类风湿关节炎模型大鼠滑膜组织中证实有髓样细胞诱发受体2的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.18.004

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (18): 2807-2813.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.18.004

• 器官移植动物模型 organ transplantation and animal model • 上一篇下一篇

类风湿关节炎模型大鼠滑膜组织中证实有髓样细胞诱发受体2的表达

叶培1，李建华2，许锦煌3，黄生辉1，刘贵旺1，张玮琼3，郑沛中3，黄建荣1，3

1中山大学孙逸仙纪念医院骨科，广东省广州市 510120；2广州医科大学生理学教研室，广东省广州市 510182；3增城市人民医院骨科，广东省广州市 511300

收稿日期:2015-03-16 出版日期:2015-04-30 发布日期:2015-04-30
通讯作者: 黄建荣，博士，副教授，硕士生导师，中山大学孙逸仙纪念医院骨科，广东省广州市 510120
作者简介:叶培，男，1987年生，江西省赣州市人，汉族，中山大学孙逸仙纪念医院在读硕士，主要从事关节损伤修复与组织工程学研究。
基金资助:
广东省科技基金(2010B031600184)；广州市科技和信息化局重点项目基金(11C31120789)；广东省自然科学基金(S2012010010629，S2013010013768)

Triggering receptor expressed on myeloid cells 2 in synovial tissue of rheumatoid arthritis rats

Ye Pei1, Li Jian-hua2, Xu Jin-huang3, Huang Sheng-hui1, Liu Gui-wang1, Zhang Wei-qiong3, Zheng Pei-zhong3, Huang Jian-rong1, 3

1Department of Orthopedics, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China; 2Department of Physiology, Gugangzhou Medical University, Guangzhou 510182, Guangdong Province, China; 3Department of Orthopedics, Zengcheng People’s Hospital, Guangzhou 511300, Guangdong Province, China

Received:2015-03-16 Online:2015-04-30 Published:2015-04-30
Contact: Huang Jian-rong, M.D., Associate professor, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China; Department of Orthopedics, Zengcheng People’s Hospital, Guangzhou 511300, Guangdong Province, China
About author:Ye Pei, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
Supported by:
Science and Technology Foundation of Guangdong Province, No. 2010B031600184; Key Program of Science and Technology Bureau of Guangzhou, No. 11C31120789; the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. S2012010010629, S2013010013768

摘要/Abstract

摘要：

背景：髓样细胞诱发受体2在类风湿关节炎活动期患者滑膜组织呈高表达，但其在类风湿关节炎发病机制中发挥的作用，目前并不清楚。
目的：观察髓样细胞诱发受体2在牛源性Ⅱ型胶原诱导的关节炎大鼠模型滑膜组织中的表达。
方法：制备胶原诱导关节炎模型大鼠，动态观察大鼠各项关节炎的活动指标和滑膜组织的病理学改变，RT-PCR法检测滑膜组织中髓样细胞诱发受体2、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素10 mRNA的表达，Western blot及免疫组织化学法分别检测关节滑膜组织中髓样细胞诱发受体2的蛋白表达及定位。
结果与结论：模型组大鼠免疫13 d后出现足爪红肿，关节炎指数评分逐渐升高(P < 0.01)，炎症高峰期在19-25 d，苏木精-伊红染色可见诱导性关节炎大鼠滑膜组织增生及炎性细胞浸润、软骨骨质破坏。与对照组相比，模型组大鼠关节滑膜髓样细胞诱发受体2的mRNA和蛋白的表达、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β mRNA表达均明显升高(P < 0.05或P < 0.01)，白细胞介素10 mRNA表达显著降低(P < 0.05)。结果证实，髓样细胞诱发受体2可能是类风湿关节炎模型大鼠发病过程中一个重要的炎症调节递质，其反应性升高在类风湿关节炎模型大鼠发病中发挥着重要作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

