腰椎髓核组织中缺氧诱导因子1α的表达：与凋亡率正相关

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.33.007

摘要/Abstract

摘要：

背景：缺氧诱导因子1α在缺氧的环境下对细胞凋亡起着双重调控作用。缺氧的严重程度决定细胞是出现凋亡还是适应缺氧生存。当细胞暴露于慢性或极度缺氧时由缺氧诱导因子1α引起的保护机制不足而发生凋亡。
目的：观察缺氧诱导因子1α和凋亡在人不同突出类型腰椎髓核组织中的表达，判断两者有无相关性。
方法：腰椎髓核组织标本取自腰椎间盘突出症行腰椎后路椎板开窗髓核摘除患者60例，41例取自L4-5髓核组织，19例取自L5-S1髓核组织。将髓核组织分为突出组、游离组各30例，同时选取腰椎骨折脱位患者腰椎髓核组织标本10例作为对照组。采用免疫组织化学技术，观察各组突出腰椎髓核组织缺氧诱导因子1α的表达；采用Tunel技术，观察不同突出类型腰椎髓核细胞凋亡程度；分析各组髓核组织缺氧诱导因子1α的表达与髓核细胞凋亡率有无相关性。
结果与结论：游离组、突出组和对照组都可观察到缺氧诱导因子1α的表达，游离组缺氧诱导因子1α在髓核的表达显著高于突出组和对照组(P < 0.01)。3组都可观察到髓核细胞的凋亡，游离组髓核细胞凋亡的表达显著高于突出型和对照组(P < 0.01)。髓核细胞缺氧诱导因子1α表达和凋亡呈正相关(P < 0.01)。结果提示，腰椎间盘突出症髓核组织中缺氧诱导因子1α的表达与突出类型有关，在脱垂游离型中表达最高。腰椎髓核组织中缺氧诱导因子1α的表达与凋亡率呈正相关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 髓核, 腰椎, 缺氧诱导因子1α, 凋亡

Abstract:

BACKGROUND: Under hypoxic environment, hypoxia-inducible factor 1α plays a dual regulatory role in cell apoptosis. Severity of hypoxia is the key to determine whether cells appear to have apoptosis or adapt to survive. When the cells are exposed to chronic or extreme hypoxia, a lack of protection mechanisms from hypoxia-inducible factor-1α can induce cell apoptosis.
OBJECTIVE: To research the expression of hypoxia-inducible factor 1α in human lumbar nucleus pulposus of different herniated types and its relationships with cell apoptosis.
METHODS: The nucleus pulposus was harvested from 60 cases of herniation of lumbar intervertebral discs, L4-5 in 41 cases and L5-S1 in 19 cases. The nucleus pulposus tissues were equally divided into protruded and sequestered groups. Meanwhile, the nucleus pulposus tissues from another 10 cases of lumbar spine fracture were taken as control group. Expression of hypoxia-inducible factor 1α and apoptosis of lumbar nucleus pulposus cells were observed and detected with immunohistochemical technique and TUNEL method. Correlation of hypoxia-inducible factor 1α and apoptosis in human lumbar nucleus pulposus of different herniated types was analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: The expression of hypoxia-inducible factor 1α was visualized in each case, but it was significantly higher in the sequestered group than in the protruded group and control group (P < 0.01). Apoptosis of nucleus pulposus cells were found in all the three groups, but the apoptotic rate was also higher in the sequestered group than in the protruded group and control group (P < 0.01). Expression of hypoxia-inducible factor 1α was positively correlated with cell apoptosis in human lumbar nucleus pulposus (P < 0.01). Overall, the expression of hypoxia-inducible factor 1α in degenerative human lumbar nucleus pulposus is associated with herniated types, which is the highest in the sequestered type. The relationship between hypoxia-inducible factor 1α and apoptosis is positive.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: 组织构建, 组织工程, 髓核, 腰椎, 缺氧诱导因子1α, 凋亡

中图分类号:

R318

刘兴振，金文杰，沈康平，傅智轶，吴玉杰. 腰椎髓核组织中缺氧诱导因子1α的表达：与凋亡率正相关[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(33): 5279-5283.

