma targets for nanosecond pulsed electric fields. Pigment Cell Melanoma Res. 2010; 23(4): 554-563.
[17] Chen X, Yin S, Hu C, et al. Comparative study of nanosecond electric fields in vitro and in vivo on hepatocellular carcinoma indicate macrophage infiltration contribute to tumor ablation in vivo. PLoS One. 2014;9(1):e86421.
[18] Zou H, Gan XL, Linghu LJ, et al. Intense nanosecond pulsed electric fields promote cancer cell apoptosis through centrosome-dependent pathway involving reduced level of PLK1. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2013;17(2):152-160.
[19] Burke PA, DeNardo SJ, Miers LA, et al. Cilengitide targeting of alpha(v)beta(3) integrin receptor synergizes with radioimmunotherapy to increase efficacy and apoptosis in breast cancer xenografts. Cancer Res. 2002;62(15): 4263-4272.
[20] Dineen SP, Sullivan LA, Beck AW, et al. The Adnectin CT-322 is a novel VEGF receptor 2 inhibitor that decreases tumor burden in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 2008;8:352.
[21] Stratmann A, Acker T, Burger AM, et al. Differential inhibition of tumor angiogenesis by tie2 and vascular endothelial growth factor receptor-2 dominant-negative receptor mutants. Int J Cancer. 2001;91(3):273-282.
[22] 李自立,张萍.电刺激对心血管系统影响[J].心血管病进展,2010, 17(5): 28.
[23] 甘世祥,冯济凤,董菲洛,等.贵州小型猪正常心电图研究[J].贵阳中医学院学报,1996,18(1):21-22.
[24] Oppenheimer SM. Neurogenic cardiac effects of cerebrovascular disease. Curr Opin Neurol. 1994;7(1):20-24.
[25] 王艺明,刘兴德,董为伟,等.电刺激大鼠岛叶对心电图和心率变异性的影响[J].中国医师杂志,2003,5(12):1065-1067.
[26] 吴子建,龙迪和,何璐,等.不同频率电针“内关”穴对急性心肌缺血模型家兔心交感神经电活动的影响[J].时珍国医中药,2012, 23(6):241-244.
[27] 汪克明,周美启,王月兰,等.电针“脾俞”穴对胃窦部溃疡大鼠平滑肌电活动的干预作用及机制探讨[J].安徽中医学院学报,2003, (6):222-226.
[28] Ziegelstein RC. Acute emotional stress and cardiac arrhythmias. JAMA. 2007;298(3):324-329.
[29] 周矗,刘政疆.乌鲁木齐“7•5事件”伤者临床心电图变化分析[J].中国误诊学杂志,2011,11(18):4327-4327.
[30] 徐新萍,左红艳,王少霞,等,高压脉冲电流对家兔心脏功能与结构的影响[J].解放军医学杂志,2011,36(6):633-635.

引言

随着医学技术、生物技术和物理技术发展，电休克疗法、心脏起搏器、电除颤技术等电刺激技术不断发展并应用于临床治疗和科学研究中，同时一些新兴研究提示电刺激可促进干细胞定向分化^[1-10]。电脉冲疗法对肿瘤细胞有抑制和杀伤作用^[11-21]，且电刺激技术在干细胞移植、肿瘤治疗等方面成为研究热点。研究发现不同电刺激作用于组织和细胞后产生的效果差异很大，这可能与电刺激参数(电压、频率、持续时间、脉冲波形等)和细胞组织的特性不同有关^[22]，其具体作用机制并不明确，可能是通过电能引起机体理化、生化反应，并通过一系列神经体液反应调节组织或器官功能，以达到相应目的。心脏受双神经支配，且心肌自律细胞具有自主电活动，心脏容易受外源性电刺激影响，如电击伤后心肌细胞出现严重损害，电休克治疗中出现严重心律失常等病例也时有报道，所以电刺激技术的安全性需要进一步确认。脉冲电刺激技术对机体心电活动的变化应引起高度关注，既往该方面的研究少，且主要针对小型动物如昆明小鼠，从研究对象方面和人体存在极大差异，对临床工作的指导作用有限。猪作为大型哺乳动物，在心脏结构、心电活动等方面和人体有一定的相似，一直以来都是科研工作中比较理想的动物研究对象^[23]。本实验在不影响心电活动的前提下，寻找刺激猪肝区所能使用最大的脉冲电压及频率，为行电刺激动物及临床试验累积基本实验资料，并指导和促进电刺激技术在临床工作中的应用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