全文链接：

关键词: 实验动物, 骨及关节损伤模型, 髓样细胞诱发受体2, 类风湿关节炎, 胶原性关节炎, 滑膜组织, 炎症, 肿瘤坏死因子α, 白细胞介素1β, 白细胞介素10, 大鼠, 广东省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Triggering receptor expressed on myeloid cells 2 (TREM-2) is highly expressed throughout the synovial tissue in active rheumatoid arthritis patients, but the role of TREM-2 in the pathogenesis of rheumatoid arthritis still remains unclear.
OBJECTIVE: To explore the TREM-2 expression in the synovial tissue of collagen type II-induced arthritis rats.
METHODS: The collagen-induced arthritis models were established in rats. The activity indicators and pathological changes of arthritis synovial were dynamically observed. The mRNA levels of TREM-2, tumor necrosis factor-α, interleukin-1β, and interleukin-10 were detected in synovial tissue of rats by RT-PCR. The protein expression and location of TREM-2 were measured with western blot assay and immunohistochemistry, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: At day 13 after immunization, the paws of model rats appeared red and swelling, the arthritis index scores were increased (P < 0.01). At day 19-25 after immunization, the inflammation reached the peak. Hematoxylin-eosin staining showed that, the synovium of collagen-induced arthritis rats were proliferated and were infiltrated by inflammatory cells, cartilage was destroyed. Compared with the control group, the expression of TREM-2 mRNA and protein, the mRNA levels of tumor necrosis factor-α and interleukin-1β in synovial tissue of the model rats were significantly increased (P < 0.05 or P < 0.01), while interleukin-10 mRNA expression was significantly decreased
(P < 0.05). Experimental findings indicate that, TREM-2 is a crucial inflammatory regulator and the increasing expression of TREM-2 plays an important role in the pathogenesis of collagen-induced arthritis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

全文链接：

Key words: Tissue Engineering, Arthritis, Rheumatoid, Arthritis, Experimental, Synovial Membrane, Cytokines

中图分类号:

R318

叶培，李建华，许锦煌，黄生辉，刘贵旺，张玮琼，郑沛中，黄建荣. 类风湿关节炎模型大鼠滑膜组织中证实有髓样细胞诱发受体2的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(18): 2807-2813.

Ye Pei, Li Jian-hua, Xu Jin-huang, Huang Sheng-hui, Liu Gui-wang, Zhang Wei-qiong, Zheng Pei-zhong, Huang Jian-rong. Triggering receptor expressed on myeloid cells 2 in synovial tissue of rheumatoid arthritis rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(18): 2807-2813.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析纳入25只SD大鼠，模型组15只SD大鼠成模10只，无脱落，最终共20只SD大鼠纳入结果分析。建模流程图见图1。

2.2 诱导性关节炎大鼠模型的鉴定结果对照组大鼠在实验期间未发现四肢足爪红肿，无炎症表现。诱导性关节炎大鼠在初次免疫13 d后，开始出现关节炎体征，19-25 d病变最为严重，包括掌骨和趾骨关节、远端和近端指间关节都出现明显肿胀。免疫4周，大鼠关节炎仍明显，见图2A1-B1。初次免疫后不同时间点实验大鼠关节炎指数评分，见表2。病理切片苏木精-伊红染色显示：模型组大鼠有大量炎性细胞浸润及滑膜组织增生，骨、软骨破坏，关节融合强直，见图2A2-B2。综上表明诱导性关节炎大鼠模型建立成功。

2.3 TREM-2在大鼠膝关节滑膜中mRNA和蛋白的表达差异初次免疫28 d后，RT-PCR结果显示：与对照组相比，模型组大鼠膝关节滑膜组织中TREM-2 mRNA和蛋白表达明显升高(P < 0.01)，见图3A-C。

2.4 TREM-2在大鼠踝关节滑膜中的表达及定位差异初次免疫28 d后，免疫组织化学染色结果显示：对照组TREM-2表达水平极低，诱导性关节炎大鼠模型的TREM-2阳性细胞明显增多(P < 0.01)，多集中在滑膜衬里层及衬里下层滑膜细胞、浸润的炎性细胞以及部分血管内皮细胞，见图3D，E。

2.5 肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β及白细胞介素10 mRNA在大鼠膝关节滑膜组织中的表达差异初次免疫 28 d后，RT-PCR法检测结果显示：与对照组相比，模型组大鼠膝关节滑膜组织中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β mRNA表达明显升高(P < 0.05)，而白细胞介素10 mRNA水平明显降低(P < 0.05)，见图4。