Liu Xing-zhen, Jin Wen-jie, Shen Kang-ping, Fu Zhi-yi, Wu Yu-jie. Expression of hypoxia-inducible factor 1 alpha and its relationship to apoptosis in human lumbar nucleus pulposus[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(33): 5279-5283.

图/表（结果） 1

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引言

材料方法

设计：分组对照观察。

时间及地点：实验于2010年1月至2014年2月在上海交通大学医学院附属第三人民医院完成。

材料：

腰椎髓核组织中缺氧诱导因子1α的表达实验器械与试剂：
器械与试剂	来源
微升微量进样器	上海安亭微量进样器厂
石蜡切片机，光学显微镜，OLYMPUS IX51型倒置荧光显微镜	上海交通大学附属第三人民医院病理科、实验中心提供。
商品化的小鼠抗人单克隆抗体缺氧诱导因子1α(即用型)、二抗(羊抗小鼠，即用型)、二氨基联苯胺溶液(DAB显色剂)	SANTA CRUZ BIOTECHOLOGY
枸橼酸溶液(即用型)、PBS溶液(即用型)	上海长岛生物技术有限公司，中国
TUNEL试剂盒	德国默克公司

髓核组织标本：髓核组织标本选自本院2010年1月至2014年2月腰椎间盘突出症患者60例，其中男34例，女26例，年龄20-71岁，平均年龄52.0岁，41例取自L₄_-5髓核组织，19例取自L₅-S₁。手术方法均为腰椎后路椎板开窗髓核摘除。根据突出类型将髓核组织分为突出组、游离组各30例，同时选取腰椎骨折脱位患者的腰椎髓核组织标本10例作为对照组，男9例，女1例，年龄27-55岁，平均年龄为40.0岁。所有患者均知情同意。

诊断标准：采用1983年Mcculoch制定的标准，即：①腿痛大于腰痛。②神经支配区的感觉减退。③直腿抬高小于正常的50%。④腱反射异常。⑤加强试验阳性。并经X射线、CT和MRI证实。

纳入标准：①符合腰椎间盘突出症的诊断标准。②采用腰椎后路椎板开窗髓核摘除术者。③患者对治疗均知情同意。

排除标准：①有腰椎管狭窄及其他退行性疾病。②慢性呼吸系统疾病、糖尿病、贫血等缺血缺氧性疾病除外。

方法：

标本处理：将手术取出的髓核组织，体积分数4%甲醛溶液固定，石蜡包埋。每个髓核标本4 μm连续贴邻切片共4张，2张用于缺氧诱导因子1α免疫组织化学染色。2张采用脱氧核糖核苷酸末端转移介导的缺口末端标记法(TUNEL)对髓核组织切片进行免疫组织化学染色。所有检测对象都经过患者本人同意。

髓核组织切片缺氧诱导因子1α染色：髓核标本二甲苯脱蜡。乙醇梯度水化。体积分数3% H₂O₂溶液，30 min，封闭内源性过氧化物酶。切片浸入枸橼酸溶液中，微波加热，15 min，抗原修复。室温下冷区，PBS冲洗3遍，5 min/次。单克隆抗体缺氧诱导因子1α，50 μL，室温下1 h。PBS冲洗3遍，5 min/次。二抗，50 μL，室温下1 h。PBS冲洗 3遍，5 min/次。DAB溶液染色，显微镜观察后中止染色。室温水冲洗，5 min。苏木精复染5 min，标记细胞核。乙

