构建腰椎手术失败综合征大鼠模型及肾俞磁刺激治疗的可能机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.40.004

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (40): 6413-6417.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.40.004

• 器官移植动物模型 organ transplantation and animal model • 上一篇下一篇

构建腰椎手术失败综合征大鼠模型及肾俞磁刺激治疗的可能机制

吴峰¹，陈宣煌²，黄漫为¹，林海滨²，郑锦清¹

福建医科大学教学医院，南方医科大学附属莆田医院，莆田学院附属医院，1康复医学科，2骨科，福建省莆田市 351100

出版日期:2015-09-30 发布日期:2015-09-30
通讯作者: 黄漫为，主任医师，福建医科大学教学医院，南方医科大学附属莆田医院，莆田学院附属医院康复医学科，福建省莆田市 351100
作者简介:吴峰，男，1985年生，福建省莆田市人，汉族，2011年江西中医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事康复医学研究。
基金资助:
福建省莆田学院科研基金项目(2014029)；福建省莆田市科技计划课题(2013S03(5))

Construction of rat models of failed back surgery syndrome and the possible mechanisms of Shenshu magnetic stimulation therapy

Wu Feng¹, Chen Xuan-huang², Huang Man-wei¹, Lin Hai-bin², Zheng Jin-qing¹

1Department of Rehabilitation Medicine, 2Department of Orthopedics, Teaching Hospital of Fujian Medical University, Putian Hospital Affiliated to Southern Medical University, the Affiliated Hospital of Putian University, Putian 351100, Fujian Province, China

Online:2015-09-30 Published:2015-09-30
Contact: Huang Man-wei, Chief physician, Department of Rehabilitation Medicine, Teaching Hospital of Fujian Medical University, Putian Hospital Affiliated to Southern Medical University, the Affiliated Hospital of Putian University, Putian 351100, Fujian Province, China
About author:Wu Feng, Master, Attending physician, Department of Rehabilitation Medicine, Teaching Hospital of Fujian Medical University, Putian Hospital Affiliated to Southern Medical University, the Affiliated Hospital of Putian University, Putian 351100, Fujian Province, China
Supported by:
the Scientific Research Project of Putian University of Fujian Province of China, No. 2014029; Science and Technology Program of Putian city of China, No. 2013S03(5)

摘要/Abstract

摘要：

背景：腰椎手术失败综合征出现的重要原因是术后硬膜外瘢痕粘连，因此，探索预防腰椎术后硬膜外瘢痕粘连的方法一直是脊柱外科研究的热点。

目的：观察肾俞穴磁刺激疗法对腰椎手术失败综合征模型大鼠硬膜外粘连的作用。

方法：60只SD大鼠应用椎板切除法建立腰椎手术失败综合征模型，建模成功后均分为2组，肾俞磁疗组于造模后1周开始进行双侧肾俞穴磁刺激，1周治疗5 d，连续6周；空白对照组不干预。造模后13周取材，光镜下观察两组硬膜外瘢痕所占面积比，粘连范围大小，胶原纤维形成情况，并计数成纤维细胞数量；并比较两组瘢痕组织中羟脯氨酸含量及转化生长因子β1表达量。

结果与结论：肾俞磁刺激治疗后，模型大鼠硬膜外瘢痕形成少，仅少数成纤维细胞浸润，瘢痕羟脯氨酸含量与转化生长因子β1表达量少，与空白对照组比较差异有非常显著性意义(P < 0.001)。提示肾俞磁刺激疗法能明显减少腰椎术后硬膜外瘢痕形成，是其治疗腰椎手术失败综合征的可能机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 1；成纤维细胞

Abstract:

BACKGROUND: The important reason for failed back surgery syndrome is the postoperative epidural scar adhesions, therefore, exploring the methods of preventing postoperative lumbar epidural scar adhesions has always been a hot research in spine surgery field.

OBJECTIVE: To investigate the effect of Shenshu point magnetic stimulation therapy on epidural scar adhesions in rat models of failed back surgery syndrome.

