前交叉韧带离断骨关节炎大鼠印第安刺猬蛋白以及Runt相关转录因子2的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.18.006

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (18): 2820-2821.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.18.006

• 器官移植动物模型 organ transplantation and animal model • 上一篇下一篇

前交叉韧带离断骨关节炎大鼠印第安刺猬蛋白以及Runt相关转录因子2的表达

孙一松，姚运峰，方东，荆珏华

安徽医科大学第二附属医院骨科，安徽省合肥市 230000

收稿日期:2015-03-03 出版日期:2015-04-30 发布日期:2015-04-30
通讯作者: 荆珏华，主任医师，医学博士，硕士生导师，安徽医科大学第二附属医院骨科，安徽省合肥市 230000
作者简介:孙一松，男，1990年生，安徽省合肥市人，汉族，安徽医科大学在读硕士，主要从事创伤与关节方面的研究。
基金资助:
安徽医科大学第二附属医院博士科研启动基金(2012BKJ014)

Expression of Indian hedgehog protein and Runt related transcription factor 2 in rats with osteoarthritis caused by anterior cruciate ligament transection

Sun Yi-song, Yao Yun-feng, Fang Dong, Jing Jue-hua

Department of Orthopedics, the Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230000, Anhui Province, China

Received:2015-03-03 Online:2015-04-30 Published:2015-04-30
Contact: Jing Jue-hua, Chief physician, M.D., Master’s supervisor, Department of Orthopedics, the Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230000, Anhui Province, China
About author:Sun Yi-song, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, the Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230000, Anhui Province, China
Supported by:
Doctor Scientific Research Initial Foundation of the Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University, No. 2012BKJ014

摘要/Abstract

摘要：

背景：印第安刺猬蛋白(Ihh)及其信号蛋白Gli1以及Runt相关转录因子2(Runx2)是骨关节炎密切相关的因子，在骨关节炎发病过程中，是引起关节退行性改变的重要原因之一。
目的：探索Ihh，Gli1以及Runx2在骨关节炎发病过程中的作用。
方法：将30只SD大鼠随机分成对照组(n=10)和模型组(n=20)。模型组大鼠取一侧膝关节行前交叉韧带离断建立骨关节炎模型，分别于造模后4周及12周，各取10只大鼠进行观察。对照组大鼠仅暴露前交叉韧带，于术后12周进行观察。
结果与结论：与对照组相比，造模4周后可见骨关节炎模型大鼠膝关节出现软骨退变，膝关节软骨中Ihh，Gli1及Runx2表达水平明显增高，而造模12周后软骨退变进一步加重，但膝关节软骨中Ihh，Gli1及Runx2表达水平下降。提示Ihh，Gli1及Runx2在骨关节炎退变过程中起重要作用，其表达水平在骨关节炎的早期即明显升高，可作为骨关节炎防治研究中的评价指标。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

全文链接：

关键词: 实验动物, 骨及关节损伤模型, 印第安刺猬蛋白, 骨性关节炎, 关节软骨退变, 骨关节炎, 动物模型, Runt相关转录因子2

Abstract:

BACKGROUND: Indian hedgehog homolog (Ihh) protein and its signal protein Gli1, as well as Runt related transcription factor 2 (Runx2) are closely related to the pathogenesis of osteoarthritis. The increased expression of these factors is one of the major causes of degenerative joint changes.
OBJECTIVE: To explore the roles of Ihh, Gli1 and Runx2 in the development of osteoarthritis.
METHODS: Thirty Sprague-Dawley rats were randomly divided into two groups: control group (n=10) and model group (n=20). In the model group, rats received unilateral anterior cruciate ligament transection, to establish osteoarthritis model. Ten experimental rats were killed at 4 and 12 weeks after surgery respectively. Another 10 rats received unilateral knee arthrotomy as pseudo-operation controls and 10 pseudo-operation rats were killed at 12 weeks after surgery.
RESULTS AND CONCLUSION: In the model group, cartilage degeneration was obvious at 4 weeks and became severer at 12 weeks after anterior cruciate ligament transection operation. Expression levels of Ihh, Gli1 and Runx2 in the cartilage were increased significantly at 4 weeks after operation, but decreased at 12 weeks after operation. Experimental findings indicate that Ihh, Gli1 and Runx2 play important roles in the development of osteoarthritis, and their expression levels are significantly increased at early stage of osteoarthritis, which can be regarded as the indicators in the prophylaxis and treatment research of osteoarthritis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

全文链接：

Key words: Osteoarthritis, Cartilage, Anterior Cruciate Ligament, Cartilage, Articular

中图分类号:

R318

孙一松，姚运峰，方东，荆珏华. 前交叉韧带离断骨关节炎大鼠印第安刺猬蛋白以及Runt相关转录因子2的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(18): 2820-2821.