醇分化，10 s，去除非特异性染色。室温水冲洗，5 min。乙醇梯度脱水。二甲苯溶液增强切片透光度。干燥后封固。

TUNEL法观察髓核细胞凋亡：根据TUNEL原位末端标记检测试剂盒操作说明进行实验。操作步骤如下：玻片脱蜡至水化，蛋白酶K完全覆盖组织样品。室温孵育20 min，100 μL 体积分数3%H₂O₂完全覆盖样品，室温孵育5 min。以100 μL 1×TdT平衡缓冲液完全覆盖样品，室温孵育10-30 min。同时准备标记反应混合物，加入TdT标记反应混合物，37 ℃孵育1.5 h。100 μL 终止缓冲液完全覆盖样品，室温孵育5 min。100 μL封闭缓冲液完全覆盖样品，室温孵育10 min，加入100 μL×偶联物，室温孵育30 min，100 μL DAB溶液完全覆盖样品，室温孵育10 min，dH₂O漂洗。以100 μL甲基绿复染剂复染，加盖玻片，中性树胶封固。

结果判读：单克隆抗体缺氧诱导因子1α免疫组织化学染色标记后，显微镜下可见髓核细胞核或细胞浆呈棕褐色，即为阳性细胞。TUNEL免疫组织化学染色标记后，显微镜下可见髓核细胞核呈棕黄色，即为阳性细胞。每个标本计数8个高倍镜(×200)视野内的所有阳性细胞个数和所有细胞数，求其比值。

计算公式：

每张切片由2名观察者分别读片得出，如2位观察者读片结果相差较大，则重复行免疫组织化学实验。

主要观察指标：①免疫组织化学方法观察各组髓核组织缺氧诱导因子1α表达情况。②TUNEL方法观察各组髓核组织凋亡情况。③髓核细胞缺氧诱导因子1α表达与细胞凋亡程度相关分析。

统计学分析：应用SPSS 13.0统计软件，采用单因素方差分析法中SNK检验分析髓核细胞缺氧诱导因子1α和凋亡总体差异及各组间差异，使用Spearman秩相关检验统计分析3组缺氧诱导因子1α表达与凋亡程度的相关性。P < 0.01时被认为差异有显著性意义。