METHODS: Sixty Sprague-Dawley rat models of failed back surgery syndrome were successfully established using the method of laminectomy, and then divided into Shenshu magnetic therapy group and blank control group. Beginning from 1 week after modeling, rats in the Shenshu magnetic therapy group were subjected to bilateral Shenshu magnetic stimulation for 6 weeks, 5 days of treatment per week. Rats in the blank control group were not given any intervention. At 13 weeks after modeling, rats were harvested and the area ratio of epidural scars, range of adhesions and formation of collagen fibers were observed under light microscope. Fibroblasts were counted. Hydroxyproline content and transforming growth factor β1 expression in scar tissue were compared between these two groups.

RESULTS AND CONCLUSION: After Shenshu magnetic stimulation therapy, epidural scar tissue was reduced,a few fibroblasts infiltrated and hydroxyproline content and transforming growth factor β1 expression in the epidural scar tissue were decreased. There were very significant differences about these indices between Shenshu magnetic therapy and blank control groups (P < 0.001). These results suggest that Shenshu magnetic stimulation therapy can significantly reduce postoperative lumbar epidural scar formation, which is the possible mechanism in the treatment of failed back surgery syndrome.

Key words: Failed Back Surgery Syndrome, Postoperative Complications, Magnetic Field Therapy, Models, Animal

中图分类号:

R318

吴峰，陈宣煌，黄漫为，林海滨，郑锦清. 构建腰椎手术失败综合征大鼠模型及肾俞磁刺激治疗的可能机制[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(40): 6413-6417.

Wu Feng, Chen Xuan-huang, Huang Man-wei, Lin Hai-bin, Zheng Jin-qing. Construction of rat models of failed back surgery syndrome and the possible mechanisms of Shenshu magnetic stimulation therapy[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(40): 6413-6417.

图/表（结果） 3

2.1 造模成功动物数量及过程 60只SD大鼠均造模成功，全部进入结果分析，无脱失。造模流程图见图1。

2.2 模型稳定性因为椎板切除后主要是通过纤维结缔组织增生和瘢痕形成来完成局部缺损的修复，所以发生腰椎手术失败综合征的最根本原因是硬膜外瘢痕的粘连。本实验采用椎板切除法制备腰椎手术失败综合征大鼠模型，模拟人类椎板部分切除术，造模成功后硬膜外瘢痕形成，大量纤维细胞浸润，瘢痕组织中羟脯氨酸含量增高，与人类腰椎手术失败综合征非常相似。而且该模型成模率高(100%)，模型稳定，所有大鼠术后平稳恢复，没有出现伤口感染、神经损伤等术后并发症。 2.3 肾俞磁疗对腰椎手术失败综合征模型大鼠瘢痕粘连的影响两组造模段脊椎标本行苏木精-伊红染色后光镜观察瘢痕所占面积比，粘连范围大小，胶原纤维形成情况。与空白对照组比，肾俞磁疗组硬膜外瘢痕形成少，粘连范围小，胶原纤维稀疏，改良Nussbaum 标准评分低(P < 0.001)，见表1，图2。说明肾俞磁疗能改善腰椎手术失败综合征模型大鼠硬膜外瘢痕粘连情况。

2.4 肾俞磁疗对腰椎手术失败综合征模型大鼠手术区域成纤维细胞数量的影响取两组造模段脊椎标本，切片后应用Image-ProPlus图像分析软件观察计数，可见肾俞磁疗组标本手术区域仅少数成纤维细胞浸润，空白对照组可见大量成纤维细胞浸润，两组成纤维细胞计数比较差异有非常显著性意义(P < 0.001)，见表1，图3。说明肾俞磁疗能减少腰椎手术失败综合征模型大鼠手术区域成纤维细胞浸润数量。 2.5 肾俞磁疗对腰椎手术失败综合征模型大鼠瘢痕组织中羟脯氨酸含量的影响羟脯氨酸含量是纤维瘢痕生长测量的重要指标。实验结果显示，肾俞磁疗组瘢痕羟脯氨酸含量低于空白对照组(P < 0.001)，见表1，图4。说明肾俞磁疗能降低腰椎手术失败综合征模型大鼠瘢痕羟脯氨酸含量，进而减少腰椎术后硬膜外瘢痕形成，是其治疗腰椎手术失败综合征的可能机制。 2.6 肾俞磁疗对腰椎手术失败综合征模型大鼠瘢痕组织中转化生长因子β1表达的影响调控转化生长因子β表达是预防硬膜外瘢痕粘连的新方向。结果显示，肾俞磁疗组瘢痕组织中转化生长因子β1阳性细胞数量低于空白对照组(P < 0.001)，见表1，图5。说明肾俞磁疗能降低腰椎手术失败综合征模型大鼠瘢痕组织中转化生长因子β1表达。

