明胶-壳聚糖-羟基磷灰石-米诺环素仿生纳米复合材料修复桡骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.30.001

摘要/Abstract

摘要：

背景：课题组前期研制了新型明胶-壳聚糖-羟基磷灰石-米诺环素仿生纳米复合材料。

目的：观察明胶-壳聚糖-羟基磷灰石-米诺环素仿生纳米复合材料修复兔桡骨缺损的效果。

方法：取30只成年健康新西兰大白兔，在一侧桡骨上端制作约15 mm×6 mm的临界性腔隙性骨缺损，随机分为实验组(n=15)、自体骨移植组(n=10)和空白对照组(n=5)，实验组将明胶-壳聚糖-羟基磷灰石-米诺环素仿生纳米复合材料植入骨缺损处，自体骨移植组从对侧桡骨取等长桡骨植入骨缺损处，空白对照组不做任何处理。于术后2，4，8，12周分别行大体观察、组织学观察及X射线平片检查。

结果与结论：植入后12周，实验组骨缺损区有明显血管生成，骨性愈合完全，植入复合材料消失，出现板层骨结构，可见小血管，新生骨边缘与原骨边缘连接，表现成骨的连续性，密度较原骨稍降低，骨缺损区不明显；自体骨移植组骨性愈合，骨小梁重建较明显，板层骨较成熟，髓腔再通，骨折线完全消失，骨密度与原骨完全一致；空白对照组髓腔无明显成骨现象，大量纤维组织及炎症细胞浸润，骨折断端未愈合。表明明胶-壳聚糖-羟基磷灰石-米诺环素仿生纳米复合材料可明显促进临界性骨缺损修复，效果与自体骨移植相当。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 明胶, 壳聚糖, 羟基磷灰石, 米诺环素, 生物相容性, 兔, 临界骨缺损, 自体骨移植

Abstract:

BACKGROUND: Gelatin-chitosan-hydroxyapatite-minocycline biomimetic nanocomposite materials were developed in our previous studies

OBJECTIVE: To observe the capability of gelatin-chitosan-hydroxyapatite-minocycline biomimetic nanocomposite materials in the repair of rabbit radius defects.

METHODS: Thirty healthy adult New Zealand rabbits were selected to make critical-size lacunar bone defects of the upper radius (15 mm×6 mm). Then, the rabbit models were randomized into experimental group (n=15), autogenous bone graft group (n=10) and blank group (n=5). Gelatin-chitosan-hydroxyapatite-minocycline biomimetic nanocomposite materials were implanted into radial bone defects in the experimental group. Bone defect in blank group was implanted without any materials; in the autogenous bone graft group, the contralateral radius with same length was taken and implanted into the defect. General observation, histological observation and X-ray observation were performed respectively at 2, 4, 8, 12 weeks postoperatively.

RESULTS AND CONCLUSION: At 12 weeks after operation, the experimental group showed obvious new blood vessels at the defect region, complete bony union and disappearance of the composite implant, but lamellar bone structure appeared, small blood vessels were visible, the edge of new bone was connected to the original bone edge, exhibiting a continuity of bone, the bone density was slightly lowered, and the defect region became unobvious. In the autogenous bone graft group, bony union and trabecular bone reconstruction were distinct, the lamellar bone became mature, the medullary cavity was recanalized, the fracture line disappeared completely, and the bone density was completely consistent with that of the original bone. In the blank group, there was no obvious bone formation, which led to bone nonunion, and there were a great amount of fiber tissues and inflammatory cell infiltrated. To sum up, the gelatin-chitosan-hydroxyapatite-minocycline biomimetic nanocomposite material can obviously promote the repair of critical-size bone defects, and the repairing effect is basically the same with that of autologous bone grafting.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Chitosan, Gelatin, Durapatite

中图分类号:

R318

李光宇，董洲，刘鑫，汤健. 明胶-壳聚糖-羟基磷灰石-米诺环素仿生纳米复合材料修复桡骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(30): 4757-4763.