Sun Yi-song, Yao Yun-feng, Fang Dong, Jing Jue-hua. Expression of Indian hedgehog protein and Runt related transcription factor 2 in rats with osteoarthritis caused by anterior cruciate ligament transection [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(18): 2820-2821.

图/表（结果） 3

参考文献

[1] Loeser RF. Age-related changes in the musculoskeletal system and the development of osteoarthritis. Clin Geriatr Med. 2010;26(3):371-386.
[2] Ishijima M, Kaneko H, Kaneko K. The evolving role of biomarkers for osteoarthritis. Ther Adv Musculoskelet Dis. 2014;6(4):144-153.
[3] Chen WX, Shan FJ, Jin HT, et al. Research on application of determination of MMP-13 in osteoarthritis. Zhongguo Gu Shang. 2014;27(7):617-620.
[4] Lin AC, Seeto BL, Bartoszko JM, et al. Modulating hedgehog signaling can attenuate the severity of osteoarthritis. Nat Med. 2009;15(12):1421-1425.
[5] Kamekura S, Kawasaki Y, Hoshi K, et al. Contribution of runt-related transcription factor 2 to the pathogenesis of osteoarthritis in mice after induction of knee joint instability. Arthritis Rheum. 2006;54(8):2462-2470.
[6] Chau M, Forcinito P, Andrade AC, et al. Organization of the Indian hedgehog--parathyroid hormone-related protein system in the postnatal growth plate. J Mol Endocrinol. 2011; 47(1):99-107.
[7] Shimoyama A, Wada M, Ikeda F, et al. Ihh/Gli2 signaling promotes osteoblast differentiation by regulating Runx2 expression and function. Mol Biol Cell. 2007;18(7):2411-2418.
[8] Yoshida CA, Yamamoto H, Fujita T, et al. Runx2 and Runx3 are essential for chondrocyte maturation, and Runx2 regulates limb growth through induction of Indian hedgehog. Genes Dev. 2004;18(8):952-963.
[9] Pelletier JP, Jovanovic D, Fernandes JC, et al. Reduced progression of experimental osteoarthritis in vivo by selective inhibition of inducible nitric oxide synthase. Arthritis Rheum. 1998;41(7):1275-1286.
[10] 高耀祖,魏垒,李鹏翠,等.Indian hedgehog在软骨内成骨和骨关节炎中作用的研究进展[J].中国矫形外科杂志,2013,21(17): 1742-1745.
[11] Choi SW, Jeong DU, Kim JA, et al. Indian Hedgehog signalling triggers Nkx3.2 protein degradation during chondrocyte maturation. Biochem J. 2012;443(3):789-798.
[12] Zhang C, Wei X, Chen C, et al. Indian hedgehog in synovial fluid is a novel marker for early cartilage lesions in human knee joint. Int J Mol Sci. 2014;15(5):7250-7265.
[13] Kim SY, Im GI. The expressions of the SOX trio, PTHrP (parathyroid hormone-related peptide)/IHH (Indian hedgehog protein) in surgically induced osteoarthritis of the rat. Cell Biol Int. 2011;35(5):529-535.
[14] Zhou J, Chen Q, Lanske B, et al. Disrupting the Indian hedgehog signaling pathway in vivo attenuates surgically induced osteoarthritis progression in Col2a1-CreERT2; Ihhfl/fl mice. Arthritis Res Ther. 2014;16(1):R11.