讨论

缺氧诱导因子1普遍存在于人和哺乳动物细胞内的缺氧应答因子，是细胞在缺氧环境下重要的转录因子^[8]。缺氧诱导因子1的发现使人们对缺血、缺氧状态下机体各种应答反应机制的研究更加深入。缺氧诱导因子1α的功能涉及细胞能量代谢、离子代谢、血管形成、红细胞生成、细胞凋亡和增殖、细胞黏附及炎性反应等多个发面。组织处于缺氧状态时缺氧诱导因子1α发挥转录和基因调控作用，通过上调了血管内皮生长因子的表达并影响其他因子的表达，而直接参与血管生成的启动、形成、塑形和改造的全过程，进而形成完整的血管壁结构^[9-10]。缺氧诱导因子1的稳定和活性是由缺氧诱导因子1α决定的，缺氧诱导因子1α的调节受到多种因素的影响，且缺氧诱导因子1α是专一受O₂调节的亚基。缺氧条件下，缺氧诱导因子1α的磷酸状态是决定缺氧诱导因子1是促凋亡或是抗凋亡的重要因素，去磷酸化的缺氧诱导因子1α在缺氧条件下起着促凋亡作用，而磷酸化的缺氧诱导因子1α没有促凋亡作用。磷酸化的缺氧诱导因子1α聚合ARNT，而去磷酸化的缺氧诱导因子1α结合p53，稳定p53通过Bax的过度表达引起凋亡。此外，缺氧诱导因子1α通过调节BNIL3和Noxa等促凋亡蛋白的表达而促进凋亡。 Kim等^[11]发现在缺氧时缺氧诱导因子1α可直接结合Noxa启动子区域的HRE，从而使其表达增加，进而产生活性氧簇、释放线粒体细胞色素C、活化Caspase，诱导细胞凋亡。缺氧的严重程度决定细胞是出现凋亡还是适应缺氧生存，此外缺氧诱导因子1通过调控凋亡相关基因的转录在促细胞凋亡和抗细胞凋亡中都发挥着重要的作用。受缺氧诱导因子1调控的靶基因、靶蛋白中有一些是与细胞凋亡直接或间接相关的，在这些相关的靶分子中既有促进细胞凋亡的因素，也有抑制细胞凋亡的因素，可能是这些因素决定着缺氧诱导因子1发挥促凋亡和抗凋亡双重调节作用。而在本实验中，3组髓核组织中缺氧诱导因子1α的表达和凋亡呈正相关性(P < 0.01)。自从1985年Telick等^[12]首次报道椎间盘存在重吸收现象以来，椎间盘自发性吸收或缩小的临床报道不断增多，特别是游离型最容易吸收^[13]。推测可能与炎性细胞吞噬作用、突出组织血管化、自身免疫作用有关。也有研究表明，椎间盘细胞减少与其细胞凋亡相关，凋亡与缺氧、炎性等多种因素相关^[14-16]。但其具体机制目前尚不清楚。近年来的研究结果显示凋亡与椎间盘退变关系密切^[17]，随着年龄的增长和椎间盘的退变，椎间盘细胞的凋亡也会出现增加^[18-19]。凋亡，又称细胞程序性死亡，是指有核细胞在一定条件下启动自身内部机制，通过内源性DNA内切酶的激活而发生的细胞自然死亡过程，它通常伴有胞核内染色质聚集、DNA断裂及凋亡小体形成等病理变化^[20]。细胞凋亡在椎间盘突出形成后可能会加速^[21]。在椎间盘退变过程中，细胞排列有规律的减少，髓核大小发生很大的变化。其中功能性细胞数量的减少更为明显，且即便是存活的细胞，其生理活性亦明显降低。随着椎间盘退变的进展，尤其是细胞数量的减少，会有不同程度的细胞凋亡发生。本实验通过TUNEL染色观察三组髓核细胞的凋亡，三组都可观察到凋亡细胞，其中突出组和游离组高于对照组，游离组高于突出组，差异有显著性。作者认为髓核细胞在突出组和突出组的高表达可能是伴随着椎间盘的突出而表达的。髓核细胞凋亡在游离组高表达的原因可能为椎间盘游离后压力发生显著变化或者伴随着缺氧诱导因子1α的高表达。缺氧诱导因子1α的高表达可能促进了凋亡相关蛋白的表达，从而促进髓核细胞的凋亡。根据缺氧诱导因子1α在不同条件下即可促进细胞凋亡又可抑制细胞凋亡的作用，推测其在突出椎间盘重吸收的机制如下：在椎间盘突出的早期，缺氧促进了缺氧诱导因子1α的表达，对髓核细胞的生存起保护作用。与此同时，缺氧诱导因子1α促进新生血管的形成，而促进突出椎间盘的重吸收。随着椎间盘突出程度的增大，特别是游离型髓核游离于椎管内，突出的区域范围大，营养来源匮乏，细胞缺氧程度加重，即使缺氧诱导因子1α的表达增加也不能对髓核细胞发挥足够的保护作用。此时，缺氧诱导因子1α促进前凋亡蛋白的表达而促进细胞的凋亡，突出程度越重，凋亡程度越大，血管形成越多，椎间盘重吸收越明显，故游离型椎间盘突出更容易吸收。椎间盘细胞的具体凋亡途径目前还存在很多分歧^[22]。凋亡的进行是受多种因素调控的,启动凋亡因素的不同会导致发生凋亡途径的差异,不同的凋亡途径之间还会相互交叉相互影响^[23-24]。本实验的目的旨在初步证实缺氧诱导因子1α在腰椎不同突出类型髓核组织中的表达以及与凋亡的相关性，推测缺氧诱导因子1α可能在抑制椎间盘退变和促进重吸收中发挥重要作用。对于缺氧诱导因子1α对椎间盘退行性变作用途径、与其他细胞因子的相互作用等仍需进一步实验明确。进一步了解腰椎间盘突出症的病理生理过程，为腰椎间盘突出症患者采取生物治疗提供理论依据，为临床诊治带来一些新的思索和启迪。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程