参考文献

[1] Vivar N, Van Vollenhoven RF. Advances in the treatment of rheumatoid arthritis. F1000Prime Rep. 2014;6:31.
[2] 莫选荣,罗心静.类风湿性关节炎发病机制的研究进展[J].医学临床研究,2007;(2):336-340.
[3] Kasperkovitz PV, Timmer TC, Smeets TJ, et al. Fibroblast-like synoviocytes derived from patients with rheumatoid arthritis show the imprint of synovial tissue heterogeneity: evidence of a link between an increased myofibroblast-like phenotype and high-inflammation synovitis. Arthritis Rheum. 2005;52(2): 430-441.
[4] 谢庆云,魏萌,张波,等.外周血炎性细胞因子与类风湿关节炎[J].中国组织工程研究,2012(42):7945-7950.
[5] Bouchon A, Dietrich J, Colonna M. Cutting edge: inflammatory responses can be triggered by TREM-1, a novel receptor expressed on neutrophils and monocytes. J Immunol. 2000;164(10):4991-4995.
[6] Ito H, Hamerman JA. TREM-2, triggering receptor expressed on myeloid cell-2, negatively regulates TLR responses in dendritic cells. Eur J Immunol. 2012;42(1):176-185.
[7] Gao X, Dong Y, Liu Z, et al. Silencing of triggering receptor expressed on myeloid cells-2 enhances the inflammatory responses of alveolar macrophages to lipopolysaccharide. Mol Med Rep. 2013;7(3):921-926.
[8] Chen Q, Zhang K, Jin Y, et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance. Am J Respir Crit Care Med. 2013;188(2):201-212.
[9] Kleinberger G, Yamanishi Y, Suarez-Calvet M, et al. TREM2 mutations implicated in neurodegeneration impair cell surface transport and phagocytosis. Sci Transl Med. 2014;6(243): 243r-286r.
[10] Crotti TN, Dharmapatni AA, Alias E, et al. The immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) -related factors are increased in synovial tissue and vasculature of rheumatoid arthritic joints. Arthritis Res Ther. 2012;14(6):R245.
[11] Trentham DE, Townes AS, Kang AH. Autoimmunity to type II collagen an experimental model of arthritis. J Exp Med. 1977; 146(3):857-868.
[12] 陈欢雪,王晓非.间充质干细胞移植治疗4种风湿性疾病:10年资料分析[J].中国组织工程研究,2014,(14):2263-2268.
[13] Kaur K, Kalra S, Kaushal S. Systematic review of tofacitinib: a new drug for the management of rheumatoid arthritis. Clin Ther. 2014;36(7):1074-1086.
[14] Feldmann M, Brennan FM, Maini RN. Rheumatoid arthritis. Cell. 1996;85(3):307-310.
[15] Noss EH, Brenner MB. The role and therapeutic implications of fibroblast-like synoviocytes in inflammation and cartilage erosion in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 2008;223: 252-270.
[16] 杨慧君,钱玉中,杨继章,等.胶原性关节炎大鼠滑膜组织细胞因子基质金属蛋白酶3和组织金属蛋白酶抑制剂1表达的变化[J].中国组织工程研究与临床康复,2007(32):6402-6405.
[17] McInnes IB, Schett G. Cytokines in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Nat Rev Immunol. 2007;7(6):429-442.
[18] Pap T, Meinecke I, Muller-Ladner U, et al. Are fibroblasts involved in joint destruction? Ann Rheum Dis. 2005;64 Suppl 4:v52-v54.
[19] Bartok B, Firestein GS. Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 2010; 233(1):233-255.
[20] Yoshida K, Hashimoto T, Sakai Y, et al. Involvement of the circadian rhythm and inflammatory cytokines in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. J Immunol Res. 2014; 2014:282495.
[21] 侯春凤,孙闵,李树杰,等.小干扰RNA对人类风湿关节炎患者滑膜细胞基因表达的影响[J].中国组织工程研究,2013,(46):8062- 8068.
[22] 燕鹏.肿瘤坏死因子-α抑制剂(益赛普)治疗类风湿关节炎的meta分析[D].济南:山东大学,2008.
[23] 刘彧,韩星海,孟济明.生物制剂在类风湿关节炎治疗中的应用[J].中华风湿病学杂志,2003(05):300-302.
[24] Augello A, Tasso R, Negrini SM, et al. Cell therapy using allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells prevents tissue damage in collagen-induced arthritis. Arthritis Rheum. 2007;56(4):1175-1186.
[25] Sharif O, Knapp S. From expression to signaling: roles of TREM-1 and TREM-2 in innate immunity and bacterial infection. Immunobiology. 2008;213(9-10):701-713.
[26] N'Diaye EN, Branda CS, Branda SS, et al. TREM-2 (triggering receptor expressed on myeloid cells 2) is a phagocytic receptor for bacteria. J Cell Biol. 2009;184(2):215-223.
[27] Rajagopalan P, Hibar DP, Thompson PM. TREM2 and neurodegenerative disease. N Engl J Med. 2013;369(16): 1565-1567.
[28] Sun M, Zhu M, Chen K, et al. TREM-2 promotes host resistance against Pseudomonas aeruginosa infection by suppressing corneal inflammation via a PI3K/Akt signaling pathway. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2013;54(5):3451-3462.