引言

材料方法

设计：随机对照动物实验观察

时间及地点：实验于2014年5至11月在安徽医科大学动物实验中心，安徽医科大学卫生毒理学中心实验室完成。

材料：

骨关节炎大鼠模型实验使用的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
Ihh一抗，Gli1一抗	Santa Cruz公司
RunX-2一抗	Abcam公司
Western blot检测试剂盒	ThermoFisher 公司
番红O染料	Sigma公司
光学显微镜(Leica DMI 3000 B)	Leica公司

动物：SPF级SD大鼠30只，雌雄各半，体质量200- 250 g，由安徽医科大学动物中心提供，动物许可证号SCXK(皖)2010-0023，饲养于安徽医科大学动物实验中心SPF级屏障环境中，饲养环境温度(25±1) ℃，相对湿度(70±4)%，干木屑为垫料，平均每周更换两次。实验动物自由饮水和取食，昼夜节律12 h∶12 h。实验符合动物伦理学的要求。

方法：

实验动物分组：将30只大鼠随机分成对照组(n=10)和模型组(n=20)。

前交叉韧带离断骨关节炎动物模型的建立：模型组大鼠随机选取一侧膝关节，经膝关节内侧切口进入关节腔，暴露前交叉韧带，直视下切断前交叉韧带，术中行前抽屉试验确认前交叉韧带已完全离断，逐层闭合关节腔(图1)。对照组大鼠仅暴露前交叉韧带。造模后3 d，每天每只大鼠肌注20×10⁴ U青霉素预防感染。造模后不做任何固定。

病理观察：分别于造模后4周及12周，模型组各处死10只大鼠，于术后12周处死10只对照组大鼠。观察膝关节有无关节积液和滑膜肿胀，取出胫骨平台内侧软骨组织，部分放液氮保存，其余行甲醛固定24 h，10%EDTA脱钙12周后，进行常规组织石蜡切片，番红O染色，光学显微镜下观察软骨组织学特征。按照以下原则进行病理评分：0分：关节面光整，色泽如常；1分：关节面粗糙，表层破坏；2分：关节面糜烂，血管翳及表层破坏；3分：关节面溃疡形成，浅层裂隙形成达移行层；4分：裂隙局限性深达骨质辐射层；5分：裂隙深达骨质钙化层缺损负重区；6分：全层软骨缺损^[9]。

Western Blot法检测大鼠关节软骨中Ihh，Gli1和Runx2的表达水平：将液氮保存的大鼠膝关节软骨研磨后，用RIPA裂解液提取总蛋白，15 000 r/min 离心15 min×2次，Lowry法测总蛋白含量，对样本进行蛋白定量后用98 ℃ 10 min进行蛋白变性，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳3.5 h后再以平行电泳方式转移到活化后的PVDF膜上。置于体积分数5%的脱脂牛奶中封闭2.0-3.0 h，加入一抗4 ℃过夜，次日用DPBST溶液洗涤4次，每次10min，再用 DPBS洗涤10 min。洗涤后的PVDF膜用辣根过氧化物酶标记的二抗室温下孵育1.0-2.0 h，再用DPBST洗膜，最后用然后使用ECL法显色，显影仪显影，以β-actin作为内参。测定灰度值，以目的蛋白与β-actin的灰度比值作为其相对表达水平。

主要观察指标：大鼠关节软骨退变情况及退变软骨中Ihh，Gli1及Runx2表达水平。

统计学分析：数据以x(_)±s表示。采用SPSS 13.0统计软件，组间数据比较采用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

