聚四氟乙烯联合Ⅰ型胶原作为隆鼻高分子材料的生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.30.016

摘要/Abstract

摘要：

背景：高分子材料聚四氟乙烯膨体作为隆鼻填充材料具有耐腐蚀、化学性质稳定等优点，但其线膨胀系数较大，易引发感染及排异反应，故应用有一定局限性。

目的：对比聚四氟乙烯和聚四氟乙烯联合Ⅰ型胶原作为隆鼻填充材料的细胞毒性、埋植后的炎性浸润及体内生物相容性。

方法：采用MTT法检测聚四氟乙烯浸提液和聚四氟乙烯联合Ⅰ型胶原浸提液培养L929细胞的细胞增殖。采用电子显微镜观察聚四氟乙烯浸提液和聚四氟乙烯联合Ⅰ型胶原浸提液培养L929细胞后的细胞生长情况。将聚四氟乙烯和聚四氟乙烯联合Ⅰ型胶原材料分别埋置于新西兰白兔鼻背筋膜下7 d，苏木精-伊红染色观察鼻黏膜上皮组织炎性浸润情况。兔耳缘静脉分别注射聚四氟乙烯浸提液和聚四氟乙烯联合Ⅰ型胶原浸提液后，观察兔的全身毒性、过敏、热源反应及死亡情况。

结果与结论：作为隆鼻填充材料，聚四氟乙烯联合Ⅰ型胶原材料在细胞毒性、埋植后的炎性浸润方面均优于单纯聚四氟乙烯材料(P < 0.05)；兔耳缘静脉注射聚四氟乙烯联合Ⅰ型胶原材料后发生的过敏反应、热源反应少于注射单纯聚四氟乙烯材料(P < 0.05)。表明聚四氟乙烯联合Ⅰ型胶原作为隆鼻填充材料具有良好的生物相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 聚四氟乙烯, 聚四氟乙烯联合Ⅰ型胶原, 鼻填充材料, 生物相容性

Abstract:

BACKGROUND: Polytetrafluoroethylene (PTEE) as a nose filler material has advantages on the resistant to corrosion, chemical stability and so on. However, its linear expansion coefficient is large easily leading to infection and rejection, and its application has some limitations.

OBJECTIVE: To compare the cell toxicity, inflammatory infiltrates and biocompatibility indexes in vivo between PTEE and PTEE combined with type I collagen.

METHODS: MTT method was used to detect the relative proliferation rate of L929 cells cultured with PTEE extract or PTEE combined with type I collagen extract; an electron microscope was used to observe the cell growth. PTEE or PTEE combined with type I collagen was embedded under the nasal dorsal fascia of New Zealand white rabbits for 7 days, and hematoxylin-eosin staining was used to detect whether nasal mucosa epithelial tissue had inflammatory infiltration. Systemic toxicity, allergies, pyrogen reaction and deaths of rabbits were observed after injection of two kinds of material extracts by ear vein.

RESULTS AND CONCLUSION: The cytotoxicity and inflammatory infiltration were milder in PTEE combined with type I collagen group than PTEE group (P < 0.05). The allergic reactions and pyrogen reactions were fewer in PTEE combined with type I collagen group than PTEE group (P < 0.05). These findings indicate that PTEE
combined with type I collagen as the nose filler material has better biocompatibility.

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Key words: olytetrafluoroethylene, Collagen Type I, Biocompatible Materials

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 4

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引言

如今，在整形外科手术中，隆鼻成为了一个备受关注的问题，鼻填充物对于隆鼻的术后恢复和长期体内稳定性起到了决定性作用。临床上使用过的填充物材料主要有固体硅胶，其主要缺点是不能与机体建立起血液循环，形成机关毗连，仅为纤维组织包绕，故可在机关薄弱处穿出皮肤，由于纤维包膜的挛缩，可造成硅胶假体的体表投影，影响外观效果。羟基磷灰石人工骨材料生物相容性良好，无毒、无致畸、致敏及致癌等不良反应，但因无支撑作用，故对鼻尖低者效果较差^[1-2]。四氟乙烯制品是将聚四氟乙烯树脂用模具冷压后烧结而成，具有优良的耐腐蚀性，良好的自润滑性和不粘连性。在医药领域，它主要被应用于人体代用动脉、静脉血管、心脏膜；内窥镜、钳导管、气管；其他管、瓶、滤布等医疗器材。高分子材料聚四氟乙烯膨体曾被广泛应用于临床，有卓越的耐化学腐蚀性，对所有化学品都耐腐蚀，摩擦系数在塑料中最低，还有很好的电性能，其电绝缘性不受温度影响。聚四氟乙烯编织盘根是一种良好的动密封材料，由膨体聚四氯乙烯带条编织而成，具有低摩擦系数、耐磨、耐化学腐蚀、密封性良好、不水解、不变硬等优良性能，但因为其对机体的感染、机体排异反应，故使用有一定局限性^[3-7]。Ⅰ型胶原的组成与软骨相似，作为填充材料易固定、不易脱位，其具有更好的生物相容性^[8-9]。本实验考虑把聚四氟乙烯和Ⅰ型胶原联合制成的复合材料应用于隆鼻填充物，通过对比聚四氟乙烯和聚四氟乙烯联合Ⅰ型胶原作为隆鼻填充材料的细胞毒性、埋植后的炎性浸润及体内生物相容性，为临床上聚四氟乙烯联合Ⅰ型胶原材料的广泛应用提供一定的参考依据。杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

