聚L-乳酸合成新型烧伤材料的生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.34.014

摘要/Abstract

摘要：

背景：最近有研究表明，高分子聚合物聚L-乳酸具有很好的生物相容性，可直接参与人体代谢且无任何不良反应，是一种可用作生物支架的高分子材料。

目的：验证高分子聚合物聚L-乳酸的生物相容性。

方法：检测胶原复合物及聚L-乳酸的吸湿性能。分别以正常HDMEM培养基、HDMEM培养基+二甲基亚砜、HDMEM培养基+胶原复合物浸提液、HDMEM培养基+聚L-乳酸浸提液培养C3H10T1/2细胞，72 h后观察细胞形态变化。MTT法检测聚L-乳酸浸提液、二甲基亚砜、胶原复合物浸提液对C3H10T1/2细胞的毒性。在兔血中分别加入生理盐水、蒸馏水、聚L-乳酸浸提液及胶原复合物浸提液，检测溶血度。通过兔耳缘静脉分别注射生理盐水、聚L-乳酸浸提液、二甲基亚砜及胶原复合物浸提液，观察过敏反应、热源反应。将胶原复合物及聚L-乳酸分别植入兔背部皮下，4周后检测血清中炎性因子白细胞介素10和白细胞介素23的水平。

结果与结论：胶原复合材料单位质量和单位面积的吸湿率均明显低于聚L-乳酸材料(P < 0.05)。在聚L-乳酸浸提液中培养的C3H10T1/2细胞生长状态良好，细胞相对增殖率高，材料毒性为1级；聚L-乳酸材料溶血率较低，无过敏反应及热源反应，植入体内后的炎症反应低于胶原复合材料(P < 0.05)。证实聚L-乳酸新型皮肤烧伤支架材料具有良好的吸收伤口液体性能及生物相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 胶原复合材料, 聚L-乳酸合成材料, 皮肤支架, 生物相容性

Abstract:

BACKGROUND: Recent studies have shown that poly-L-lactic acid (PLLA) polymer has good biocompatibility and can be directly involved in human metabolism without any side effects, which is a polymer material that can be used as bioscaffolds.

OBJECTIVE: To explore the biocompatibility of PLLA.

METHODS: The moisture absorption rate of collagen composite and PLLA was detected. Cell morphology observation was carried to detect the growth state of C3H10T1/2 cells that grew in normal HDMEM medium, HDMEM medium+dimethyl sulfoxide, HDMEM medium+collagen composite extract, HDMEM medium+PLLA extract for 72 hours. MTT kit was used to detect the relative proliferation rate of the C3H10T1/2 cell lines that grew in the above-mentioned media and the toxicity evaluations were based on the material toxicity criteria. Hemolysis degree was measured in rabbit blood samples containing normal saline, distilled water, PLLA extract and collagen composite extract. The allergic reaction and pyrogen reaction in rabbits were observed through injection of normal saline, distilled water, PLLA extract and collagen composite extract via the ear vein. Collagen composite and PLLA were respectively implanted subcutaneously into the rabbits, and after 4 weeks, the levels of interleukin-10 and interleukin 23 in serum were detected.

RESULTS AND CONCLUSION: The moisture absorption rates per unit area and per unit mass of collagen composite material were lower than those of PLLA synthetic materials (P < 0.05). C3H10T1/2 cells grew well in the PLLA extract, with a higher relative growth rate and lower cytotoxicity (grade I). Compared with the collagen composite materials, the PLLA synthetic materials had a lower hemolysis ratio and less inflammatory reactions (P < 0.05); and there were no allergic reaction and pyrogen reaction. These findings indicate that the PLLA scaffold materials for burned skin have good absorbing fluid performance and biocompatibility.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Collagen, Materials Testing, Biocompatible Materials

中图分类号:

R318

邓立欢. 聚L-乳酸合成新型烧伤材料的生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(34): 5480-5484.

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图/表（结果） 6

2.1 两种材料吸湿性能的比较由吸湿率测定实验结果可知，胶原复合材料单位质量和单位面积的吸湿率均明显低于聚L-乳酸材料(P < 0.05)，见表1。

2.2 两种材料细胞培养与形态学观察由细胞形态学观察结果可知，与空白对照组相比，在C3H10T1/2细胞培养皿中加入两种皮肤支架材料浸提液48 h后，细胞生长速度明显减慢，偶见细胞悬浮死亡；与阳性对照组相比，两种材料浸提液所培养的细胞生长状态良好，两种材料之间细胞生长状态无明显差别(图1)。

2.3 两种材料对细胞相对增殖率的影响及相应的毒性等级由MTT法结果可知，培养2 d后，两种浸提液所培养的细胞相对增殖率较空白对照组明显减弱，较阳性对照组明显增加(P < 0.05)；两种材料的毒性测试均属于合格，但胶原复合物浸提液组细胞相对增殖率低于聚L-乳酸浸提液组(P < 0.05)，毒性反应高于聚L-乳酸浸提液组，见表2。