全文链接：

讨论

Ihh基因属于刺猬蛋白(hedgehog，hh)家族，在脊椎动物中，Hedgehog基因存在3个亚型，即音速刺猬蛋白(Sonic Hedgehog，Shh)沙漠刺猬蛋白 (desert Hedgehog，Dhh)，和Ihh，其中Ihh在软骨成骨的发生发展中起重要作用^[10]。Ihh由肥大和增生的软骨细胞合成，其通过与靶细胞表面的受体Patch1(Patched-1)结合，使跨膜蛋白Smo (Smoothened)解除抑制状态，活性状态的Smo可激活转录因子Gli，进而诱导下游信号。在胚胎期软骨发育过程中，Ihh能诱导关节软骨膜内细胞合成甲状旁腺相关蛋白，甲状旁腺相关蛋白通过结合增殖区和前肥大区软骨细胞表面受体PPR来抑制该区域软骨细胞肥大分化，从而使软骨细胞处于增殖状态^[6]。同时Ihh也通过非依赖PHhrp的方式调节软骨的分化和增殖。Choi等^[11]在研究中发现，在软骨细胞中，Ihh能引起Lrp(Wnt的共受体) 和Sfrp(Wnt的拮抗剂) 的平行抑制，并可能通过非经典Wnt5a依赖性途径促进软骨肥大。Ihh介导的信号通路在正常人生长发育过程中，促进了软骨的增生及骨化，那是否在骨关节炎的病变过程中也扮演了同样的作用呢？Lin等^[4]发现人膝骨关节炎中Ihh及其下游因子Gli1以及已知骨关节炎相关因子RunX2，MMP-13等均上调，在创伤诱导的大鼠骨关节炎模型中，对Ihh进行特异性抑制或敲除Ihh下游靶基因Smo，可减低大鼠骨关节炎的严重程度。Zhang等^[12]检测了正常人骨关节炎患者早期和晚期关节液中Ihh浓度，发现早期Ihh浓度明显高于正常人及晚期患者，而晚期相较于正常患者仅有轻度升高。因此，阐明大鼠骨关节炎模型不同时期Ihh及其信号因子Gli1的表达情况，对应用此模型进行骨关节炎机制及防治研究具有重要意义。

本次实验对创伤诱导的大鼠膝关节骨关节炎病理改变进行了系统研究，发现该模型能较全面的反应骨关节炎软骨及软骨下骨早中晚期的表现，相比于创伤诱导的兔骨关节炎模型，其操作更为简便，可行整笼多只饲养，减少了兔骨关节炎模型每日驱赶的过程，减少了实验人员的工作量。从病理切片看，造模4周时软骨以粗糙糜烂表现为主，无裂隙形成，12周时镜下可及明显软骨缺损，裂隙形成。基本符合骨关节炎中期及晚期表现，能较好地反映骨关节炎的进展情况，为进一步机制研究提供可靠的病理依据。

Ihh基因及其下游因子是近年来研究较多的几个指标，以往研究已证实，其在胚胎时期软骨形成中起重要作用，并已证实通过阻断Ihh信号可明显改善大鼠模型晚期骨关节炎表现，但对他们在创伤诱导的大鼠骨关节炎模型不同造模时间的软骨内表达研究甚少。本研究中我们发现，Ihh，Gli1在假手术对照组样本中表达很少，在骨关节炎早中期软骨(建模4周大鼠软骨)中表达明显升高，随着造模时间的延长，在骨关节炎中晚期(建模12周大鼠软骨)中表达量却逐渐下降。这与Zhang等^[12]报道的人膝关节骨关节炎样本中检测的结果是一致的。Kim等^[13]用PCR及免疫组化的方法检测大鼠骨关节炎模型中Ihh信号的表达发现，晚期Ihh基因的RNA表达明显下降，而蛋白表达却较对照组有所升高，这也暗示在病变的Ihh基因可能在骨关节炎的早中期大量表达，而晚期表达却明显下降，本次试验发现晚期软骨组织中Ihh蛋白量较对照组仍有明显增高，说明Ihh的作用可能通过在病变软骨组织中沉积的Ihh蛋白一直维持到了骨关节炎进程的中后期。

以往研究表明，Runx2是成骨细胞分化和骨发育的关键基因。在成骨细胞发育、分化和骨形成过程中起着至关

重要的作用。Shimoyama等^[7]研究表明，在促进成骨细胞分化过程中Ihh可通过激活Gli2调控Runx2的表达。在骨关节炎进程中Runx2亦发挥重要作用，Xibin Wang等通过体外实验阻断Runx2证实，Runx2可调控人骨关节炎软骨细胞基质金属蛋白酶13的表达。Zhou等^[14]发现相较于正常小鼠诱导的骨关节炎模型，敲除Ihh基因小鼠只有轻度的骨关节炎变化，X型胶原及基质金属蛋白酶13的表达也明显降低。说明在骨关节炎进程中，Ihh与Runx2可同时影响基质金属蛋白酶13的表达。由此推测，Runx2在损伤诱导的大鼠骨关节炎模型中的表达趋势是否也与Ihh相同。为此，我们同时检测了此模型中期及晚期骨关节炎软骨中Runx2的表达。发现中期Runx2表达明显升高，而晚期亦较中期有所下降。Kamekura等^[5]在损伤诱导的小鼠骨关节炎模型中也得到了相同的结果。这与Ihh的蛋白表达基本一致，但在骨关节炎的发病过程中是否Ihh也通过类似途径调控Runx2，从而调控基质金属蛋白酶13的表达，目前尚无定论^[7-8]。