Li Guang-yu, Dong Zhou, Liu Xin, Tang Jian. Gelatin-chitosan-hydroxyapatite-minocycline biomimetic nanocomposite materials for repair of rabbit radius defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(30): 4757-4763.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析在实验之前查阅相关文献，做过多次预实验，对兔的习性、围手术期处理，麻醉、手术方式及术后常规处理等均做了精细安排，有效减少了麻醉及手术并发症，因此在后期实验手术过程中均无动物的非实验要求死亡。术后30 min，实验动物完全苏醒，术后前3 d进食较少，活动较少，术后第1天切开周围组织肿胀，淤血，切口无红肿、渗出等反应，全身皮肤无脓肿形成。 2.2 大体观察 实验组：术后第2周，经过多次换药，切口生长满意，无红肿、渗出等反应，植入复合材料与周围骨组织界限清晰，接触较好，纤维组织膜覆盖于植入材料表面；术后第4周，切口已愈合，植入材料体积变小、颜色变淡，与相邻骨组织界限已模糊不清；术后第8周，切口修复正常，骨缺损区已明显缩小，复合材料体积减小明显，植入材料颜色淡化；术后第12周，骨缺损区有明显血管生成，骨性愈合完全，植入复合材料消失，见图1。

自体骨移植组：术后第2周，切口生长良好，无红肿、渗液、流脓等炎症反应，植入骨与宿主骨折断端有少量骨痂形成，周围有纤维结缔组织覆盖包裹；术后第4周，手术切口已完全愈合，皮肤无红肿、渗液、流脓等炎性反应，植入骨与宿主骨折断端结合较紧密，周围有纤维组织覆盖包裹，骨痂增生明显；术后第8周，切口已与正常无异，移植骨与宿主骨结合较紧密，骨折线已不易区分；术后第12周，移植骨与宿主骨折断端骨性愈合，未见纤维组织长入，骨折线已不可见，见图2。

空白对照组：术后2-12周见纤维软组织增生，覆盖骨缺损，缺损处均无骨性生长，形成骨不连，剖面见骨缺损髓腔形成空腔，纤维组织封闭髓腔两端，见图3。 2.3 组织学观察 实验组：术后2周苏木精-伊红染色显示无明显的炎症反应，可见成骨细胞包绕着的骨髓基质细胞大量形成，成骨反应活跃，植入复合材料正在降解；4周后，可见新骨形成明显增多，网状编织骨大量形成骨岛，新生骨钙化明显增强，新骨早期塑形改变，可见新骨周边有破骨细胞生成；术后第8周，复合材料基本降解完全，网状编织样骨组织进一步成熟，排列有序，可见骨髓腔形成及成熟骨细胞；术后第12周时，新生骨组织较8周成熟明显，表现为松质骨向密质骨的变化，出现板层骨结构，可见小血管，新生骨边缘与原骨边缘连接，表现成骨的连续性，见图4。 空白对照组：术后12周时观察见髓腔无明显成骨现象，大量纤维组织及炎症细胞浸润，骨折断端未愈合，见图5。

自体骨移植组：术后第2周，植入骨周围有纤维结缔组织包裹，少量炎性细胞浸润，见骨小梁生长较旺盛，排列紊乱；术后第4周，骨折断端有纤维组织包裹，类骨组织开始转变为编织骨，纤维性骨痂中的软骨组织经软骨化骨演变为骨组织，形成骨性骨痂；术后第8周，有大量成熟的条索板层骨形成，骨细胞排列规则，骨小梁较粗大，可见骨小梁正常的排列结构正在重新恢复，有骨母细胞增生形成新骨质和破骨细胞增生引起的骨质吸收；术后第12周，新生骨进一步形成，骨小梁重建较明显，板层骨较成熟，髓腔再通，见图6。

2.4 X射线平片检查 实验组：术后第2周，骨缺损区断端周围有毛玻璃样新生骨组织形成；第4周，骨缺损面积较2周时减少，骨缺损区已模糊，新生骨痂密度增高；第8周，骨缺损区密度较之前明显增高，骨缺损区面积减少，骨折周围界限较模糊；第12周，缺损区基本愈合，密度较原骨稍降低，骨缺损区不明显，见图7。 自体骨移植组：术后第2周，骨缺损植骨区可见骨痂生长骨折线明显；第4周，断端周围大量骨痂生长，骨折线模糊减少；第8周，骨折线基本消失，骨折塑形基本完成；第12周，骨折线完全消失，塑性完成，骨密度与原骨完全一致，见图8。 空白对照组：术后第12周，骨缺损明显，边界硬化，无新生骨代替，缺损面积未见变小，见图9。