设计：相互对照，观察性实验。

时间及地点：于2014年1月至2015年1月在南阳市中心医院实验室完成。

材料：聚四氟乙烯填充材料(美国苏威科技公司，型号DF230)，见图1；聚四氟乙烯联合Ⅰ型胶原填充材料(东莞市吉鸿原料有限公司，型号：DF230-1)，见图2。MTT试剂盒(北京赛驰生物科技有限公司)；苏木精-伊红染色试剂盒(碧云天生物技术研究所)；L929细胞、RPMI1640培养基(上海酶联生物科技有限公司)。

实验动物：8周龄雌性新西兰白兔，体质量1 500-1 800 g，购自山东鑫发兔养殖公司，许可证号：鲁H9X966。

实验方法：

制备材料浸提液：将两种填充材料各减下50 mm长度，用PBS冲洗3次，放入紫外操作台中照射6 h；置于35 mm培养皿中，加入2 mL培养基RPMI 1640，于体积分数5%二氧化碳、37 ℃的培养箱中培养24 h，获得浸提液。

MTT方法检测细胞毒性：将L929细胞以3.5×10⁶ L^-1的密度铺于96孔板上，加入获取的两种材料浸提液(每孔加入200 µL)培养48 h后，在96孔板中加入MTT稀释溶液各 20 µL，继续放入培养箱中分别培养2，4 d后终止，在酶标仪450 nm处读取各孔的吸光度^[10]。计算细胞的相对增殖率RGR=实验组吸光度/空白组吸光度×100%(空白组为细胞常规培养基RPMI 1640培养组)。

当细胞相对增殖率在100%及以上时，毒性分级为0(合格)；在75%-99%之间时，毒性分级为1(合格)；在50%-74%之间时，毒性分级为2(待定)，需要考察细胞生长状态，如细胞生长状态良好，呈梭形紧贴壁生长，仅数量较少，未出现细胞拉丝现象或出现拉丝现象的细胞仅占全部细胞的20%以下则判定为合格，否则判定为不合格；在25%-49%之间时，毒性分级为3(不合格)；在1%-24%之间时，毒性分级为4(不合格)。

细胞培养与形态学观察：将L929细胞以2×10⁸ L^-1的浓度种于35 mm小皿中，分别用常规RPMI 1640培养基、RPMI 1640培养基+聚四氟乙烯浸提液、RPMI 1640培养基+聚四氟乙烯联合Ⅰ型胶原浸提液各2 mL培养细胞48 h后，观察细胞形态学变化^[11]。

材料埋植后的组织炎性浸润：取新西兰白兔30只，随机均分为3组，空白对照组、聚四氟乙烯组与四氟乙烯联合Ⅰ型胶原组。

以戊巴比妥钠30 mg/kg将30只兔麻醉，切开鼻背皮肤，于筋膜下1 cm处埋入聚四氟乙烯或四氟乙烯联合Ⅰ型胶原材料，空白对照组不做任何埋植处理，7 d后，耳缘静脉推入空气50 mL处死兔，取鼻背筋膜下埋植材料周围 2 cm范围的组织10 g，组织脱水包埋后进行冰冻切片，切片厚度为8 µm，后在室温干燥10 min，于37 ℃烘箱烤片 90 min，切片放入苏木精中浸泡3 min，自来水冲洗1 min，用1%盐酸乙醇分化30 s，自来水冲洗2 min，镜下观察是否着色；1%十二水磷酸氢二钠溶液返蓝1 s，自来水冲洗 2 min，伊红着色30 s，浸入体积分数80%无水乙醇2 min，体积分数95%无水乙醇Ⅰ中2 min，体积分数95%无水乙醇Ⅱ中2 min，体积分数100%无水乙醇Ⅰ中2 min，体积分数100%无水乙醇Ⅱ中2 min，最后浸入二甲苯中4 min，稍吹干后滴加中性树胶封固，镜下观察^[12]。