本次实验表明，在损伤诱导的大鼠骨关节炎骨关节炎模型中，Ihh及其信号因子Gli1以及Runx2在骨关节炎早中期关节软骨中明显高表达，在晚期表达有所下降。其与人骨关节炎中的表达趋势基本一致，适合作为骨关节炎防治研究中的评价指标。同时随着Ihh信号调节剂的不断研究，其对延缓骨关节炎进程的干预已在动物实验中得到肯定，其中环靶明已在人体实验中应用于肿瘤的治疗。可以预见，Ihh及其相关通路的调节剂可能作为骨关节炎治疗的新方法用于临床。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
全文链接：

[1]	黄登承, 王志科, 曹学伟. 体外冲击波疗法治疗中老年膝骨关节炎短期疗效对比的荟萃分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1471-1476.
[2]	彭智浩, 冯宗权, 邹勇根, 牛国庆, 吴峰. 活动平台单髁置换后下肢力线与外侧间室骨关节炎进展的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1368-1374.
[3]	刘翔翔, 黄云梅, 陈文列, 林如辉, 卢小冬, 李钻芳, 许亚晔, 黄美雅, 李西海. 早期骨关节炎模型大鼠半月板白区细胞的超微结构变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1237-1242.
[4]	刘欣, 颜飞华, 洪坤豪. 调控水通道蛋白表达延缓膝骨关节炎模型大鼠软骨退变[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 668-673.
[5]	马泽涛, 曾晖, 王德利, 翁鉴, 冯松. 微小RNA-138-5p与软骨细胞增殖和自噬的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 674-678.
[6]	曹旭含, 白子兴, 孙承颐, 杨艳军, 孙卫东. “乳香-没药”治疗膝骨关节炎网络药理学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 746-753.
[7]	黎永华, 冯强, 谭仁霆, 黄世福, 邱金龙, 尹恒. 杜仲活性成分抗膝骨关节炎滑膜炎病变分子机制的网络药理学阐述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 765-771.
[8]	宋珊, 胡方媛, 乔军, 王佳, 张升校, 李小峰. 基于生物信息学途径认识骨关节炎滑膜的生物学标志物[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 785-790.
[9]	邓桢翰, 黄勇, 肖璐璐, 陈昱霖, 朱伟民, 陆伟, 王大平. 骨形态发生蛋白在关节软骨再生过程中的作用与应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 798-806.
[10]	吕家兴, 白磊鹏, 杨朝昕, 苗岳松, 金宇, 李哲宏, 孙广普, 徐莹, 张擎柱. 膝关节骨性关节炎老年股骨转子间骨折行股骨近端防旋髓内钉内固定评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 391-396.
[11]	郑力, 李大地, 胡维帆, 唐金龙, 赵凤朝. 单侧全膝关节置换后对侧膝关节置换的风险评估[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 374-379.
[12]	罗安玉, 刘瀚霖, 谢小飞, 黄琛. 抗氧化合剂对膝骨关节炎模型大鼠结构性退变的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3625-3629.
[13]	高坤, 陈大宇, 张勇, 刘伟东, 孙淑芬, 赖文强, 马笃军, 吴益宏, 林展鹏, 蒋鹰鹭, 余伟吉. 牛膝醇提物调控滑膜成纤维细胞外泌体抑制软骨细胞外基质降解[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3636-3640.
[14]	刘金富, 曾平, 农焦, 范思奇, 冯程钦, 黄佳兴. 整合多组微阵列芯片分析骨关节炎患者滑膜中生物标志物和治疗靶点[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3690-3696.
[15]	陈锋, 章晓云, 陈跃平, 廖建钊, 李嘉骏, 宋世雷, 赖渝. 淫羊藿苷元治疗骨关节炎分子机制的网络药理学和生物信息学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3704-3710.

前交叉韧带离断骨关节炎大鼠印第安刺猬蛋白以及Runt相关转录因子2的表达

Expression of Indian hedgehog protein and Runt related transcription factor 2 in rats with osteoarthritis caused by anterior cruciate ligament transection

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价