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引言

随着社会经济的快速发展，骨肿瘤及车祸等高能量创伤在临床上明显增多，多种创伤致骨缺损的患者大量增加，外科手术治疗中需要植骨，目前临床上的植骨主要包括人工骨、异体骨(异体冻干骨、异体脱矿骨基质)及自体骨等。当今自体骨移植仍然是骨缺损治疗的最佳方案，但自体骨移植存在对患者的再次损伤及取材量受限的缺点，患者常无法接受；针对异体骨移植后出现的疾病传播及免疫反应仍然难以克服，因此近年来人工骨研究为骨缺损治疗带来了新的希望。理想的植骨材料应完全具备4个基本生理特点，即骨整合、骨诱导、骨传导和成骨性能，这4个特性使得替代品在初次嵌入骨缺损内部迅速稳定，并快速代替自身骨，达到终身重塑的目的。羟基磷灰石是磷酸钙基生物陶瓷(Ca-P生物陶瓷)的一种，具有较疏松的复杂结构，由于其组成与自然骨的无机质相似，具有良好的生物相容性、生物活性及骨传导性，因而被人们研究用于人体硬组织修复。但单纯的羟基磷灰石粉体承受外力和液体冲刷的能力极差，不能用作承重骨组织的修复。制备骨修复材料时只能选择羟基磷灰石陶瓷烧结体，其具有较高的抗压强度，但易发生脆性断裂和疲劳破坏，从仿生学角度出发，应当保持骨替代物中羟基磷灰石呈纳米状态，而陶瓷烧结体中的羟基磷灰石颗粒均为微米以上尺寸，与天然骨磷灰石相去甚远。随着材料学的进步，纳米材料在组织工程领域的应用正成为新的研究热点。纳米材料是指在1-100 nm空间里具有特定功能的材料，它既不同于微观原子、分子，也不同于宏观物质。当物质的结构单元小到纳米级时，其性质就会发生重大改变，不仅改善了原来材料的性能，甚至使原材料具有新的性能或效应。研究表明，生物材料表面的空间微观结构，如粗糙程度、孔隙大小及分布等对细胞形态、黏附、铺展、定向生长及生物活性均有很大影响，而纳米材料具有结构单元或特征维度尺寸在纳米数量级、存在大量的界面的特点^[1]，因此，具有纳米结构的生物材料更有利于细胞的黏附、增殖和功能的增强^[2-5]。纳米级羟基磷灰石有着更好的生物学性能，纳米级羟基磷灰石合成的复合材料正成为研究的热点。明胶是胶原的降解产物，具有无毒性，溶于水，价格便宜，有利于软骨细胞黏附、增殖和分化等优势，还可刺激移植组织产生新的胶原，并且降解产物可被机体吸收；但其存在机体吸收过快、机械性能差等问题，很难满足骨修复要求，因此往往通过复合其他生物材料来改善复合材料的特性^[6]。壳聚糖是天然多糖甲壳素的去乙酰化产物，是一种含有游离氨基的碱性多糖。壳聚糖在溶液中是带正电荷的多聚电解质，具有很强的吸附性，不溶于水和碱溶液，可溶于低浓度无机酸或某些有机酸^[6-8]。米诺环素本身是一种金属螯合剂，能与Ca²⁺等阳离子络合，因此在反应过程中，米诺环素与Ca²⁺的络合，一方面，影响了磷灰石的晶体结构，使磷灰石晶体含有Cl等元素；另一方面，米诺环素分子也被包裹在羟基磷灰石晶体、壳聚糖及明胶分子中，能够持续、稳定、高效的缓慢释放。体外实验已证明在复合物中米诺环素可以不断地缓释，发挥抗菌作用^[6]。近年来，生物材料的分子仿生设计已成为现代硬组织修复材料设计的主导思想和实现新一代生物材料的理想途径，其思想是在温和的生理条件下，以有机大分子为模板控制无机晶体的形成，通过生物大分子的自组装形成纳米等级有序的类骨结构。课题组采用明胶作为调控壳聚糖成核、生长的有机基质模板，调控羟基磷灰石的生长，同时装载抗菌药物米诺环素，合成一种新型可缓释抗菌药物、可降解并具有生物活性的纳米复合硬组织修复材料^[9-15]。本实验通过观察新型明胶-壳聚糖-羟基磷灰石-米诺环素仿生纳米复合材料修复兔桡骨缺损的效果，为新型骨修复材料的进一步研究和临床应用提供理论基础和实验依据，为骨缺损和骨不连治疗提供新的思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2013年1至10月在安徽医科大学动物实验中心完成。