材料方法

1.1 造模动物及材料清洁级健康雄性荣昌肉猪3头(标记A、B、C)，猪龄4.5-5.0个月，体质量28.5-32.0 kg，由重庆医科大学动物中心提供，SYXK(渝)2012-0001。实验符合动物伦理学的要求。实验经重庆医科大学附属第一医院动物伦理学委员会的批准。

猪体表脉冲电刺激使用的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
地西泮	西安利君制药有限公司
BL-420F生物机能系统	成都泰盟科技公司

1.2 电刺激方法实验于2013年11月至2014年3月于重庆医科大学动物实验中心完成。

动物镇静：于猪耳缘静脉注射地西泮15 mg，将猪固定于自制木质绝缘束缚架上，此后每间隔约45 min静脉注射地西泮5 mg，维持猪于神志清醒、安静，无呻吟及挣扎状态。

脉冲电刺激部位：BL-420F生物机能系统输出刺激电极的正极与猪腹壁肝脏右叶投影部位电极片连接，负极与猪背部肝脏右叶投影部位电极片连接(图1)。

脉冲电刺激基本参数选择：设置脉冲电刺激波为方波。脉冲电刺激持续时间60 min，每次实验刺激后猪自由活动时间为4-6 h，尽量消除相邻2次实验刺激的相互影响。每次实验刺激心电监护时间为150 min。每次实验刺激前均观察心电图正常、实验动物状态正常才开始实验刺激。

电压：选定脉冲电刺激基本参数，波宽为10 ms、频率为1 Hz。所用电压从5 V起始，每实验刺激1次递增5 V，直至最大电压100 V。每天每只猪实验刺激不超过3次。

频率：选定脉冲电刺激基本参数，波宽为10 ms、电压为35 V。脉冲电刺激频率从1 Hz起始，每实验刺激1次递增1 Hz，直至5 Hz，每天每只猪实验刺激不超过3次。

1.3 心电图监测用监护仪(深圳市金科威实业有限公司)持续观察心电图，将心电监护仪电极分别黏贴于猪左右胸前、心尖部(图1中A、B、C)，监护仪显示电压定标2 mV相当于5 mm，扫描速度200 mm/s，连续监测记录Ⅱ导联心电图信号。

具体记录内容：①实验前观察猪全天心率波动范围及心电图表现。②心率(次/min)：测量10个R-R间隔(r-r interphase)的平均值为一个心动周期的时间(s)，计算60 s内心动周期的个数，即为心率。未计算电刺激诱发的R波。③轻度心律失常：包括窦性心律不齐、窦性心动过速、室上性早搏、室性早搏。④刺激心律：脉冲电场刺激诱发的qRs波。⑤恶性心律失常：包括室性心动过速、室颤、室性逸搏、窦停。

1.4 大体观察 ①记录实验过程中呼吸改变、意识状态，呻吟、挣扎、躁动、嚎叫等。②观察刺激间歇期猪生活行为改变情况，以下标准判断：无异常，即进行电刺激前后无改变。轻度行为异常：电刺激后出现活动减少、进食减少、精神变差。重度行为异常：电刺激后出现活动明显减少、无进食、精神极差、生病等。衰竭、死亡。③脉冲电刺激局部皮肤有无发红、水肿、烧焦等现象。