[29] Turnbull IR, Gilfillan S, Cella M, et al. Cutting edge: TREM-2 attenuates macrophage activation. J Immunol. 2006;177(6): 3520-3524.
[30] Ford J W, McVicar D W. TREM and TREM-like receptors in inflammation and disease. Curr Opin Immunol. 2009;21(1): 38-46.
[31] Suchankova M, Bucova M, Tibenska E, et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-1 and 2 in bronchoalveolar lavage fluid in pulmonary sarcoidosis. Respirology. 2013;18(3):455-462.
[32] Piccio L, Buonsanti C, Mariani M, et al. Blockade of TREM-2 exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis. Eur J Immunol. 2007;37(5):1290-1301.
[33] Oh JH, Yang MJ, Heo JD, et al. Inflammatory response in rat lungs with recurrent exposure to welding fumes: a transcriptomic approach. Toxicol Ind Health. 2012;28(3): 203-215.
[34] 秦涛.TREM-1、TREM-2在非酒精性脂肪性肝炎时肝组织表达的研究[D].太原:山西医科大学,2012.
[35] 沈茜.TREM-2在非小细胞肺癌中的表达及意义[D].杭州:浙江大学,2009.
[36] Paradowska-Gorycka A, Jurkowska M. Structure, expression pattern and biological activity of molecular complex TREM-2/DAP12. Hum Immunol. 2013;74(6):730-737.
[37] Sun GY, Guan CX, Zhou Y, et al. Vasoactive intestinal peptide re-balances TREM-1/TREM-2 ratio in acute lung injury. Regul Pept. 2011;167(1):56-64.
[38] Humphrey MB, Daws MR, Spusta SC, et al. TREM2, a DAP12-associated receptor, regulates osteoclast differentiation and function. J Bone Miner Res. 2006;21(2): 237-245.
[39] Colonna M, Turnbull I, Klesney-Tait J. The enigmatic function of TREM-2 in osteoclastogenesis. Adv Exp Med Biol. 2007;602:97-105.
[40] Otero K, Shinohara M, Zhao H, et al. TREM2 and beta-catenin regulate bone homeostasis by controlling the rate of osteoclastogenesis. J Immunol. 2012;188(6): 2612-2621.
[41] 李淑芬.TREM-2对小鼠成纤维细胞增殖与凋亡的影响及VIP的调控[D].长沙:中南大学,2012.
[42] Park M, Yi JW, Kim EM, et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells 2 (TREM2) promotes adipogenesis and diet-induced obesity. Diabetes. 2015;64(1):117-127.
[43] Lis K, Kuzawińska O, Ba?kowiec-Iskra E. Tumor necrosis factor inhibitors - state of knowledge. Arch Med Sci. 2014; 10(6):1175-1185.
[44] Wang Y, Wang S, Li Y, et al. Therapeutic effect of Cryptotanshinone on collagen-induced arthritis in rats via inhibiting nuclear factor kappa B signaling pathway. Transl Res. 2014. doi: 10.1016/j.trsl.2014.12.004.
[45] Goedken ER, Argiriadi MA, Banach DL, et al. Tricyclic Covalent Inhibitors Selectively Target Jak3 through an Active Site Thiol. J Biol Chem. 2015;290(8):4573-4589.
[46] Xu CP, Li X, Hu YJ, et al. Quantitative proteomics reveals ELP2 as a regulator to the inhibitory effect of TNF-α on osteoblast differentiation. J Proteomics. 2015;114:234-2346.
[47] Meier FM, McInnes IB. Small-molecule therapeutics in rheumatoid arthritis: scientific rationale, efficacy and safety. Best Pract Res Clin Rheumatol. 2014;28(4):605-624.
[48] Klein K, Kabala PA, Grabiec AM, et al. The bromodomain protein inhibitor I-BET151 suppresses expression of inflammatory genes and matrix degrading enzymes in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Ann Rheum Dis. 2014. doi: 10.1136/annrheumdis-2014-205809.
[49] Damento G, Kavoussi SC, Materin MA, et al. Clinical and histologic findings in patients with uveal melanomas after taking tumor necrosis factor-α inhibitors. Mayo Clin Proc. 2014;89(11):1481-1486.
[50] Liu Q, Zhao J, Tan R, et al. Parthenolide inhibits pro-inflammatory cytokine production and exhibits protective effects on progression of collagen-induced arthritis in a rat model. Scand J Rheumatol. 2014:1-10.
[51] Fuggle NR, Howe FA, Allen RL, et al. New insights into the impact of neuro-inflammation in rheumatoid arthritis. Front Neurosci. 2014;8:357.
[52] Zanin-Zhorov A, Weiss JM, Nyuydzefe MS, et al. Selective oral ROCK2 inhibitor down-regulates IL-21 and IL-17 secretion in human T cells via STAT3-dependent mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111(47):16814-16819.
[53] Wadström H, Eriksson JK, Neovius M, et al. How good is the coverage and how accurate are exposure data in the Swedish Biologics Register (ARTIS)? Scand J Rheumatol. 2015;44(1): 22-28.
[54] Zheng Y, Hou J, Peng L, et al. The pro-apoptotic and pro-inflammatory effects of calprotectin on human periodontal ligament cells. PLoS One. 2014;9(10):e110421