两种材料浸提液兔耳缘静脉注射后的全身毒性、过敏及热源反应：取新西兰白兔30只，随机均分为3组，分别经耳缘静脉注射生理盐水(阴性对照)、聚四氟乙烯浸提液、聚四氟乙烯联合Ⅰ型胶原浸提液，注射剂量为4 mL/kg，连续注射4 d，1次/d^[13]。观察：①全身急性毒性反应：体温升高至41 ℃以上，呼吸急促，打喷嚏，流鼻涕，有时下痢，全身发抖，四肢抽搐、尿便失禁。②过敏：呼吸急促、爬伏、软瘫。③热源反应：体温迅速升高至41 ℃以上。

主要观察指标：聚四氟乙烯联合Ⅰ型胶原作为隆鼻填充材料的细胞毒性、埋植后的炎性浸润及动物体内生物相容性。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件分析，计量数据以x(_)±s表示，采用t 检验；计数资料采用χ²检验，各组别之间的计量资料比较采用F 分析，以P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

四氟乙烯制品具有优良的耐腐蚀性，良好的自润滑性和不粘连性^[14-20]。聚四氟乙烯这种材料具有抗酸抗碱、抗各种有机溶剂的特点，几乎不溶于所有的溶剂^[21-22]。同时，聚四氟乙烯具有耐高温、耐腐蚀、化学性质稳定等特点，它的摩擦系数极低，是一种良好的填充材料，临床上曾一度将其运用作为隆鼻填充材料^[23-25]，但在使用中发现，其线膨胀系数比多数塑料大，并且线膨胀系数随着温度的变化会发生很不规律的变化，植入后机体易发生感染，对其产生排异反应，故使用有一定局限性^[26]。Ⅰ型胶原作为填充材料其组成与软骨相似，具有更好的生物相容性^[27]。本实验旨在对比聚四氟乙烯和聚四氟乙烯联合Ⅰ型胶原作为隆鼻填充材料的细胞毒性、埋植后的炎性浸润及体内生物相容性，研究结果显示，加入聚四氟乙烯和聚四氟乙烯联合Ⅰ型胶原提取液培养细胞2-4 d后，聚四氟乙烯联合I型胶原组和聚四氟乙烯组的材料毒性等级均合格，但聚四氟乙烯联合Ⅰ型胶原组的细胞相对增殖率明显高于聚四氟乙烯组(P < 0.05)。加入聚四氟乙烯和聚四氟乙烯联合I型胶原提取液培养L929细胞2 d后，细胞稀疏，且有拉丝现象，其中聚四氟乙烯联合Ⅰ型胶原组与聚四氟乙烯组相比，细胞生长较快，呈梭形，拉丝现象不明显。新西兰白兔鼻部埋植聚四氟乙烯和聚四氟乙烯联合Ⅰ型胶原材料7 d后，炎性细胞浸润明显增加(P < 0.05)，其中埋植聚四氟乙烯联合I型胶原材料组的炎性浸润较聚四氟乙烯少。耳缘静脉注射聚四氟乙烯联合Ⅰ型胶原材料浸提液，兔过敏、热源反应的发生率明显低于耳缘静脉注射聚四氟乙烯材料组。大家都知道，复合材料是指2种或2种以上不同性质的材料，通过物理或化学的方法，在宏观上组成具有具有新性能的材料，各种材料在性能上互相取长补短，产生协同效应，使得复合材料的综合性能优于原组成材料。胶原作为生物体内一种纤维蛋白，大量存在于骨、软骨、肌腱及皮肤中，其中Ⅰ型胶原占生物体胶原含量的90%以上，作为生物医学材料，Ⅰ型胶原具有低免疫原性、生物相容性良好、止血作用、可生物降解性，并且具有高度亲水性、可溶解性、高度透氧性、保护及润滑作用，是体内填充材料的良好选择^[28-30]。本实验结果显示，由于Ⅰ型胶原的引入，使得聚四氟乙烯的生物相容性明显提高，这可能是由于Ⅰ型胶原作为填充材料具有易固定、不易脱位等优点，使得聚四氟乙烯联合I型胶原材料在细胞毒性、埋植后的炎性浸润方面均优于单纯聚四氟乙烯材料(P < 0.05)；兔耳缘静脉注射聚四氟乙烯联合Ⅰ型胶原材料后发生的过敏反应、热源反应少于注射单纯聚四氟乙烯材料 (P < 0.05)。聚四氟乙烯联合Ⅰ型胶原作为隆鼻填充材料，在细胞毒性、埋植后的炎性浸润及生物相容性方面均优于单纯聚四氟乙烯材料，为临床上鼻填充材料的改进和广泛应用提供了科学依据。而关于聚四氟乙烯材料联合Ⅰ型胶原的具体临床应用将是下一步研究的重点内容。

杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程