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引言

腰椎手术失败综合征(failed back surgery syndrome，FBSS)出现的重要原因是术后硬膜外瘢痕粘连^[1-2]，无论传统手术还是微创手术，腰椎术后都面临硬膜外瘢痕粘连的问题，严重影响了患者的预后和手术的效果。腰椎手术失败综合征再次手术难度大，保守治疗效果不佳，引起越来越多研究者的重视，成为当今脊柱外科的一大难题。因此，探索预防腰椎术后硬膜外瘢痕粘连的方法一直是脊柱外科医生研究的热点^[3-4]。目前预防腰椎术后硬膜外瘢痕粘连的方法有多种，而目前最热点的是应用各种药物和/或各种可吸收或不可吸收生物材料来减少术后粘连的形成。刘军^[5]设计将抑制粘连形成效果较好的丝裂霉素与可吸收的膜性材料聚乳酸结合制成缓释控制释放系统，并通过体外细胞凋亡实验证实该丝裂霉素聚乳酸控释膜具有有效抗成纤维细胞增殖的作用，通过SD大鼠椎板切除术后模型验证该控释系统在动物体内实验中能有效预防硬膜与周围组织粘连并无明显毒副作用。张科峰^[6]报道可吸收PLGA膜可明显减少新西兰兔椎板切除术后硬膜外纤维瘢痕形成及其与硬膜的粘连，而明胶海绵的预防粘连效果差。朱亮^[7]采用薄膜-超声分散法制备羟基喜树碱脂质体，然后将其应用在新西兰兔L₅椎板切除模型中，4周后取材，观察硬膜外瘢痕分布，成纤维细胞、炎症细胞分布情况以及粘连程度，结果显示羟基喜树碱脂质体抑制了硬膜外瘢痕的形成，有较好的防粘连效果。除了以上防粘连方法以外，中医中药及一些物理方法都被证明对于预防硬膜外瘢痕增生和粘连有效。张伟等^[8]实验发现察姜黄能减少大鼠椎板切除术后硬膜外瘢痕生成，抑制胶原纤维的形成。周辉等^[9]应用临床验方活血止痛汤干预椎板切除术后的大鼠模型，发现其能通过下调转化生长因子β1和转化生长因子β2基因的表达，减少成纤维细胞增殖和肢原等细胞外基质的沉积，达到预防硬膜外瘢痕增生、粘连的效果。王玉光等^[10]报道了金银花的有效药理成分之一绿原酸可以抑制成纤维细胞增殖，同时能降低白细胞介素6 和转化生长因子β1的表达，防止硬膜外瘢痕粘连。还有一些作者报道了当归、黄芪、三七凝胶均能预防腰椎术后硬膜外粘连^[11-13]。穴位刺激是传统中医常用的方法，随着科学技术的不断发展，许多新的物理因子被逐渐应用到穴位刺激疗法中，除了传统的热(艾灸)外，穴位磁刺激、声波刺激、激光刺激、电刺激疗法等均有很多报道，证实这些物理因子具有缓解疼痛疲劳、辅助治疗腰椎间盘突出症、保护机体缺血再灌注损伤等功能^[14-16]。本实验应用肾俞穴磁刺激疗法，观察其对腰椎手术失败综合征模型大鼠硬膜外粘连的作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