引言

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种首先以关节滑膜受累为主要表现的慢性自身免疫性疾病，自身免疫耐受丧失被认为主要的的发病机制，但大量研究证实，在类风湿关节炎患者的滑膜液和滑膜组织，出现异常增多的免疫细胞包括T细胞、B细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等，免疫分子包括细胞因子、自身抗体和热休克蛋白等，这些物质释放或活化最终导致滑膜细胞过增殖^[1-2]。滑膜细胞的功能异常在关节炎症及组织破坏过程中发挥着关键作用，类风湿关节炎滑膜组织通过自分泌或旁分泌的方式产生大量的细胞因子如：肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素10等，它们是引起炎症免疫、蛋白质水解、细胞募集和增殖的重要媒介，滑膜细胞被认为是类风湿关节炎关节软骨及骨侵蚀过程中的主要参与者^[3-4]。

髓样细胞诱发受体2(triggering receptors expressed on myeloid cells-2，TREM-2)是2000年发现的免疫模式识别受体^[5]。近年来TREM-2作为一种重要的负性炎症调节递质受到了越来越多的学者关注。有研究发现TREM-2在树突状细胞负性调控TLR介导的信号通路^[6]。Gao等^[7]采用干扰沉默技术，证实TREM-2能下调致炎因子的产生及分泌。Chen等^[8]发现TREM-2在脓毒血症患者及小鼠脓毒血症模型中表达明显上调，通过抗体交联阻断TREM-2明显增加脓毒血症小鼠死亡率。

大量的人类基因组测序揭示TREM-2基因突变与多种神经退行性疾病密切相关，TREM-2的转录调控则有可能参与神经退行性疾病的发病机制^[9]。有报道通过免疫组织化学法检测到类风湿关节炎活动期患者关节滑膜中TREM-2高表达^[10]，然而TREM-2在类风湿关节炎发病中的作用目前并不清楚。

实验拟构建胶原诱导关节炎大鼠模型，首次检测胶原诱导关节炎大鼠关节滑膜TREM-2 mRNA和蛋白水平的表达及定位，细胞因子改变情况，以期为研究类风湿关节炎发病机制提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
全文链接：

材料方法

设计：随机对照动物模型实验。

时间及地点：于2013年4月至2014年9月在广州医科大学实验动物中心完成。

材料：

实验动物：SPF级雄性三四周龄SD大鼠25只，体质量为100-120 g，由中山大学实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK(粤)2011-0029。

胶原诱导关节炎大鼠模型构建实验相关试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
牛源性Ⅱ型胶原蛋白、弗氏完全佐剂	美国Chrondex公司
TREM-2一抗	美国Satan Cruz公司
GAPDH一抗	美国Bioworld公司
BCA蛋白定量试剂盒	南京凯基生物公司
ECL化学发光试剂盒	美国Bio-Rad公司
Trizol	美国Invitrogen公司
RT-RCR试剂盒、DNA Marker	大连宝成生物科技公司
PVDF膜	美国Millipore 公司
DAB显色试剂盒、山羊血清封闭液、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔抗体	武汉博士德生物公司
PCR引物合成	上海英潍捷基公司
凝胶成像系统	美国基因公司
倒置相差显微镜	日本Nikon公司