2.4 两种材料溶血率的比较两种材料对兔血的溶血率均在合格范围，但均高于阴性对照组(P < 0.05)，明显低于阳性对照组(P < 0.05)，其中胶原复合物浸提液组溶血率高于聚L-乳酸浸提液组(P < 0.05)，见表3。

2.5 两种材料浸提液的过敏反应及热源反应实验统计结果显示，阴性对照组未出现任何过敏反应、热源反应及死亡情况；阳性对照组中5只出现过敏反应、5只出现热源反应、4只死亡；胶原复合物浸提液组有3只出现过敏反应，无热源反应和死亡现象；聚L-乳酸浸提液组仅有1只出现过敏反应，无热源反应和死亡现象，见表4。

2.6 ELISA检测血清中炎性因子的表达由ELISA实验结果可知，在兔背部植入两种材料4周后，其血清中炎性因子白细胞介素10和白细胞介素23的水平明显增高，但植入聚L-乳酸组的炎性因子表达量明显低于植入胶原复合物组(P < 0.05)，见表5。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2014年1月1日至2015年2月1日在惠州市第三人民医院完成。

材料：胶原复合材料皮肤支架、聚L-乳酸皮肤支架购于山东福瑞达医疗器械有限公司；吸湿率测定A溶液：氯化钠、无水氯化钙购于连云港冠苏实业有限公司；C3H10T1/2细胞系、HDMEM、胎牛血清购于赛佰慷生物技术股份有限公司；青霉素、链霉素双抗购于上海伟进生物科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO)购于连云港冠苏实业有限公司；MTT试剂盒购于上海博谷生物科技有限公司；酶标仪购于美国伯腾仪器有限公司。

实验动物：8周龄雌性新西兰白兔40只，体质量 1 500-1 800 g，购于杭州临安鸿基兔业，许可证号：浙ICP备05018365。

实验方法：

两种材料体外吸湿性能的测定：将8.3 g NaCl和 0.277 g CaCl₂溶于1 L双蒸水中配置成A溶液。将胶原复合物和聚L-乳酸两种材料剪成4 cm×4 cm的大小置于室温 24 h，24 h后称质量记录为初始质量(m)，称取20 g A溶液，将两材料分别与20 g A溶液置于2个中皿里，于37 ℃放置 30 min，随后用镊子分别夹住两种材料的一角悬空30 s，称取此时材料的湿质量(m₁)。单位质量材料的吸湿率= (m₁-m)/m，单位面积材料的吸湿率=4×(m₁-m)/100^[17]。

细胞培养与形态学观察：将胶原复合物和聚L-乳酸各减下30 mm长度，用PBS冲洗3次，放入紫外操作台中照射6 h；然后置于60 mm培养皿中，加入2 mL培养基HDMEM，于体积分数5%二氧化碳、37 ℃培养箱中培养24 h，获得浸提液。培养细胞时，将C3H10T1/2细胞以2×10⁸L^-¹的细胞浓度接种于35 mm小皿中，分别用正常HDMEM培养基(空白对照组)、HDMEM+二甲基亚砜(阳性对照组)、HDMEM+胶原复合物浸提液、HDMEM+聚L-乳酸浸提液各2 mL，培养细胞72 h后观察细胞形态学变化^[18]。

MTT法检测细胞毒性：将胶原复合物和聚L-乳酸支架合成材料各减下30 mm长度，用PBS冲洗3次，放入紫外操作台中照射6 h；分别置于60 mm培养皿中，加入2 mL培养基M199，于体积分数5%二氧化碳、37 ℃的培养箱中培养24 h，获得浸提液。将C3H10T1/2细胞以5×10⁶ L^-1的浓度铺于96孔板上，加入获取的两材料浸提液(每孔加入 200 µL)、二甲基亚砜溶液(阳性对照组)培养48 h后，在96孔板中加入MTT稀释溶液各20 µL，继续放入培养箱中培养3 h后终止，在酶标仪450 nm处读取各孔的吸光度。空白对照组直接加入2 mL正常培养基培养，计算细胞的相对增殖率RGR=实验组吸光度/空白对照组吸光度×100%^[19]。当细胞相对增殖率在100%及以上，毒性为0级(合格)；当细胞相对增殖率在75%-99%，毒性为1级(合格)；当细胞相对增殖率在50%-74%之间，毒性为2级(待定)；当细胞相对增殖率在25%-49%之间，毒性为3级(不合格)；当细胞相对增殖率在1%-24%，毒性为4级(不合格)^[20]。