材料方法

1.1 造模动物及材料选择SD大鼠60只，雌雄不限，体质量200-250 g。由上海医用动物实验中心提供，合格证：SCXK(沪)2002-0011。分笼标准饲养，不限量供给颗粒饲料、自来水，补充2次/d，观察3 d后正式开始实验。

1.2 造模方法采取随机抽样方法将动物随机分为肾俞磁疗组、空白对照组两组，每组30只。

所有SD大鼠应用10%水合氯醛(3.5 μL/g)腹腔注射麻醉，以俯卧位固定，剔光背部鼠毛，无菌消毒条件下取背部正中切口，术中仔细分离，找到L₃-L₅棘间，切断棘上、棘间韧带，向两侧剥离椎旁肌，咬骨钳咬断L₃、L₅棘突及椎板，尽量修平椎板边缘，减压范围为8 mm×3 mm，暴露硬脊膜。去除硬膜外脂肪，锐性划伤硬膜前侧方纤维环，保留L₄棘突及椎板以分割术野，局部轻压止血，生理盐水反复冲洗切口，清除切口内所有可见的碎骨片和失活组织、棉絮状物，彻底止血后分别给予不同的处理，逐层缝合肌肉筋膜和皮肤。

术后处理：彻底止血，冲洗切口，用7^＃丝线在所手术椎间隙对侧给予缝合打结，以作标记，逐层缝合切口。动物麻醉苏醒后于同一条件下饲养，术后肌肉注射青霉素3 d (40×10⁴ U/kg)，1次/d，术后7 d内每天用络合碘消毒手术切口一次，并且随时注意观察动物的一般情况及动物术后呼吸、心律有无异常改变，四肢活动情况，饮食、尿便情况，以及背部手术切口有无感染及脑脊液漏的发生。

1.3 造模成功检测标准造模后取材，取造模段脊椎，大体观察可见瘢痕形成，硬膜粘连；组织学观察可见大量瘢痕组织与腰背筋膜、肌肉相连，与硬膜紧密粘连难以分离，镜下可见大量成纤维细胞、胶原组织增生。

1.4 磁疗干预方法肾俞磁疗组造模后1周进行肾俞磁疗法处理6周。具体方法为：对大鼠双侧肾俞穴进行磁珠贴压，以医用胶布将医用耳穴定向磁珠固定在大鼠双侧肾俞穴，N极朝上，施术者以60次/min的频率按压贴磁侧肾俞穴5 min，每天上、下午各按压1次，每周连续5次。磁珠规格：直径 1.6 mm，含磁量10 mT。空白对照组造模后不做干预。

1.5 检测指标于造模后13周用空气栓塞法处死SD大鼠，按原切口进入，切开背部皮肤，按照术中标记，确定手术椎间隙，取造模段脊椎，包含椎旁肌肉组织，将每个手术椎间隙作为一段，立即用体积分数4%甲醛溶液固定。

1.5.1 光镜观察将标本用乙醇逐级脱水，石蜡包埋，做横切片，厚度为10 µm，行苏木精-伊红染色后光镜观察瘢痕所占面积比，粘连范围大小，胶原纤维形成情况，按改良Nussbaum 标准给予组织学评分。

改良Nussbaum 标准评分标准：
评分	标准
	硬膜粘连面积	胶原纤维	瘢痕延伸
0分	< 25%	硬膜外胶原稀疏	瘢痕和充填物无明显的侧方及后方延伸
0.5分	25%-50%	胶原较致密	瘢痕侧方伸延达神经与椎板缺损之间，或部分嵌入椎板缺损，但未压迫硬膜囊
1.0分	> 50%	硬膜外胶原致密	瘢痕包绕或伸达一侧或双侧神经根，或瘢痕嵌入椎管，硬膜囊或脊髓受压变形

1.5.2 成纤维细胞计数应用Image-ProPlus图像分析软件分析切片。每标本计数3个不同的视野，1个位于中央，2个位于边缘。且由一位不知实验过程及实验原理的病理医师计数。