实验方法：

实验分组及胶原诱导关节炎大鼠模型构建：将25只SD大鼠适应性饲养1周后，随机分为2组：对照组10只，模型组15只。将牛源性Ⅱ胶原(2 g/L)与等体积完全弗氏佐剂 (10 g/L)充分乳化，用体积分数为1%的戊巴比妥钠麻醉大鼠后，于背部、脊柱两侧及尾根部皮下分点注射乳化液0.5 mL，加强免疫于建模1周后在同样部位注射0.5 mL，诱导胶原诱导关节炎模型；对照组相同部位注射等体积的生理盐水^[11]。

表1 RT-PCR引物序列

Table 1 Primers used for RT-PCR

基因	序列(5'-3')	片段长度
TREM-2	TCC TGT TGC TGG TCA CAG AG	220 bp
	CTC CCA TTC TGC TTC CTC AG
肿瘤坏死因子α	CCA CGT CGT AGC AAA CCA CCA AG	319 bp
	CAG GTA CAT GGG CTC ATA CC
白细胞介素1β	CTG TGA CTC GTG GGA TGA TG	210 bp
	GGG ATT TTG TCG TTG CTT GT
白细胞介素10	CCT GCT CTT ACT GGC TGG AG	350 bp
	TGT CCA GCT GGT CCT TCT TT
β-actin	GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA	150 bp
	GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG

胶原诱导关节炎大鼠临床表现及关节炎指数评分：从初次免疫第7天，观察大鼠体毛色泽、活动状态、体质量，并根据关节肿胀、及关节活动情况来评价，记录大鼠关节病变的严重程度。

关节炎指数按5级评分法进行评分，0分：无关节炎症(无红肿)；1分：小趾关节红肿；2分：趾关节和足趾关节红肿；3分：踝关节以下的足爪红肿；4分：包括踝关节在内的全部足爪红肿。初次免疫后7 d起，每隔7 d评分1次，每只大鼠的关节炎指数为4个肢体关节炎指数之和，总分为0-16分。关节指数评分≥4分，大鼠趾端至踝关节段出现发红肿胀，表示建模成功。

致炎后第28天取大鼠踝关节，10%EDTA溶液脱钙，脱水、石蜡包埋切片进行苏木精-伊红染色，建模成功的大鼠显微镜下观察踝关节滑膜细胞增殖、关节间隙狭窄、骨软骨侵蚀、关节畸形。

RT-PCR法检测膝关节滑膜组织中TREM-2，肿瘤坏死因子α，白细胞介素1β及白细胞介素10的mRNA表达：初次免疫28 d后，取膝关节滑膜组织100 mg，加Trizol 1 mL。按照RT-PCR试剂盒提供的方法，将RNA反转录为cDNA，PCR扩增。PCR引物序列由英潍捷基(上海公司)合成，见表1。

反应参数：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，进行35个循环；循环结束后 72 ℃再延伸5 min。取PCR产物5 μL在2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍摄，并用Image J软件计算产物条带灰度与内参灰度的比值。
Western blot检测膝关节滑膜组织中TREM-2的蛋白表达：初次免疫28 d后，取出冻存的滑膜组织在裂解液中裂解，冰浴下超声匀浆，100 ℃煮10 min，4 ℃离心 (12 000×g，5 min)，取上清液，BCA法测定蛋白浓度，取30 μg蛋白样品电泳，转膜、封闭后分别孵TREM-2一抗 (1∶250)、GAPDH一抗(1∶10 000)，4 ℃孵育过夜，洗膜孵HRP二抗、室温孵育1 h，ECL显色，凝胶成像系统曝光成像后，用Image J软件对条带进行吸光度分析，以各目的基因与β-actin的吸光度之比为其相对表达量。

免疫组织化学法检测踝关节滑膜组织中TREM-2的表达及定位：初次免疫28 d后，踝关节滑膜组织石蜡切片经脱蜡水化后，体积分数3%过氧化氢-甲醇溶液室温孵育10 min，PBS洗5 min，共3次，山羊血清室温封闭20 min。弃去血清，加入1∶100稀释的TREM-2一抗，4 ℃孵育过夜，孵山羊抗兔(二抗)，室温孵育1 h，PBS洗5 min，共3次，加入DAB显色液显色3 min，水冲洗，苏木精复染，常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，光镜下观察并拍照。免疫组织化学法染色显示细胞质、细胞核内出现棕黄色颗粒状物质的细胞为染色阳性细胞。在同一光强度下，200倍光学显微镜随机选取5个视野拍照，应用Image-pro Plus6.0图像分析系统检测TREM-2蛋白的平均积分吸光度值，反映TREM-2蛋白表达的变化。