材料：明胶-壳聚糖-羟基磷灰石-米诺环素仿生纳米复合材料，由安徽医科大学口腔医学院材料研究室合成，制成直径 0.5 cm、长度 1.5 cm 左右的柱状，⁶⁰Co照射灭菌备用。

实验动物：新西兰健康大白兔30只，体质量2.0-3.5 kg，雌雄不拘，购于安徽医科大学动物实验中心，合格证号：皖医实动准字03号，随机分为实验组(n=15)、空白对照组(n=5)和自体骨移植组(n=10)。

纳米复合材料修复兔桡骨缺损的主要仪器及试剂：
试剂与仪器	来源
戊巴比妥钠	重庆亚马生物科技有限公司
注射器	山东威高集团医用高分子制品股份有限公司
医用缝合线	德国拜耳医疗器械有限公司
注射用青霉素	华润三九医药股份有限公司
苏木精、伊红	重庆东方生物制品有限公司
多聚甲醛、络合碘、甲酸、医用乙醇	上海瀚海生物制品有限公司
压力蒸汽灭菌器	上海强生医疗器械公司
leica病理组织包埋机	德国leica公司
医用显微镜	奥林巴斯
骨科用电动摆锯	德国博世公司
手术器械	安徽医科大学实验动物中心

实验方法：

兔桡骨上端腔隙性骨缺损模型的制作：常规灭菌手术室及术中使用无菌单及常规手术器械。取兔30只，3%戊巴比妥钠1 mg/kg行耳缘静脉注射麻醉，取仰卧位，固定四肢，经耳缘静脉留置静脉通道，生理盐水持续缓慢滴注，补液，剪除一侧前腿肘以下的毛，待麻醉完全满意起效后，常规碘伏消毒，铺消毒无菌洞巾，以肘关节以下桡骨中上1/3为中点，做一弧行切口，约3 cm。切开皮肤皮下组织至骨膜，术中注意血管，缝扎止血，分离软组织，将钝性分离指深肌群外侧肱桡肌牵开，分离周围骨膜，暴露桡骨干，用口腔科专用磨钻切除桡骨掌侧近皮质骨约15 mm×6 mm大小，在截骨过程中尽量保持截骨平面的平行，同时防止相连尺骨损伤，刮匙刮除骨髓及松质骨。

截骨部分以生理盐水浸泡、反复冲洗切口，仔细彻底止血：实验组于骨缺损取植入明胶-壳聚糖-羟基磷灰石-米诺环素复合材料，填实压紧；自体骨移植组取对侧桡骨掌侧近皮质骨约15 mm×6 mm大小，保留背侧部分皮质，修剪植骨块，植入骨缺损处，压实；空白对照组骨缺损旷置，不植入任何材料。依次逐层缝合伤口，消毒无菌外科敷料包扎手术切口。术后3 d内每天每只给予静脉通道补80×10⁴ U青霉素钠+生理盐水250 mL，术后不行特殊固定，常规饲养。

主要观察指标：

大体观察：观察实验动物术后表现，上肢切口生长及愈合情况，肢体活动；各组缺损区骨质生长情况，炎症反应情况，骨折端与实验材料界面愈合及软组织界面情况，植入区材料颜色及体积大小变化等。

X射线平片检查：术后2，4，8，12周摄片，实验组与自体骨移植组各个时间点取2只，空白对照组每个时间点1只，观察骨痂密度变化及骨缺损处愈合情况。

病理切片：X射线拍摄后处死动物，截取实验前肢，清除周围软组织，取出桡骨，反复生理盐水冲洗，标本放入体积分数10%甲醛中固定24 h，无菌蒸馏水多次冲洗，后置入体积分数70%医用乙醇中固定2 h，标记组别。①标本脱钙：室温下取标本置入专用合成脱钙溶液中(甲醛 100 mL，蒸馏水400 mL，氯化铝100 g，甲醛100 mL，甲酸500 mL)，每16 h观察标本脱钙程度，待刀片修切标本切面无明显沙粒感或标本可以被针头轻松完全刺入，说明标本完全脱钙。②制片：将完全脱钙的标本置于蒸馏水中静置24 h，后按顺序分别置入体积分数70%-100%的乙醇溶液中脱水24 h，放置于70 ℃石蜡中4 h后包埋。使用切片机切为5 mm切片，放置黏贴于被多聚甲醛覆盖的玻片上。③染色：分别进行二甲苯脱蜡，乙醇浸泡，流水冲洗，苏木精染色，自来水冲洗，中性树脂封固。