1.5.3 羟脯氨酸含量测定组织漂洗、烘干，称质量，按干粉10 mg/mL比例加入6 mol/L盐酸，在105 ℃高温下水解 10 h，吸取水解液0.1 mL，滴入酚酞指示剂，并加入6 mol/L NaOH 0.3 mL中和盐酸，按羟脯氨酸标本盒方法测试。

1.5.4 转化生长因子β1表达的观察常规切片，切片按常规ABC法进行转化生长因子β1免疫组化染色。常规固定、晾干、PBS冲洗；体积分数5%-10%正常山羊血清封闭；滴加兔抗人转化生长因子β1多克隆抗体(抗体滴度为1∶200，4 ℃过夜)；1%BSA-PBS稀释的生物素标记二抗(37 ℃孵育30 min)；PBS 稀释的辣根酶标记链霉卵白素(37 ℃孵育30 min)；DAB显色剂显色；苏木精复染；中性树胶封固。最后用PAS-9000病理图像分析仪观察转化生长因子β1染色阳性细胞数。

1.6 统计学分析两样本均数的比较采用两独立样本均数的t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。使用SPSS 21.0软件包完成所有统计分析。

讨论

腰椎术后硬膜外瘢痕组织的形成是硬膜外腔手术后自我修复一个必然的过程，是机体对手术的正常反应。硬膜外腔术后造成的局部损伤，是通过纤维组织增生来修复，而不是解剖结构的再生，当正常的硬膜外脂肪被纤维组织所替代，就会发生硬膜外瘢痕组织的粘连。硬膜外腔的手术操作造成的局部创伤是术后纤维性瘢痕形成的直接因素，手术操作粗暴可加重粘连的形成，这一点已被学者所公认。各种动物实验及临床研究表明，粘连量的多少还受多种因素的影响，术后局部出血、血肿形成一直被认为是一个重要的因素。血肿可导致成纤维细胞趋化聚集等，导致纤维性瘢痕组织扩展到椎管内^[17-18]。Larocca等^[19]认为血肿内的转化生长因子β、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子均能使纤维组织增生导致粘连。Songer等^[20]认为血肿是瘢痕形成的起始阶段，减少血肿形成才能有效减少瘢痕的形成。也有学者提出髓核内化学物质引起的局部炎性反应也是瘢痕形成的关键^[21]。此外，手术所造成的硬脊膜的撕裂，手术过程中所留下的软组织、骨组织碎屑以及线头等异物均能加重硬膜外瘢痕组织的形成。Einhuas等^[17]认为手术技巧、脊柱解剖部位、去除骨质的多少、出血程度，以及实验动物的种类等都会对硬膜外瘢痕的形成产生影响。还有研究表明与肥胖、吸烟、血清中高水平的三酰甘油酯、γ-谷氨酰转肽酶与纤维蛋白溶解活性降低有关，后者可增加硬膜外的瘢痕形成^[22]。腰椎手术失败综合征越来越引起众多学者的重视，也使他们认识到初次手术的重要性。曾采用过自体游离脂肪移植、生物蛋白胶等多种方法预防术后粘连，效果均不理想^[23]。在熟悉解剖结构、熟练手术操作、动作细心微创之外，术后的康复治疗也至关重要，比如本文研究的磁刺激疗法。磁刺激疗法在基础研究及临床试验中应用较多的是经颅磁刺激，主要用于镇痛和一些脑、神经疾病，比如偏瘫、幼儿智力低下及抑郁等^[24-26]，未见应用于腰椎术后硬膜外瘢痕粘连的治疗康复者。本实验首先应用椎板切除法建立腰椎手术失败综合征大鼠模型，并应用磁刺激肾俞穴的方法进行治疗，结果发现肾俞磁刺激6周后，模型大鼠硬膜外瘢痕形成少，仅少数成纤维细胞浸润，瘢痕羟脯氨酸含量与转化生长因子β1表达量少，与空白对照组比较差异有非常显著性意义(P < 0.001)，提示肾俞磁刺激疗法能明显减少腰椎术后硬膜外瘢痕形成，是其治疗腰椎手术失败综合征的可能机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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