主要观察指标：各组大鼠关节炎评分、关节病理形态学改变，炎症因子改变，TREM-2表达差异。

统计学分析：计量资料用x(_)±s表示，采用SPSS 20.0软件进行数据分析，两组计量数据的比较符合正态分布则采用两样本t 检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

全文链接：

讨论

类风湿关节炎是一个严重的全球性健康问题，全球发病率约为1%，中国为0.32%-0.34%，但由于中国人口基数大，现已有500万的类风湿关节炎患者。当前国内外应用的药物，生物制剂等^[12]，只能缓解疼痛、减轻或延缓炎症的进展，尚不能完全控制关节破坏。因而，研究类风湿关节炎发病机制，探寻类风湿关节炎发病机制中新的作用靶点，并采取有效干预措施，成为类风湿关节炎治疗亟待解决的问题^[13]。

类风湿关节炎是一种以关节滑膜炎为主要病变的自身免疫系统疾病。类风湿关节炎的滑膜病变具有肿瘤样生长的特点，表现为滑膜增生肥厚、血管翳形成对关节周围的组织产生侵蚀和破坏。类风湿关节炎主要在关节滑膜衬里层发生免疫反应，构成滑膜衬里层主要有两大类^[14]：滑膜巨噬细胞(Macrophage synovoicytes，MLS)以及滑膜成纤样细胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS)。在类风湿关节炎中，关节滑膜组织及血清中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1，4，6，8，10各种趋化因子、转化生长因子β，干扰素γ、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)以及关节降解产物等激活成纤维样细胞^[15-17]。活化的成纤维样细胞具有类似肿瘤样细胞增殖及侵袭的特点，在毒性物质环境下急剧增殖，从而导致滑膜组织的厚度从正常的一两层细胞厚度增生致10-20层细胞厚度^[18-19]。这些细胞因子的改变在介导类风湿关节炎发病、滑膜炎症反应、骨软骨破坏中发挥着关键性的作用^[20]。通过RNA干扰技术可阻断核转录因子κB信号通路，有效抑制滑膜炎症及过度增殖^[21]。目前肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β及白细胞介素6抑制剂已经用于临床治疗，如：肿瘤坏死因子α抑制剂(益赛普)能显著改善患者的临床症状，提高生活质量^[22-23]。Augello等^[24]移植骨髓来源的间充质干细胞可延缓诱导性关节炎小鼠软骨的病变进展，间充质干细胞可抑制T细胞的增殖和调节炎性细胞(干扰素γ、白细胞介素4，白细胞介素10)表达水平。实验观测到初次免疫13 d后，模型组开始出现关节红肿，建模后19-25 d最为严重，从关节炎指数、踝关节病理评价诱导性关节炎大鼠，与人类的类风湿关节炎关节病理极其相似，同时也观察到伴随着炎性细胞因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β等表达上调，抗炎因子白细胞介素10表达下调，这些指标的变化与人类风湿关节炎病理改变类似。

TREM-2作为一种新近发现的免疫模式受体，广泛表达于巨噬细胞、树突状细胞、小胶质细胞和破骨细胞等^[25-26]。TREM-2可参与多种疾病的病理过程，TREM-2基因突变与Nasu-Hakola病、阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩性侧索硬化症等发病密切相关^[9^，^27]。TREM-2是一种重要的炎症调节因子，到目前为止，TREM-2天然配体仍未找到。TREM-2的蛋白结构包括含有30个氨基酸的胞质区，154个氨基酸的胞外区，33个氨基酸的跨膜区和含13个氨基酸的信号肽^[5]。

研究显示TREM-2负性调节炎症因子分泌的机制可能是与其配体结合后与DNA活化蛋白12偶联，并通过DNA活化蛋白12胞质区中的免疫受体酪氨酸激活基序传递活化信号，当免疫受体酪氨酸激活基序中的酪氨酸磷酸化后与ZAP70和SYK结合，由此促进生长因子受体结合蛋白-2等磷酸化，继而分别激活PI3K，PLCγ以及ERK信号转导途径，引起细胞内Ca²⁺的改变，最终抑制细胞分泌促炎因子^[28-29]。