两种材料溶血度的测定：分别取8 mL生理盐水(阴性对照)、8 mL蒸馏水(阳性对照)、8 mL胶原复合材料浸提液与8 mL 聚L-乳酸浸提液，将4组液体置于离心管中，于37 ℃水浴锅中放置30 min，将新鲜的兔血(新西兰白兔耳缘静脉取血)0.5 mL分别滴入4个离心管中，混匀，再次将离心管置于37 ℃水浴锅中1 h，放入高速离心机中离心 (2 000 r/min离心8 min)，吸出上清液，分别取200 µL上清液加入96孔板中，在酶标仪545 nm处读取各孔的吸光度。溶血度计算公式=(实验组A值-阴性对照组A值)/(阳性对照组A值-阴性对照组A值)×100%^[21]。溶血度< 2%为合格。

两种材料浸提液的过敏及热源反应：将20只新西兰兔随机均分为4组，分别对兔进行耳缘静脉注射生理盐水(阴性对照)、二甲基亚砜(阳性对照)、胶原复合材料浸提液、聚L-乳酸浸提液，注射剂量为5 mL/kg，连续注射5 d，每天1次。过敏反应表现为：呼吸急促、爬伏、软瘫、尿便失禁等；热源反应表现为：发热，体温迅速升高至41 ℃以上。

体内植入实验：将18只新西兰兔随机均分为3组，分别于背部皮下植入胶原复合材料与聚L-乳酸材料，以未植入任何材料的为空白对照，植入后4周处死动物，采用ELISA法检测血清中炎性因子白细胞介素10和白细胞介素23的水平。

主要观察指标：聚L-乳酸的生物相容性。

统计学分析：采用SPSS 19.0统计软件分析，计量数据以x(_)±s表示，计数资料采用χ²检验，计量资料采用t 检验，各组别之间的计量资料比较采用单因素方差分析，以 P < 0.05或P < 0.01表示差异有显著性意义。

讨论

烧伤也称灼伤，是由于热力或化学物质作用于身体引起的局部组织损伤，并通过受损的皮肤、黏膜组织导致全身病理生理改变^[22]。重度灼伤会伤及皮下组织如肌肉、骨骼等，也称为毁损性灼伤，修复难度大，恢复时间长^[23-25]。灼伤后人造皮肤的应用可以保护创面，减轻炎症反应，有助于皮肤自身的恢复^[26-27]。目前临床上主要采用的人工皮肤支架材料主要是胶原复合物，可诱导组织产生再生膜，同时有保护和清洁创面的作用^[28]。最近有研究表明，高分子聚合物聚L-乳酸具有很好的生物相容性，能与哺乳动物相融，可直接参与人体代谢且无任何不良反应，是一种可用作生物支架的高分子材料^[29-30]。因此，本实验对比胶原复合物和新型高分子合成材料聚L-乳酸的体外吸湿性能、细胞毒性、溶血度、过敏反应、热源反应及致死率，为临床上引入新型烧伤皮肤支架材料提供一定的科学依据。研究结果显示，胶原复合材料的单位质量和单位面积的吸湿率均明显低于聚L-乳酸材料(P < 0.05)，这说明聚L-乳酸有更好吸收创面渗出液的性能，减少了发生细菌感染的概率；在C3H10T1/2细胞培养皿中加入两种皮肤支架材料浸提液后，与空白对照组相比，细胞生长速度明显减慢，偶见细胞悬浮死亡，与阳性对照组相比，两种材料浸提液所培养的细胞生长状态良好，两种材料之间细胞生长状态无明显差别(P > 0.05)，说明聚L-乳酸对细胞生长状态的不良影响是在可控制范围内的；两种浸提液所培养的细胞相对增殖率较空白对照组明显减弱，较阳性对照组明显增加(P < 0.05)；两种材料的毒性测试均属于合格，但胶原复合组细胞相对增殖率低于聚L-乳酸组，毒性反应高于聚L-乳酸组(P < 0.05)，这说明聚L-乳酸的细胞毒性更低，是植入体内的优良选择；两种材料对兔血的溶血率均在合格范围，但均高于阴性对照组，明显低于阳性对照组(P < 0.05)；其中胶原复合组溶血率高于聚L-乳酸组(P < 0.05)，溶血反应是一个可能危及患者生命的过程，因此，使用聚L-乳酸作为植入材料能有效降低溶血反应的发生。同时，聚L-乳酸导致兔过敏、热源、死亡的发生率都很低，是一种很安全的烧伤支架材料。以上研究表明，聚L-乳酸是具有优良抑菌及抗霉特性的生物可降解塑料。一般的生物降解性塑料，细菌和霉菌等微生物处于容易附生的倾向。聚乳酸中含有极微量的乳酸或低聚物，这些物质在材料表面浸出一部分，将材料表面与人的肌肤同样保持弱碱性，防止了细菌和霉菌等微生物的附着和繁殖。同时，聚L-乳酸的水解过程是可以控制的。综上所述，聚L-乳酸新型皮肤烧伤支架材料具有良好的吸收伤口液体性能，细胞毒性降低，溶血反应发生概率低，还能减少组织对于材料的过敏反应、热源反应，具有比胶原复合材料更好的生物相容性，本研究为聚L-乳酸在临床上的广泛应用提供了一定的参考价值。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程