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讨论

Waked等^[15]将临界性骨缺损规定为在动物生命周期内愈合小于所造缺损10%的骨缺损，如果1年内修复未达缺损的10%，便可以认为此模型符合临界性骨缺损的标准。本次实验人为制造的兔桡骨骨缺损约1.5 cm×0.6 cm，同时12周后观察空白对照组，也显示骨缺损区只有纤维软组织充填，无骨性愈合，这表明人为制造的兔桡骨骨缺损无法自愈。观察术后不同时期组织学染色切片，实验组在术后2周时无明显炎症反应，可见成骨细胞包绕的骨髓基质细胞大量形成，成骨反应活跃，植入复合材料正在分解；到4周后显微观察可见新骨形成明显增多，网状编织骨大量形成，形成骨岛，新生骨钙化明显增强，新骨早期塑形改变，可见新骨周边有破骨细胞生成；术后8周时复合材料基本分解完全，网状编织样骨组织进一步成熟，排列有序，可见骨髓腔形成，可见成熟骨细胞；到12周时新生骨组织较8周成熟明显，表现为松质骨向密质骨的变化，出现板层骨结构，可见小血管，新生骨边缘与原骨边缘连接，表现成骨的连续性。不同时间点的X射线平片证明，实验组术后2周时骨缺损区断端周围有毛玻璃样新生骨组织形成，4周时骨缺损面积较2周时减少，骨缺损区已模糊，新生骨痂密度增高，8周时骨缺损区密度较之前明显增高，骨缺损区面积减少，骨折周围界限较模糊，12周时缺损区基本愈合，密度较原骨稍降低，骨缺损区不明显；自体骨移植组术后2周时骨缺损植骨区可见骨痂生长骨折线明显，4周时断端周围大量骨痂生长，骨折线模糊减少，8周时骨折线基本消失，骨折塑形基本完成，12周时骨折线完全消失，塑性完成，骨密度与原骨完全一致。实验从大体观察、组织学及影像学表现3方面证明了新型骨修复复合材料可有效修复骨缺损，效果与自体骨移植相当。经过分析复合材料修复骨缺损的可能机制是：74%的无机成分和26%的有机成分共同组成骨组织，新型复合材料中明胶和壳聚糖复合体组成有机基质模板，调控无机质的生长。壳聚糖是一种天然多糖，具备良好的生物相容性，具有一定的孔径和孔隙率，有利于细胞长入，同时具有较好的生物机械性、降解性等^[16-26]。羟基磷灰石的纳米级晶体是无机质的主要成分，复合材料中羟基磷灰石以纳米级纤维填充无机基质，具有天然骨的类似结构，充分发挥纳米羟基磷灰石的生物相容性，可作为仿生合成人工材料的大分子模板。以明胶-壳聚糖制成的纳米载体可延长药物在吸收部位的保留时间，达到缓释控释的效果^[1-4]。明胶具有与胶原相同的氨基酸，良好的生物相容性，同时还具有较好的黏附作用和骨诱导性，可被人体降解吸收。装载的抗菌成分米诺环素是四环素类药物，具有抗菌、抑制胶原酶、抑制骨吸收、易于新骨形成等作用^[27-30]。米诺环素本身是一种金属螯合剂，能够与Ca²⁺等阳离子络合，因此在反应过程中，米诺环素与Ca²⁺的络合，一方面影响了磷灰石的晶体结构，使磷灰石晶体含有Cl等元素^[7-8]；另一方面，米诺环素分子也被包裹在羟基磷灰石晶体、壳聚糖及明胶分子中，能够持续、稳定、高效的缓慢释放。实验证实明胶-壳聚糖-羟基磷灰石-米诺环素仿生纳米复合材料可有效促进临界性骨缺损的修复，为此新型材料的临床应用打下了基础。

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