目前研究得出，TREM-2在不同组织细胞中参与多种功能调控。在败血症患者腹水、肺结节病患者肺泡灌洗液、多发性硬化症小鼠模型脊髓浸润的巨噬细胞、实验性自身免疫性脑脊髓炎脑组织小胶质细胞均检测到TREM-2明显升高^[8^，^30-33]。秦涛等^[34]研究非酒精性脂肪肝肝脏发现TREM-2随着脂肪肝严重程度的加重而降低。沈茜等^[35]在小细胞肺癌研究得出，非小细胞肺癌患者肺癌组织和癌旁组织中TREM-2的表达高于正常肺组织，提示TREM-2可能参与肿瘤发生的免疫应答过程。然而TREM-2在不同类型的细胞中可以表现出不同的生物学功能^[6^，^36-37]：在巨噬细胞中，TREM-2可抑制TLR信号通路，减少炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素6的产生，促进巨噬细胞分化及溶解，参与组织修复；在树突状细胞，TREM-2能促进其成熟，负性调节Toll样受体信号通路；在小胶质细胞，TREM-2增强其吞噬能力及调节炎症，减少肿瘤坏死因子α的表达，参与组织修复；在破骨细胞，TREM-2增强破骨能力促进其分化，参与骨重塑和吸收等^[38-40]；在成纤维细胞^[41]，TREM-2促进小鼠成纤维细胞增殖，抑制其凋亡。最近Park等^[42]研究TREM-2在脂肪生成以及对肥胖的影响，发现高脂肪饮食喂养TREM-2转基因小鼠表现脂肪细胞肥大，葡糖糖和胰岛素抵抗和肝脂肪细胞变形。

实验首先成功建立了诱导性关节炎大鼠模型，发现诱导性关节炎大鼠模型中滑膜组织TREM-2 mRNA及蛋白表达水平显著性升高，肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β mRNA表达升高，而抑炎因子白细胞介素10 mRNA表达下调。以上研究表明，在诱导性关节炎病理过程中，多种细胞因子参与其病理改变，TREM-2可能负性调控其炎症因子的分泌，减轻关节滑膜炎症作用。至于TREM-2分子及信号通路参与类风湿关节炎的明确机制，实验将进一步探讨。细胞因子抑制剂在类风湿关节炎临床治疗中取得的良好进展^[43-54]，因此研究负性调控炎症递质分泌的因子及信号通路具有十分重要意义，有助于研发治疗类风湿关节炎更有效的新方法。

类风湿关节炎模型大鼠滑膜组织中证实有髓样细胞诱发受体2的表达

Triggering receptor expressed on myeloid cells 2 in synovial tissue of rheumatoid arthritis rats

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	顾霞, 赵敏, 王平义, 李一梅, 李文华. 低氧诱导因子1α与低氧相关疾病信号通路的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1284-1289.
[2]	曾祯, 胡经纬, 李璇, 唐琳梅, 黄志强, 李明星. 超声造影定量分析重度失血性休克再灌注模型大鼠复苏期的肾血流灌注[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1201-1206.
[3]	唐辉, 姚志浩, 罗道文, 彭双麟, 杨双林, 王浪, 肖金刚. 高脂高糖饮食结合链脲佐菌素建立2型糖尿病性骨质疏松症大鼠模型[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1207-1211.
[4]	柴乐, 吕建兰, 胡劲涛, 胡华辉, 许庆军, 余进伟, 全仁夫. 诱导急性脊髓损伤模型大鼠炎症反应信号通路的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1218-1223.
[5]	耿秋东, 葛海雅, 王和鸣, 李楠. 基于网络药理学探讨龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1229-1236.
[6]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[7]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[8]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.
[9]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[10]	段丽芸, 曹晓沧. 人胎盘间充质干细胞来源细胞外囊泡调节肠炎小鼠肠黏膜胶原的沉积[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1026-1031.
[11]	邹刚, 徐志, 刘子铭, 李豫皖, 杨继滨, 金瑛, 张骏, 葛振, 刘毅. 人脱细胞羊膜支架促进Scleraxis修饰人羊膜间充质干细胞体外成韧带分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1037-1044.
[12]	杨洋, 姚羽, 沈孝天, 刘佳佳, 薛建华. 退变腰椎间盘中白细胞介素21的表达及意义[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 690-694.
[13]	马斌祥, 何万庆, 周广超, 关永林. 雷公藤内酯醇改善大鼠脊髓损伤后的运动障碍[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 701-706.
[14]	刘青, 万碧江. 针刀治疗胶原诱导性关节炎大鼠滑膜组织Bcl-2/Bax的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 729-734.
[15]	黎永华, 冯强, 谭仁霆, 黄世福, 邱金龙, 尹恒. 杜仲活性成分抗膝骨关节炎滑膜炎病变分子机制的网络药理学阐述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 765-771.