1.5 主要观察指标猪的动态心电图变化、其不适反应和生活行为的变化。

1.6 统计学分析实验数据以x(_)±s表示，采用SPSS 19.0进行统计学分析，Pearson相关分析计算数据相关性，R值越接近于1或-1，相关度越强，相关系数越接近于0，相关度越弱。

讨论

电作为一种能量，可对生物组织产生明显的作用，在一定电场下带电粒子通过导体的运动称为电流。电荷从物体一点传导到另一点为一种能量转移，临床电刺激的这种能量可引起生理性变化。欧姆定律揭示了电压、电流和电阻之间的关系。同样，不同电刺激参数(电压、频率、持续时间、脉冲波形等)作用于生物组织所产生的病理生理变化差异较大^[23]，如电休克治疗。目前电休克治疗导致人体的一系列生理病理改变机制尚不明确，临床上观察到电休克治疗可引起心动过速，血压明显升高，心电图可表现为窦性心动过速、T波倒置、ST-T改变。电刺激治疗中电的能量对心脏电活动的影响尚且不明。本实验通过设置不同的电刺激参数刺激猪的肝区，寻找不影响心电活动的前提下脉冲电刺激所能使用最大的脉冲电压及频率。观察到脉冲电刺激电压35 V及低于3 V，脉冲电刺激频率1 Hz时，不会引起心律失常发生，脉冲电刺激亦不诱发形成qRs波。选择这样的参数对猪肝区刺激不干扰心电活动。本实验用大于35 V的脉冲电刺激，可引起实验猪多种心律失常发生，但无恶性心律失常发生。表明电能太大进行脉冲电刺激安全性会受到影响。电压为35 V，刺激频率大于1 Hz时，可引起实验猪心律失常发生。推测原因，虽然是安全电压但刺激太频，可提高机体对脉冲电刺激的敏感性，安全一样可受影响。经查阅相关文献，目前未见类似报道。分析其相关机制，考虑有：①通过某种神经源性效应。心脏受机体神经内分泌机制调节，其中神经调节占主导地位。Oppenheimer等^[24]通过刺激癫痫患者岛叶后引起动心率的增快和血压的增加，发现随着刺激的延长，出现进行性房室传导阻滞，室内传导阻滞，Q-T间期延长、S-T段降低、心室异位节律。王艺明等^[25]通过电刺激大鼠岛叶发现血压、心率、心率变异性发生显著改变，并提出心血管调节的高级中枢位于岛叶的观点，电刺激岛叶可引起心脏副交感神经活性降低，交感神经活性增强，引起脑源性心血管紊乱。吴子健等^[26-27]均发现体表电针刺激“内关”、“脾俞”穴位可引起动物交感神经活性增强，心率变异性增加。实验以一定电压或频率刺激猪后，出现心率增加、室性早搏、窦性心动过速、呼吸急促、烦躁、食欲下降等交感神经兴奋表现，结合文献，推测电刺激猪肝区是通过神经源性机制导致猪心电图及生活行为异常改变。②通过应激因素导致心律失常。另外，应激同样可以导致心律失常，如应激性心肌病。周矗等^[28-29]对乌鲁木齐“7•5事件”伤者临床心电图变化分析，发现事件组心率增快、QT间期、QTc间期指标显著异常，表明在急性心理应激状态下心脏调节功能存在障碍，导致心律失常。虽然本实验中对猪予以地西泮镇静，但在电压>60 V时猪出现明显烦躁不安、挣扎、甚至自残行为，故不能排除应激因素导致心律失常。③对心脏的直接电击作用。徐新萍等通过高压脉冲电流对家兔心脏直接电击，发现家兔心率增加，心电图呈心律不齐、心肌缺血、心房纤颤等改变，心肌细胞见肿胀、肌原纤维分离等改变，其损伤效应与电流强度有关^[30]。在一般情况下，国家规定的安全电压是24 V，大于40 V即有组织损伤的风险。本实验中在大于35 V时即出现心律失常，需考虑有电击伤导致心肌损害可能中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程